活细胞成像结合延时摄影研究表皮角质形成细胞增殖动力学

摘要

本文提供了一种活细胞成像分析方法，可用于手动追踪第0代角质形成细胞的谱系，并能够收集增殖相关指标，包括细胞分裂命运和细胞周期持续时间。

摘要

活细胞成像是一种不断发展且具有一定挑战性的方法，用于在体外研究角质形成细胞的行为。in vitro。传统上，角质形成细胞分裂行为的研究依赖于克隆分析、免疫染色和细胞周期分析等方法。然而，这些方法均无法实现实时、单细胞水平的角质形成细胞行为分析。在过去十年中，多个研究团队已利用活细胞成像技术，在无需标记的情况下鉴定出角质形成干细胞及其定向祖细胞。研究人员已在不同细胞群体中观察到其分裂行为、终末分化速率以及细胞周期持续时间的差异。本文介绍了一种结合延时摄影与图像分析的角质形成细胞活细胞成像方法。建议采用未经传代的角质形成细胞进行该实验，以最大程度地模拟体内in vivo行为。活细胞成像技术能够独特地在单细胞水平上研究干细胞和定向祖细胞的行为，并确定其分裂命运、细胞周期持续时间以及其他增殖相关指标。

引言

可视化细胞群体的能力 体外 实时观察细胞在长时间内的扩增过程是活细胞成像的独特优势。活细胞成像可实现对单个细胞的运动性、迁移和增殖行为的评估。本实验方案的目标是通过延时摄影优化角质形成细胞培养的可视化效果，生成可用于手动追踪的视频，从而获得关于细胞行为的精细数据。

我们的研究重点是增殖动力学。通过分析活细胞成像视频，可以构建出细胞谱系树，并评估细胞分裂间隔时间（作为细胞周期持续时间的指标），以及子代细胞继续分裂与分化比例的情况。

在处理原代角质形成细胞时，存在显著的供体间变异性和频繁的细胞扩增失败情况。因此，许多研究者倾向于使用增殖能力较强的角质形成细胞，例如 HaCaT 细胞或新生儿角质形成细胞，这些细胞通常已在体外经过多次传代。¹. 从成年或老年皮肤中分离培养原代角质形成细胞用于谱系示踪具有挑战性。然而，使用细胞系或包皮来源的传代细胞也存在一些问题。反复传代会导致细胞与其原始状态存在显著差异 体内 状态²此外，多项检测结果表明，HaCaT细胞与原代角质形成细胞的反应存在差异。^3,4,5. 为利....

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行。所有人体组织均在获得加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）机构审查委员会（IRB）批准后获取，并对所用组织均取得了知情同意。

0 代人角质形成细胞的延时摄影

注意：本实验方案仅适用于 IncuCyte S3 和 SX5。

1. 确保已获得机构人类研究委员会的适当批准，以在研究中使用人体组织。
2. 按照先前所述方法从新鲜皮肤中分离角质形成细胞⁹。
3. 确定实验所需的接种密度。使用来自不同供体的样本进行多个稀释梯度的预实验，以明确所需细胞密度，确保有足够数量的克隆用于研究，同时避免在观察期间因克隆过度生长而导致重叠。这些预实验应在完全相同的实验条件下（相同的培养板、试剂等）进行，因为这些因素可能影响实验结果。
   注意：接种密度过低会导致生长不足，而密度过高则会因细胞过于密集而难以准确追踪单个细胞。
   1. 对于采集后48小时内、在4 °C保存于采集培养基中的新生儿包皮组织来源的第0代（P0）角质形成细胞，接种密度应为1000–5000个细胞/cm²；对于第1代（P1）角质形成细胞，使用500–2000个细胞/cm²。代数越高，接种密度应越低。
4. 将细胞接....

结果

原代角质形成细胞以一种可预测的方式生长，可通过活细胞成像进行追踪。使用VLC媒体播放器查看录像记录。首次分裂所需时间具有变异性，可能持续数天，具体取决于供体的特征，例如年龄、健康状况或体外环境中存在的生长因子。in vitro 环境中，接种初期角质形成细胞呈体积较小、圆形的形态（图1）。接种后，具有克隆形成能力的角质形成细胞通常会变得扁平（图1）。这些扁平化的角质形成细胞通常比不分裂的细胞更具迁移能力（补充视频1）。在即将分裂前，扁平的角质形成细胞会表现出中央区域的凝聚现象（图1）。

除最初的分裂外，95%即将分裂（增殖型 - P）的角质形成细胞会在上一次分裂后的48小时内进行分裂⁶。未能在此时间内分裂的细胞被视为终末分化细胞（D）（图1）

讨论

活细胞成像是一种无需标记即可追踪干细胞和定向祖细胞分裂行为的角质形成细胞研究方法。鉴于表皮的稳态维持依赖于干细胞和定向祖细胞的增殖动力学¹⁰，深入理解这些角质形成细胞群体的变化及其在不同条件下的受影响情况，有助于开发相应的治疗策略，以改善所发现的功能缺陷。

最终，通过活细胞成像进行谱系示踪依赖于获得可用的数据。在延时摄影生成的视频中，必须能够清晰地观察到克隆形成单位。使用新分离的第0代细胞时，很难达到真正的单克隆密度。仅有3%–4%的接种角质形成细胞最终能够形成克隆¹¹。 细胞密度过高可能使细胞分裂无法追踪，甚至难以识别最初的克隆形成细胞；而密度过低，则可能导致克隆无法形成。同样，任何遮挡视野的因素都会使基于谱系示踪的细胞追踪无法实现。使用成纤维细胞饲养层可能会影响分裂过程的追踪，因为成纤维细胞会遮蔽视野。此外，沉淀物、细胞碎片，甚至培养板盖上的冷凝水珠，都可能遮挡正在生长的克隆。即使是一些看似微小的疏忽，例如未确保微孔板牢固插入指定的卡槽中，也可能导致实验失败，因为图像将无法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔Imagelock板	Sartorius	BA-04856	若使用96孔板，建议选用与仪器兼容的微孔板。
24孔板	Corning	3524	若使用24孔板，建议选用与仪器兼容的微孔板。
两性霉素B，50 mL	Corning	30-003-CF	稀释至5倍浓度（原液为100倍浓缩液），用于配制5倍浓缩的PSA，换液时使用1倍浓度
Epilife培养基，50 mL	Gibco	MEP1500CA	添加S7补充剂，可考虑加入Primocin
IncuCyte S3	Sartorius	4637	成像仪（Zoom/SX5为可接受的替代型号）
青霉素/链霉素，100 mL	Corning	30-002-Cl	稀释至5倍浓度（原液为100倍浓缩液）
Primocin	Invivogen	ant-pm-05	每500 mL培养基中加入1 mL
S7补充剂	Gibco	S0175	添加至Epilife培养基中