本文提供了一种活细胞成像分析方法，可用于手动追踪第0代角质形成细胞的谱系，并能够收集增殖相关指标，包括细胞分裂命运和细胞周期持续时间。
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本文内容
摘要
摘要
活细胞成像是一种不断发展且具有一定挑战性的方法，用于在体外研究角质形成细胞的行为。in vitro。传统上，角质形成细胞分裂行为的研究依赖于克隆分析、免疫染色和细胞周期分析等方法。然而，这些方法均无法实现实时、单细胞水平的角质形成细胞行为分析。在过去十年中，多个研究团队已利用活细胞成像技术，在无需标记的情况下鉴定出角质形成干细胞及其定向祖细胞。研究人员已在不同细胞群体中观察到其分裂行为、终末分化速率以及细胞周期持续时间的差异。本文介绍了一种结合延时摄影与图像分析的角质形成细胞活细胞成像方法。建议采用未经传代的角质形成细胞进行该实验，以最大程度地模拟体内in vivo行为。活细胞成像技术能够独特地在单细胞水平上研究干细胞和定向祖细胞的行为，并确定其分裂命运、细胞周期持续时间以及其他增殖相关指标。
引言
可视化细胞群体的能力 体外 实时观察细胞在长时间内的扩增过程是活细胞成像的独特优势。活细胞成像可实现对单个细胞的运动性、迁移和增殖行为的评估。本实验方案的目标是通过延时摄影优化角质形成细胞培养的可视化效果，生成可用于手动追踪的视频，从而获得关于细胞行为的精细数据。
我们的研究重点是增殖动力学。通过分析活细胞成像视频，可以构建出细胞谱系树，并评估细胞分裂间隔时间（作为细胞周期持续时间的指标），以及子代细胞继续分裂与分化比例的情况。
在处理原代角质形成细胞时，存在显著的供体间变异性和频繁的细胞扩增失败情况。因此，许多研究者倾向于使用增殖能力较强的角质形成细胞，例如 HaCaT 细胞或新生儿角质形成细胞，这些细胞通常已在体外经过多次传代。1. 从成年或老年皮肤中分离培养原代角质形成细胞用于谱系示踪具有挑战性。然而，使用细胞系或包皮来源的传代细胞也存在一些问题。反复传代会导致细胞与其原始状态存在显著差异 体内 状态2此外，多项检测结果表明，HaCaT细胞与原代角质形成细胞的反应存在差异。3,4,5. 为利用最接近其天然状态的细胞 体内 对应地，使用来自成人人类供体的第0代角质形成细胞。角质形成细胞干细胞与定向祖细胞在行为上存在显著差异，可通过活细胞成像区分来自这两类细胞群体的克隆。6. 这种长期观察单个角质形成细胞行为的相对较新的能力，此前仅有少数研究采用类似技术加以利用。6,7,8本方案概述了利用IncuCyte S3活细胞分析系统对原代角质形成细胞进行活细胞成像的方法。通过构建谱系树，可确定克隆类型（干细胞型与定向祖细胞型）、细胞周期持续时间以及分化分裂所占比例。
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方案
本研究遵循赫尔辛基宣言进行。所有人体组织均在获得加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）机构审查委员会（IRB）批准后获取，并对所用组织均取得了知情同意。
0 代人角质形成细胞的延时摄影
注意：本实验方案仅适用于 IncuCyte S3 和 SX5。
- 确保已获得机构人类研究委员会的适当批准，以在研究中使用人体组织。
- 按照先前所述方法从新鲜皮肤中分离角质形成细胞9。
- 确定实验所需的接种密度。使用来自不同供体的样本进行多个稀释梯度的预实验，以明确所需细胞密度，确保有足够数量的克隆用于研究，同时避免在观察期间因克隆过度生长而导致重叠。这些预实验应在完全相同的实验条件下（相同的培养板、试剂等）进行，因为这些因素可能影响实验结果。
注意：接种密度过低会导致生长不足，而密度过高则会因细胞过于密集而难以准确追踪单个细胞。- 对于采集后48小时内、在4 °C保存于采集培养基中的新生儿包皮组织来源的第0代（P0）角质形成细胞，接种密度应为1000–5000个细胞/cm2；对于第1代（P1）角质形成细胞，使用500–2000个细胞/cm2。代数越高，接种密度应越低。
- 将细胞接种至选定尺寸的培养板中。
注意：96孔板和微孔板存在弯月面效应，导致细胞分布不均，大部分细胞生长区域位于成像视野之外。较大孔径的培养板（例如24孔板）可捕获更多数据。24孔板最多可观察36个视野，而96孔板最多仅能观察5个视野。然而，仪器可捕获的视野数量有限，视野越多，占用成像设备的资源也越多。通常推荐使用24孔板。- 为实现细胞在培养板上的均匀分布，可采用多种技术。首先，不要逐孔接种，而是将所有孔所需总量的培养基于特定稀释比例加入一个微量离心管中。然后，加入达到目标密度所需的总细胞数，并轻轻颠倒混匀管子，使细胞均匀分散。
- 接种完成后，将培养板按十字形移动三次（上下、左右），然后小心转移至培养箱。
警告：若使用微孔板，应避免使用外周的行和列孔位，因为延时显微镜在成像时会产生热量，可能导致这些孔中培养基蒸发。实验孔应集中放置于板中央，并在其周围孔中加入最大容量的PBS或其他无菌液体，以减少蒸发和边缘效应。
- 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养24小时，以促进细胞贴壁。
- 24小时后更换培养基。
注意：吸除旧培养基时不要扰动正在生长的单层细胞。始终使用预热至37 °C的培养基，并沿孔壁缓慢加入新培养基。此处使用的培养基为Epilife/Supplement S7/Primocin。对于此类长期活细胞成像应用，建议在培养基中添加抗生素。在用于多个并行实验的设备中进行长时间培养，污染风险较高。青霉素和链霉素是常用的抗生素。 - 当左下角的三角形按钮亮起绿色时，按下该按钮打开载物托盘。将培养容器放入空闲的插槽中，然后再次按下左下角的同一按钮关闭托盘。当按钮为红色时，切勿打开托盘，因为此时设备正在扫描，打开会导致扫描中断。
警告：在操作前，请查看控制器模块屏幕，确认无正在进行的扫描。屏幕上会显示下一次扫描开始前的时间以及扫描持续时间。若扫描正在进行，则会显示扫描完成所需的时间。 - 在计算机上打开应用程序，使用相应的用户ID和密码登录，然后选择 计划。
- 在计划界面左上角点击 + 按钮，将培养板添加至实验计划中。
- 选择 按计划扫描，然后点击 下一步。
- 选择 新建，然后点击 下一步。
注意：如果当前培养板与之前或正在进行的实验完全相同，可使用 复制先前 或 复制当前 功能，以加快实验设置。 - 扫描类型选择 标准，然后点击 下一步。
注意：Image Lock 是一种专有的96孔板，有助于最小化失焦或图像跳动现象，若遇到此类问题可考虑使用。其他扫描类型在谱系追踪中并不特别适用。 - 在扫描设置中，选择使用相位通道、10倍物镜的 贴壁细胞逐个扫描 模式，然后点击 下一步。
注意：只要选择了相位通道，此时无需选择任何分析选项，分析可在数据采集完成后进行。 - 选择培养容器类型，然后点击 下一步。大多数常见容器均可与设备兼容，但非微孔板可能需要特殊适配器才能放入延时显微镜的插槽中。
- 选择一个空闲插槽放置容器，然后点击 下一步。
- 选择需要扫描的孔以及每孔采集的图像数量，然后点击 下一步。预计扫描时长将显示在屏幕左下角。
- 按照所需的命名规则为实验命名。创建实验的板图以供将来参考，然后点击 确定。最后，点击 下一步。
- 将分析推迟至数据采集完成后进行，因为逐个细胞的分析必须在扫描结束后启动。点击 下一步。
- 最后，设置成像频率。为了可靠追踪持续约30分钟的有丝分裂过程，对角质形成细胞建议以20分钟为间隔进行扫描。点击 下一步 并确认设置以开始实验。
注意：扫描时间不得重叠，制造商建议设备运行时间与休息时间应大致相等。以20分钟为间隔时，每次扫描时间应控制在最多10分钟以内。例如，对24孔板中的12个孔、每孔36个视野进行成像，扫描耗时约7分钟。因此，在实验规划时务必充分考虑设备资源的可用性。- 若设备无足够休息时间，系统将发出警告；若扫描时间重叠，则无法将容器加入计划。若无法以固定间隔将容器排入计划，可点击 预留托盘位置，然后点击 下一步。
- 双击屏幕顶部的时间表，选择处于预留状态的容器，然后手动点击空闲时间段添加图像。或者，在时间表打开后右键单击，删除所有已安排的扫描时间，再右键设置新的扫描时间，以固定间隔为扫描组安排时间。
注意：此操作将中断设备上所有正在进行的实验，直至新时间设定完成。切记点击软盘图标保存更改，或点击红色X取消修改。选择目标孔或视野的过程非常直观，设备会在参数选定后立即显示预计扫描时间。扫描时长取决于所选培养板的类型和品牌，以及需扫描的孔数或视野数。这使用户能够调整扫描参数以匹配设备容量。
- 对于角质形成细胞，每48小时更换一次培养基。为确保培养板方向正确，每次将容器放入设备后，应等待首次扫描完成（时间允许的情况下）。这是一个容易犯的简单错误。放置培养板时，应使标注行号的字母位于插槽左侧。
- 要查看扫描图像，点击带有 眼睛 图标的 查看 按钮，然后双击相应实验。如果培养基颜色突然变化（含酚红的培养基因酸化变为黄色）、出现大量死亡细胞（可能干扰活细胞克隆的增殖）或观察到异常形态，应考虑提前更换培养基。
- 当所有孔中的细胞均进入静止状态或达到汇合状态时，导出实验数据。成人来源的克隆建议追踪约2周，新生儿来源的克隆追踪约10天，此后因细胞拥挤，分析收益将逐渐降低。
- 导出时，点击 查看 选项卡，然后在最近扫描列表中双击目标实验（默认按时间倒序排列）。点击带箭头的 横向布局 图标，等待导出工具启动。
- 点击 按显示导出，然后点击 下一步。
- 手动点击每个需要导出的视野，然后点击 下一步。
- 选择导出为视频或图像序列，并选择要导出的扫描时间点。对于角质形成细胞谱系追踪，建议选择视频格式并导出全部扫描数据（可使用带虚线框的 全选 图标快速完成）。点击 下一步。
- 以每秒1帧的速度导出，质量设为最高（通过质量滑块旁的条形调节）。点击 下一步。
- 选择目标文件夹和文件类型，命名文件后点击 导出。
注意：导出视频所需时间可能很长，具体取决于网络连接速度和计算机性能。对于较大规模的实验，可能需要数天时间才能完成所有视频文件的导出。具备远程登录延时显微镜系统的功能将极为便利。
2. 利用延时成像构建谱系树并生成数据表
- 使用媒体播放器打开视频文件。推荐使用 VLC 媒体播放器。
- 浏览视频并识别正在生长的克隆。使用 VLC 时，可通过方向键前后逐帧跳转。对需要追踪的克隆进行截图，并为其标注标签。
- 在视频记录结束时或数天后确定一个感兴趣的克隆，然后倒回视频以定位形成该克隆的起始细胞。
注意：此时合适的接种密度至关重要。若克隆密度过高，相邻克隆会扩展并相互融合，导致无法准确追踪细胞分裂过程。 - 当细胞即将分裂时，其形态会显得更加致密（图1）。在细胞分裂发生时暂停视频，记录分裂时间（时间戳位于画面左下角）。对该初始分裂进行截图，并使用与克隆相同的标签进行标记。在手绘的谱系图中记录每次分裂（参见代表性结果）。尽可能持续追踪并记录更多代次的分裂过程。
注意：目前已有或正在开发自动化的细胞追踪技术，以加快该过程并更准确地追踪细胞7。即使在低钙培养条件下，现有机器学习模型在分化程度较低的情况下仍缺乏足够灵敏度，无法准确追踪角质形成细胞的分裂。 - 将手动绘制的谱系树转录至数据表中——该数据表被称为"绿表"，因其电子表格背景颜色为绿色（补充文件1）。
- 利用绿表计算增殖性分裂与分化性分裂的比例，识别干细胞克隆与定向祖细胞克隆，并确定细胞周期持续时间（参见代表性结果）。
注意：该仪器可通过其内置的基本分析模块和单细胞分析模块执行多种其他检测（如汇合度、划痕实验等）。但这些内容不在本实验方案的范围之内。
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结果
原代角质形成细胞以一种可预测的方式生长，可通过活细胞成像进行追踪。使用VLC媒体播放器查看录像记录。首次分裂所需时间具有变异性，可能持续数天，具体取决于供体的特征，例如年龄、健康状况或体外环境中存在的生长因子。in vitro 环境中，接种初期角质形成细胞呈体积较小、圆形的形态（图1）。接种后，具有克隆形成能力的角质形成细胞通常会变得扁平（图1）。这些扁平化的角质形成细胞通常比不分裂的细胞更具迁移能力（补充视频1）。在即将分裂前，扁平的角质形成细胞会表现出中央区域的凝聚现象（图1）。
除最初的分裂外，95%即将分裂（增殖型 - P）的角质形成细胞会在上一次分裂后的48小时内进行分裂6。未能在此时间内分裂的细胞被视为终末分化细胞（D）（图1）
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讨论
活细胞成像是一种无需标记即可追踪干细胞和定向祖细胞分裂行为的角质形成细胞研究方法。鉴于表皮的稳态维持依赖于干细胞和定向祖细胞的增殖动力学10，深入理解这些角质形成细胞群体的变化及其在不同条件下的受影响情况，有助于开发相应的治疗策略，以改善所发现的功能缺陷。
最终，通过活细胞成像进行谱系示踪依赖于获得可用的数据。在延时摄影生成的视频中，必须能够清晰地观察到克隆形成单位。使用新分离的第0代细胞时，很难达到真正的单克隆密度。仅有3%–4%的接种角质形成细胞最终能够形成克隆11。 细胞密度过高可能使细胞分裂无法追踪，甚至难以识别最初的克隆形成细胞；而密度过低，则可能导致克隆无法形成。同样，任何遮挡视野的因素都会使基于谱系示踪的细胞追踪无法实现。使用成纤维细胞饲养层可能会影响分裂过程的追踪，因为成纤维细胞会遮蔽视野。此外，沉淀物、细胞碎片，甚至培养板盖上的冷凝水珠，都可能遮挡正在生长的克隆。即使是一些看似微小的疏忽，例如未确保微孔板牢固插入指定的卡槽中，也可能导致实验失败，因为图像将无法...
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致谢
本工作获得了美国退伍军人事务部临床科学研究局优异评审奖（Merit Review Award Number I01 CX001816）的资助&D（CSRD）服务。本内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。我们感谢Michael Rosenblum博士为我们提供其延时显微镜的使用权限，以开展实验。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔Imagelock板 | Sartorius | BA-04856 | 若使用96孔板，建议选用与仪器兼容的微孔板。 |
| 24孔板 | Corning | 3524 | 若使用24孔板，建议选用与仪器兼容的微孔板。 |
| 两性霉素B，50 mL | Corning | 30-003-CF | 稀释至5倍浓度（原液为100倍浓缩液），用于配制5倍浓缩的PSA，换液时使用1倍浓度 |
| Epilife培养基，50 mL | Gibco | MEP1500CA | 添加S7补充剂，可考虑加入Primocin |
| IncuCyte S3 | Sartorius | 4637 | 成像仪（Zoom/SX5为可接受的替代型号） |
| 青霉素/链霉素，100 mL | Corning | 30-002-Cl | 稀释至5倍浓度（原液为100倍浓缩液） |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-05 | 每500 mL培养基中加入1 mL |
| S7补充剂 | Gibco | S0175 | 添加至Epilife培养基中 |
参考文献
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