方法文章

β 淀粉样蛋白 1-40 包被的金胶体的 pH 依赖性可逆自组装的表征

DOI：

10.3791/67856

⸱

2025年3月21日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, State University of New York Geneseo College

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了一种系统的方法，描述了淀粉样蛋白 β 1-40 （Aβ 1-40） 包被的 20 nm 金聚集体的准可逆自组装。肽之间纳米尺寸依赖性的准可逆网络与 Aβ 1-40 单体的特定氨基酸或部分相关。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用表面等离子体共振 （SPR） 光谱和透射电子显微镜 （TEM） 对涂覆在纳米金胶体颗粒表面的 Aβ 1-40 进行表征。观察到的 Aβ 1-40 涂层 20 nm 金颗粒的 SPR 波段的 pH 依赖性偏移与 TEM 图像中观察到的聚集和解聚交替相关。~4 的 pH 值诱导未折叠的构象，而 ~10 的 pH 值诱导 Aβ 1-40 在金表面的折叠构象。当 pH 值逐渐从 pH 4 变为 pH 10 时，通过拉曼成像观察到这种可逆聚集过程。我们在金表面观察到 Aβ 1-40 的 pH 依赖性形态变化，在 pH 4 时观察到透明的聚集体。然而，我们观察到 pH 4 和 pH 10 条件下表面增强拉曼光谱 （SERS） 光谱存在非常细微的差异，最显着的差异是光谱密度在 250 cm-1 和 1750 cm-1 范围内。具体来说，可逆聚集体的模式分析表明，聚集体是由 Aβ 1-40 的展开构象形成的，其中涉及酪氨酸和苯丙氨酸的苯环部分。相反，聚集体的分解与 Aβ 1-40 蛋白质折叠的构象变化有关，涉及组氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸和天冬氨酸。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

淀粉样蛋白 β 1-40 （Aβ 1-40） 或 1-42 （Aβ 1-42） 肽的原纤维生成已被广泛研究为淀粉样蛋白斑块形成的关键成分，淀粉样蛋白斑块是阿尔茨海默病的原因 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ，11.纤维生成的关键机制是 Aβ 1-40 或 Aβ 1-42 肽的寡聚化形成神经毒性蛋白质聚集体，并且已经进行了广泛的研究以了解单体如何形成低聚物的机制 12,13,14.我们采取了一种方法来检查在纳米金表面上形成聚集体的淀粉样蛋白生成肽，并确定负责远离金表面的肽之间联网的因素15、16、17、18、19、20、21、22。

Aβ 1-40 在酸性条件 （pH ~4） 下采用未折叠构象 （A），在碱性条件 （pH ~10） 下采用折叠构象 （B）。我们在 pH ~10 下观察到分散的 Aβ 1-40 涂层金胶体颗粒，在 pH~4 下观察到大的 Aβ 1-40 涂层金胶体聚集体（图 1）23,24。在酸性条件下，Aβ 1-40 的去折叠构象有利于 Aβ 1-40 单体之间的肽网络，而不是金纳米颗粒表面，从而形成金胶体聚集体（参见图 1 中的 A）。当 Aβ 1-40 单体在碱性或中性 pH 值 Aβ 1-40 下保持折叠构象时，单体不会联网成聚集体，包被的金纳米颗粒保持为单独的分散颗粒（参见图 1 中的 B）。因此，我们可以通过测量25、26、27、28、29、30、31 范围内 pH 条件下的 SPR 带偏移来询问 Aβ 1-40 肽如何发生构象变化到网络并形成聚集体的过程。

我们测试了几种不同大小的金纳米颗粒，发现 20 nm 金胶体响应 pH 值的外部变化表现出 Aβ 1-40 单体最突出的可逆自组装过程（图 2）。这清楚地表明肽构象发生了可逆变化，其中酸性条件 （A） 诱导了未折叠的构象，增强了网络并导致金胶体的聚集。发现基本条件 （B） 诱导单体 26,27,28,29,30,31 的折叠构象。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aβ 1-40包覆金纳米颗粒的制备

  1. 使用注射器针头将 1 mL 体积的蒸馏去离子水添加到 1 mg 冻干 Aβ 1-40（MW:4.2 kDa，HPLC 纯度 98%）中。用涡旋混合器将溶液混合约 30 秒，并确保在室温 （RT;~20 °C） 下溶液中没有观察到固体颗粒。
    1. 使用去离子水和蒸馏水 （~18 MΩ·cm） 制备所有储备溶液。
    2. 利用 275 nm32 处的酪氨酸吸收光谱鉴定浓度，其分子消光系数ε275 为 1390 cm-1·M-1 号。
    3. 将 Aβ 1-40 的储备溶液储存在 -80 °C。 （参见 Aβ 1-40 商业产品的材料表。
  2. 在数据收集前约 5 分钟解冻肽储备溶液。在 15 mL 离心管中将 8 μL 体积的肽溶液与 800 μL 金胶体颗粒混合。加入 4.2 mL 体积的去离子蒸馏水，然后将样品涡旋 10 秒30、31、33、34。
  3. 将 Aβ 1-40 肽的浓度固定为 1.8 nmol，并调整 Aβ 1-40 肽的比例。金胶体的数量范围在 ~500:1 到 ~2000:1之间 25。

2. 迭代 pH 值变化和监测相应的 SPR 频带偏移

  1. 使用紫外-可见-近红外 （UV-Vis-NIR） 分光光度计的温度控制单元将溶液温度设置为确定值（例如，25 °C）。
  2. 使用 pH 计监测样品溶液的初始 pH 值，并将其设置为略低于 pH 7。收集 400 nm 和 1000 nm 范围内的吸收光谱。
  3. 通过添加 10 μL 体积的 0.1 M HCl，将样品的 pH 值更改为 ~pH 4（即 pH 4.0 ± 0.3），并收集 400 nm 和 1000 nm 之间的吸收光谱。
  4. 通过添加 10 μL 体积的 0.1 M NaOH，将样品的 pH 值更改为 ~pH 10（即 pH 10 ± 0.3），并收集 400 nm 至 1000 nm 之间的吸收光谱。
  5. 用 HCl 和 NaOH 在 pH 4 和 pH 10 之间改变 pH 值 10 倍，并在 25 ± 0.2 °C 下连续收集吸收光谱29,30。
    注:对于所有样品溶液，SPR 谱带峰的光密度保持在 0.2 左右。由于溶液中的残留缓冲溶液，预计会产生缓冲效果。因此，在确认平衡后确定最终的 pH 值。使用微量 pH 电极在样品比色皿中直接测量 pH 值，其准确度为 ±0.005 pH。
  6. 获取美国信息交换标准代码 （ASCII） 波长数据集作为吸光度的函数。使用 Peak Fit 程序提取谱带峰的平均位置。
    1. 绘制数据集，使用 Plot 函数查看光密度与波长 （nm） 的函数关系。
    2. 通过在绘制数据中选择初始峰值波长 λ1、λ2 和 λ3 来标记它们，并使用 RUN 函数拟合数据。
    3. 获得包含每个谱带的中心峰 （λi） XCi 和每个谱带的面积 （Ai） 的图表。
  7. 将提取的峰位置和峰面积导出到电子表格程序中，并计算给定 pH 下的平均峰位置。
    1. 通过将谱带的面积 （Ai） 与整个谱带的总面积进行比较，确定每个峰中心 λi 的加权因子 ai i，如下所示:figure-protocol-1。
    2. 使用方程 （1） 提取平均峰位置 figure-protocol-2 （pH）。
      figure-protocol-3(1)
  8. 使用以下过程生成可逆性图:
    1. 将平均峰位置 figure-protocol-4制成表格，作为每个"作"编号 n 与 n 的 figure-protocol-5 函数。在 ~pH 值为 7 时加入酸之前，将样品的作编号 n 设为 1。每次将作次数增加 1，将 pH 值更改为 ~pH4（HCl）或 pH 值（NaOH）更改为 ~pH 10。使 n 在酸性条件（即 ~pH 4）下为偶数，使奇数为碱性条件（即 pH 10）。
    2. 使用公式30 分析每个 n figure-protocol-6 处的峰位置 （n） = λ（n）
      figure-protocol-7(2)
      注:用 A 表示 n = 1 处的初始平均峰位置。将参数 B 和 C 表示为与 n 相关的峰位置偏移。将参数 D 作为重复的阻尼因子 E 的振幅。使用 sine 函数将峰位置的波动显示为 n 的函数。
    3. 将 （x， y） 的数据集传输到 Origin 软件并绘图。
    4. 形成方程 （2） 中给出的 自定义 函数 非线性 曲线拟合函数 分析。键入初始 A、B、C、D 和 E 值，然后单击 RUN 完成拟合。
  9. TEM 成像
    1. 用 Formvar 涂层的铜网格制作 Aβ 1-40 涂层的 20 nm 金胶体的 TEM 样品。用 80 kV 运行的 TEM 检查样品。
    2. 在 XR-40 型 4 MP CCD 数码相机 （AMT） 上以 28,000 倍或 71,000 倍的标称放大倍率收集图像。在每个作次数 n = 1 （~pH 7）、n = 2、4、6、8 和 10 （pH 4） 以及 n = 3、5、7 和 9 （pH 10） 下收集 Aβ 1-40 涂层的 20 nm 金的 TEM 图像。

3. 拉曼成像和可逆聚集的研究

  1. 在作编号 n 处，每个样品将 100 μL 溶液放在云母盘（直径为 1 cm）上。测量前将样品干燥过夜。
  2. 在每个作编号 n 处收集白光图像。在云母盘上准备单独的样品，因为对于每个作次数 n，pH 值在 ~pH 4 和 ~pH 10 之间连续变化（图 3）。
  3. 使用波长为 λ = 633 nm 的激光以 0.5 ± 0.05 mW 功率收集每个作次数 n 的拉曼图像，空间分辨率为 ~0.43 μm，网格由 100 × 100 像素组成，积分时间为 500 ms/光谱，适用于 ~200 cm-1 和 ~2,800 cm-1 之间的区域（图 4）。
  4. 绘制每个 n 对齐的代表性光谱作为 n 的函数，并构建三维 SERS 光谱作为 Aβ1-40 涂层 20 nm 金的函数（图 5A）。利用三维 SERS 光谱的顶视图作为等值线图（图 5B），以提取与特定 pH 条件相关的特定模式（即 ~pH 4 和 ~pH 10）。提取仅 n偶数 或仅 n奇数增强的任何谱特征。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

随着 Aβ 1-40 附着在金纳米胶体颗粒表面，当溶液变得更酸性 （pH 4） 时，530 nm 吸收最大值周围的 SPR 带显著红移至 ~650 nm 峰位置35。结合 TEM 图像，我们确定在 pH 4 下观察到的光谱特征对应于金胶体聚集体的形成，这些聚集体具有合理展开的构象，并与吸附在金表面的周围未折叠的 Aβ 1-40 单体30 相连。我们观察到 Aβ 1-40 单体在碱性 （pH 10） 条件下反转回折叠构象，导致聚集体以准可逆方式变形。这种准可逆过程从平均带峰 （（n）） 的交替中可以明显看出，平均谱带峰 （figure-results-1（n）） 在较短和较长的波长之间移动，以及 TEM 图像中碱性 （pH = 10） 和酸性 （pH = 4） 条件之间的色散与聚集体形态。先前已经观察到，即使在溶液恢复到碱性条件后，Aβ 1-40 单体的一部分仍未折叠36。视频 1 显示了 Aβ 1-40 和 20 nm 裸金胶体的 pH 依赖性颜色变化。

作为比较，对 20 nm 裸金胶体进行了 pH 跳跃研究（图 5C 和 D）。随着 pH 值变化作的进行，它在 SPR 波段 shoft、TEM 图像以及白光图像中显示出金胶体聚集的增长。非常有趣的是，有几条 SERS 谱线取决于 n奇数和 n偶数。例如，在 n偶数 （pH ~4） 时，275 cm-1 处的线被指定为与 Aun （n = 5， 6， 12， 16， 20， 58）37 或 Au-Cl- 配体38 的模式相关的模式被密集观察。另一方面，对于 n偶数，在 1008 cm-1 处观察到 C-N str39 和 CH2 摆动39，在 1291 cm-1 处广泛观察到 CH2 变形40。

与白光成像观察到的清晰的 pH 依赖性和可逆聚集形态相反，SERS 光谱中 n奇数 和 n偶数之间的光谱特征存在相对细微的差异。作为第一个近似值，在 250 cm-1 和 1750 cm-1 之间的区域内，n奇 数的光谱线密度高于 n偶数。指纹区域 1250 cm-1 和 1750 cm-1 （酰胺 I、II 和 III 波段）中 n奇 数的光谱线显示出较低分辨率的光谱特征，这意味着光谱密度变宽或增加。在 图 6 中， 图 5B 中给出的等值线图（图 6B）与 761 cm-1 （红色）和 1395 cm-1 （蓝色）的 SERS 信号组织在一起，分别代表 n奇数 和 n偶数的强调（图 6C）。作为 n奇数 和 n偶数的代表性 SERS 谱图，n = 7（红色）和 n = 4（蓝色）的 SERS 谱图显示在顶部（图 6A）。为了显示与 Aβ1-40 涂层 20 nm 金的 SPR 带移的对应关系， 图 3 中的带移图显示在侧面（图 6D）。

虽然我们获得了有关观察到的 SERS 光谱完整分配的初步数据，但我们在这里注意到几个值得注意的拉曼偏移特征。在 n奇数中增强的谱线和（合理的分配）主要在低于 1000 cm-1 的区域:394 cm-1 （Trp）41,42,43,761 cm-1 （His，Ala）39,44,45,46,47,875 cm-1 （吲哚 NH 位移，Met 的 C-C 拉伸）39， 974 cm-1 （Glu，C-COO-Asp 的拉伸，与柠檬酸盐相关的模式）39,48,49。在 n 处增强的拉曼位移甚至在指纹区域（酰胺 I、II 和 III）显示出显着的光谱特征:1166 cm-1（Tyr的 N-H+ 变形）39,41、1227 cm-1（Ala-Pro-Gly、酰胺 III）39,50,51、1395 cm-1（COO - 对称拉伸或 CH2- CH3 - Glu 的剪刀）39,48、 1585 cm-1 （Phe的环CC拉伸、羧酸盐-Au的不对称拉伸、柠檬酸盐的COO-拉伸、苯环的变形）39,41,45,46,47,49,52， 1592 cm-1 （Phe、Tyr、Tyr的C=C拉伸、Phe中环的CC拉伸、苯环拉伸和COO-Phe 和 Tyr 的拉伸，以及 OH 的不对称拉伸）39,41,48,50,51 和 1628 cm-1（分子间 β 折叠结构53、C=O 和蛋白质骨架的耦合 CN/NH 振动模式源自平行 β 折叠型结构、聚集 Aβ 54 的积累、无规则卷曲、β 转、 β 发夹48.出现 n奇数或 n偶数的序列如图 7 所示。总体而言，对于 n甚至对应于 Aβ 1-40 的可逆聚集或展开构象，含有苯环的 Phe/Tyr、COO- 的对称拉伸、Glu 的 CH2- CH3- 剪刀模式和 Tyr 的 -NH+ 变形显着参与肽的构象变化。在肽采用对应于 n奇数处突出的模式的折叠构象时观察到的聚集体分解过程中，似乎涉及 Glu、Asp、Met、His 和 Ala。

figure-results-2
图 1:pH 依赖性吸光度和形态。显示了 Aβ 1-40 包被的金纳米颗粒 （20 nm） 在 pH 4 （A） 和 pH 10 （B） 下的吸收光谱，以及相应的 TEM 图像、聚集/分散颗粒的草图和样品瓶中溶液的图片。A 是 Aβ 1-40 单体在酸性条件下的去折叠构象，B 是碱性条件下的折叠构象。TEM 图像旁边显示了每种构象和 Aβ 1-40 单体的聚集/分散形态图。请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-3
图 2:纳米级依赖的自组装可逆性。 对于所有测试尺寸的金胶体颗粒，SPR 谱带 figure-results-4的平均峰位置偏移与作数 n 的函数关系。图1中还给出了近似的pH值和 聚集 体的相应阶段。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-5
图 3:figure-results-6和每个作编号处的 TEM/白光图像。figure-results-7将 Aβ 1-40 涂层的 20 nm 金（闭合圆圈）和 20 nm 金胶体（空心圆圈）的作编号 n 的函数绘制在一起，并用代表性的 TEM（A 和 C）/白光图像（B 和 D）显示所选作编号（n = 1、2、3、7 和 8，用解码箭头标记）对于 Aβ 1-40 涂层的 20 nm 金（A 和 B）和 20 nm 金胶体（C和 D）。黑色字体表示 pH 7，蓝色字体表示 pH 4，红色字体表示 pH 10。请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-8
图 4:代表性白光和拉曼图像。 （A） n = 2 和 （B） n = 3 的白光图像、拉曼图像和 SERS 光谱;i） 宽视场中的白光图像，ii） 拉曼图像采集区域的白光图像（在 i） 中由红色方块标记），iii） 两个组件组合的拉曼图像，iv） 组件 1 的拉曼图像及其 v） sers 光谱 iv），vi） 组件 2 的拉曼图像， vii） vi） 的 SERS 谱。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-9
图 5:n奇数、n偶数和 nall 的 SERS 光谱等值线图。 （A） 250 cm-1 和 1750 cm-1 区域 SERS 光谱的三维图，作为 Aβ1-40 涂层 20 nm 金的 n 函数，顶部有 （B） 所示的等值线图。（C） 20 nm 金的 SERS 光谱在 250 cm-1 和 1750 cm-1 区域与 n 的函数关系，顶部为 （D） 所示的等值线图。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-10
图 6:SERS 光谱的等值线图。 SERS 光谱的等值线图与 n （1-10） 的函数关系。（A） 1395 cm-1（蓝色）和 761 cm-1（红色）处的吸光度。（B - D）底部面板显示 SERS 光谱，右侧面板显示每个 n 处 SERS 信号的信号强度变化幅度。请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-11
图 7:Aβ1-40 的显着序列。 分配给在 n奇 数时显着参与的序列（对应于折叠构象的形成）由向下的红色箭头表示，分配给在 n偶 数时显着参与的序列（对应于未折叠构象的形成）由蓝色箭头表示。 请单击此处查看此图的较大版本。

视频 1:Aβ1-40 和 20 nm 裸金胶体的 pH 依赖性颜色变化。请点击此处下载此视频。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肽构象研究的一个关键考虑因素是样品维护，因为如果储存不当，样品会变质。肽样品以冻干形式接收，一旦用蒸馏去离子水再水化，即使储存在 -80 °C 下，它们也开始变性。 通过质量控制分析验证金胶体的纯度。为了保持胶体的稳定性，将它们储存在 4 °C 下，不要冷冻。每次实验都新鲜制备金胶体溶液，因为盐缓冲溶液会破坏金胶体的稳定性。为每个实验新鲜制备 HCl 和 NaOH 溶液。

使用精密仪器手动读取和记录溶液的 pH 值，同时将 pH 值在 4 到 10 之间变化，这限制了我们报告结果的精度。因此，我们没有观察到 SERS 信号强度的一致结果。这可能会给用于等值线图的振幅带来误差。未来验证与 n偶数或 n奇数相关的模式的工作可能会引入突变来替换我们报道的参与蛋白质构象变化的 Aβ 1-40 序列中的氨基酸，例如单个酪氨酸或天冬酰胺残基。

"Aβ1-40 单体与金表面之间的相互作用被认为是偶极相互作用，氢键水平由 H. Schmidbauer 等人在工作中假设55。在另一项工作中，我们研究了 SERS 光谱在酸性条件下作为 Aβ1-40 量的函数，它提取了纳米级依赖性吸附形成56。对于 20 nm 金，推测组氨酸 （His） 的 C=C 或 -C-N 键会引发吸附;然而，对于 80 nm 的金，苯丙氨酸 （Phe） 或酪氨酸 （Tyr） 的苯环呼吸模式到达金表面以引发吸附。在中性或碱性条件 （pH ~10） 下，Aβ1-40 在金表面上的吸附过程被认为可以保持 Aβ1-40 涂层金胶体的亲水性，因为在水性条件下没有形成沉淀。然而，在 pH 值为 4 时观察到沉淀物，这意味着聚集体是疏水性的。

TEM 图像和白光图像仅间接显示了聚集的证据。我们试图进行圆二色谱 （CD） 光谱，以将在可逆聚集中观察到的形态与二级结构相关联。然而，散射基线阻止了我们获得可重现的 CD 信号。因此，我们利用了拉曼光谱，更多地关注在 pH ~4 下发生聚集（Aβ1-40 的去折叠构象）或在 pH ~10 下发生解聚（Aβ1-40 的去折叠构象）时增强的模式。因此，在这项工作中识别二级结构的最佳推测仅限于监测与二级结构相关的节点。这在 1628 cm-1 处观察 β 片材中得到了证明，特别是在 pH 4 条件下。

本研究仅观察到直径为 20 nm 的金胶体的肽构象变化，并且只研究了 n 到 10 个。Aβ 1-40 肽的构象和聚集特性可以通过它们吸附到56 的颗粒大小来改变。因此，需要更多的工作来了解基于单体之间网络的肽的性质，以及受吸附表面物理特性影响的肽的性质。在我们测试的条件下，只有直径为 20 nm 的金胶体表现出聚集形态的可逆性，并且胶体直径如何影响该特性的可逆性的机制尚不清楚。将 n 增加到 20 可以更深入地了解聚集形态可逆性的模式依赖性程度。这些关于金胶体大小如何影响淀粉样蛋白 β 肽聚集的研究将为阿尔茨海默病病理学的分子机制提供重要见解。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明他们与本作品没有利益冲突要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KY 由 NSF-MRI Grant #2117780 支持。Geneseo 基金会支持该项目的初始阶段。AI 感谢纽约州立大学杰纳西奥化学系校友暑期研究奖学金（'19 Rhodes 奖和 '20 Lipkowitz 奖）和德雷福斯基金会本科生暑期研究奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
β 淀粉样蛋白肽 1-40 （Aβ1–40肽）r-肽 （Bogart， GA， USA）A-1156-2
CCD数码相机AMTXR-40 4百万像素CCD 
来自 Milli-Q- 水系统的蒸馏去离子水Millipore Sigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）Milli-Q IQ 7000
冰箱 -86 oCThermo ScientificRevco Chilly Willy RLE系列单元ID 187004 版本号40.04
胶体（10 nm）Ted Pella， Inc.（美国加利福尼亚州雷丁市15703-20
胶体（100 nm）Ted Pella， Inc.（美国加利福尼亚州雷丁市）15711-22
胶体（15 nm）Ted Pella， Inc.（美国加利福尼亚州雷丁市）15704-20
胶体（20 nm）Ted Pella， Inc.（美国加利福尼亚州雷丁市）15705-20
金胶体 （30 nm）Ted Pella， Inc. （美国加利福尼亚州雷丁市）15706-21
金胶体 （40 nm）Ted Pella， Inc. （美国加利福尼亚州雷丁市）15707-21
金胶体 （50 nm）Ted Pella， Inc. （美国加利福尼亚州雷丁市）15708-21
金胶体 （60 nm）Ted Pella， Inc. （美国加利福尼亚州雷丁市）15709-22
金胶体 （80 nm）Ted Pella， Inc. （美国加利福尼亚州雷丁市）15710-22
最高等级 V1AFM 云母盘 10 毫米Ted Pella Inc.#50
盐酸标准溶液，1.0 NFluka批次# SHBB4705V    318949-2L
微距石英 quvette 光路 10 毫米Fire Fly Science 类型1-MC-Path10mm
微量 pH 电极HORIBA型号 9618S （制造商编号 9Y8E0050）
峰值拟合程序（美国马萨诸塞州北安普敦）原产地Pro2018b （64 位） b9.5.5.409 （学术级）
pH 4.00 缓冲溶液 VWR货号 34170-127
pH 7.00 缓冲溶液 Fisher ChemicalSB107-4 批量191041
pH计HORIBA型号 F-72G （制造商编号 B27M0017）
移液器吸头  Maxi Tips 1–5 mL费希尔  02-707-467
移液器吸头 10 mLFisher02-717-135
移液器吸头 1000 mLFisher02-717-156
移液器吸头 1–200Fisher02-717-143
Pipetter Fisher品牌Elite 0.5–5 mLFisherQU05317
移液器 Fisher Brand Elite 100–1000 mLFisherQU01672
移液器 Fisher Brand Elite 10–100 mLFisherMU10985
移液器 Fisher Brand Elite 1–10 mLFisherMU08178
氧化钠溶液 1.0 MFluka批次#05096BPV  319511-2L
TEMFEI CoMorgagni 型号 268 
TempAssure PCR 管，平盖，自然色 USA Scientific聚丙烯。0.2 mL 独立薄壁管，带磨砂平盖
UV-Vis-NIR 分光光度计VarianCARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R 共聚焦拉曼显微镜WITec-Oxford 仪器XMB3000-3001
金）金金金 原产地 毫升氢

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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