陆生两栖动物皮肤细菌菌株的分离与鉴定

摘要

这是一种从欧洲无肺螈科（Plethodontidae）蝾螈皮肤微生物群中采样并分离可培养细菌的方法Speleomantes 属. 本文介绍了一种使用拭子采集蝾螈皮肤样本并采用可培养方法进行处理的实验方案。我们描述了样本采集、分离及无菌培养体系的建立，并对细菌菌株进行了表征。

摘要

微生物群是高等生物体的重要组成部分，其中皮肤微生物群在生物体抵御外界因子方面发挥着重要作用。目前尚无针对Speleomantes（两栖纲：无肺螈科）皮肤微生物群进行微生物培养法取样的标准方法。为解决这一问题，我们建立了一种从个体皮肤分离细菌的实用方案，以及样本处理与保存的最佳实践。该方法步骤简便：采样后将拭子保存在添加甘油的生理盐水中。样本转移至实验室后，可在+4 °C条件下保存最多10天，以确保微生物群落的完整性。本研究为陆生两栖动物（如Speleomantes属物种）皮肤微生物群的调查提供了有价值的见解。该方法有助于濒危物种的保护、监测和管理措施的实施，也可能增进对微生物群在两栖动物健康与生态中功能的理解。该方案在多种野生动物保护情境下的微生物组研究中亦可能具有广泛意义。

引言

所有生物体的上皮表面、组织和器官上都共生着多种微生物¹。皮肤是宿主与其环境之间的主要界面，为多种微生物提供了栖息环境²。皮肤是脊椎动物最大的器官，可作为抵御机械、化学和微生物侵袭的屏障³。然而，由于皮肤广泛暴露于外界环境，使其很可能成为介导生物体与外部生物和非生物因素相互作用的最重要生态前沿⁴。

近十年来，两栖动物皮肤微生物群已得到深入研究，其微生物群落与宿主之间的关系也已被广泛探讨^5,6,7,8,9,10。皮肤微生物群的生物多样性主要由宿主类型决定（即物种特异性群落），但其他环境因素也可能促进种间多样性的增加¹¹。两栖动物的皮肤微生物群组成与其他动物存在显著差异。已知两栖动物与其皮肤微生物之间存在互惠共生关系，能够生物合成抗菌化合物，或帮助宿主抵御新发传染病¹²。

从皮肤中分离细菌通常需要完成多个步骤。第一步是通过拭子取样获得具有代表性的样本，并避免外部污染。将微生物样本悬浮于无菌生理盐水或缓冲液中。在悬浮液中添加保护剂（如甘油）可能有助于在实验室转运过程中维持细菌群落的完整性^13,14。样本转移至实验室后，应立即处理或在短时间内处理，以保持微生物群落的完整性。传统的微生物学方法包括对样本进行连续稀释，以降低微生物密度，从而在培养皿上获得更好的菌落分离效果。随后将样本及其系列稀释液划线接种于非特异性、非选择性培养基上，例如Luria-Bertani琼脂（LBA）¹⁵、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）¹⁶、胰蛋白胨酵母提取物琼脂（TYEA）^17,18,19或营养琼脂（NA）²⁰，这些培养基支持多种细菌的生长。由于需要培养多种微生物，因此在采样和处理过程中采用非选择性富集方法。划线法或涂布法可将微生物悬浮液均匀分布在琼脂表面²¹，从而使样本中存在的不同微生物物种形成独立的菌落。在20–37 °C下培养2–7天后，根据菌落形态进行计数和区分。细菌菌落的形态学表征基于色素、形状、隆起度、边缘、透明度和表面特征进行。在最高稀释度下获得的单个分离良好的菌落需转接至新鲜琼脂平板进行纯培养，以获得纯种微生物。菌落的纯度通过细胞形态的一致性及革兰染色反应的一致性来确认。此外，还可通过多种生物化学或分子检测方法进一步验证菌落纯度²²。分离得到的纯培养菌株可短期保存于4 °C的琼脂斜面，或长期保存于-80 °C的冷冻保护剂中（如甘油与培养基比例为20:80或50:50）²³。

在本实验方案中，我们报告了一种从Speleomantes属洞穴蝾螈的皮肤微生物群中分离细菌的最佳实践方法。这类蝾螈为完全陆生的两栖动物，可生存于地表及地下环境中²⁴。鉴于目前文献中尚无普遍适用的标准操作流程，本研究旨在建立一套适用于此类陆生两栖动物皮肤微生物群样本采集与保存的最佳实践方案。为验证该方案，我们以意大利洞穴蝾螈（Speleomantes italicus）为模型，从意大利阿布鲁佐地区的一个洞穴种群中采集了12个个体。个体通过手工捕捉，并在其背部、腹部及体侧反复擦拭（至少5次）。所用拭子随后浸入无菌蒸馏水中，再分别置于含或不含甘油补充的生理盐水（0.9% NaCl）溶液中。样本转移至实验室后，在不同条件下进行保存测试：室温（未控温）、4 °C 和 -20 °C，持续10天。采用基于培养的方法，在通用及半选择性培养基（LBA、TSYEA、TSA、NA）上对可培养的微生物群落进行比较分析。

方案

本方案介绍了获取和处理Speleomantes皮肤样本的最佳实践，旨在通过可培养的微生物学方法分离细菌菌株。后续步骤中所需的材料列于材料表中。本方案遵循意大利环境部授权文件（PNM 74554，2024年4月22日）所规定的DPR 357/97号法令第11条关于动物护理的指导原则。

1. 培养基制备

1. 根据培养基类型（LBA、TSYEA、TSA、NA 或其他培养基），计算并称取所需量的培养基粉末（具体用量参见产品说明书）。
2. 按照说明书要求，将粉末成分溶解于蒸馏水中。根据培养基种类及购买产品的不同，可能需要加热煮沸。
3. 待成分完全溶解后，加水定容至最终体积，并调节 pH 值。若 pH 值高于或低于目标值，应使用说明书推荐的溶液进行调整。 通常使用 HCl 溶液降低 pH，NaOH 溶液升高 pH ， 分别进行调节。
4. 加入琼脂（2% w/v），加热至 95 °C，并煮沸约 1 分钟，使琼脂完全溶解，随后进行高压灭菌。
5. 按照说明书要求，对培养基进行高压灭菌处理。常见的灭菌条件为 121–134 °C，持续 15–30 分钟。
6. 灭菌后，将琼脂培养基冷却至约 45–50 °C，在已灭菌的超净工作台内倒入无菌培养皿中。
7. 待培养基凝固后，根据培养基类型和配制日期对平板进行标记。

2. 样品采集

1. 用无菌蒸馏水冲洗蝾螈皮肤（属 Speleomantes），以去除暂时性微生物群落。
2. 使用无菌棉签在试管中采集两栖动物的皮肤拭子。轻轻擦拭皮肤表面，以收集微生物样本，同时避免对个体造成伤害。
   1. 将浸有无菌蒸馏水的棉签在个体全身每侧（包括所有四肢末端）各擦拭五次（即来回五次往复运动）进行取样。
      注意：不建议添加任何添加剂，因其可能对个体造成伤害。
   2. 将棉签置于含有生理盐水溶液（0.9% NaCl）并添加20%甘油的试管中。
3. 混合样本与溶液，通过挤压试管并将棉签紧贴管壁旋转，充分搅动棉签（顺时针旋转10次，逆时针旋转10次）。
4. 混合后，将棉签封闭于试管内，并将微生物样本转移至实验室，期间保持样本温度为4 °C，直至进行微生物分析。
   注意：所有操作步骤均需为每个个体更换新的无菌器材和手套，以避免交叉污染，并防止操作人员暴露于生物或化学污染物中。

3. 接种与培养

1. 处理前将微生物样品充分混匀。
2. 用生理盐水（0.9% NaCl）对皮肤样品进行系列稀释，稀释梯度从10^-1至10^-6。
3. 取100 µL原始样品及各梯度稀释液接种至已制备的琼脂平板上。使用无菌L型涂布棒，将样品在琼脂培养基表面均匀涂布，注意避免用力过大而损伤琼脂。
4. 将接种后的平板倒置于20–25 °C培养箱中培养3–5天。该温度范围有利于生长栖居于两栖动物皮肤的多种环境嗜中温及嗜冷细菌。
   注意：所有操作均在已灭菌的超净工作台内使用无菌材料进行。每个实验单元设置五个独立重复。由于起始菌密度未知且不可预测，涵盖较宽的稀释范围始终是有益的。

4. 菌株纯化与鉴定

1. 孵育后，选择具有不同形态特征的细菌菌落进行进一步分析。
   1. 首先，选择分离良好的菌落，以避免污染或重叠，并避开菌落可能融合的密集区域。此外，选择在外观上存在差异的菌落（如颜色、大小、形状、边缘、表面或质地），以确保采样到潜在的不同物种或菌株。
      注意：此步骤对于选择皮肤微生物群中不同的可培养细菌菌株至关重要。
2. 对所选菌落进行再培养。
   1. 使用接种环将原始琼脂平板上分离良好的单个菌落无菌转移至新的琼脂平板上，划线分离后在适宜条件下孵育。
   2. 在多个新鲜琼脂平板上重复此步骤，直至获得每个细菌分离株的纯培养物，且分离出的菌落形态一致。使用选择性培养基和通用培养基重复再培养过程。
      注意：结合无菌操作、肉眼及显微镜检查以及分子鉴定方法，可确保获得无污染的菌株。
3. 通过显微镜观察（5x 至 100x 物镜）、革兰染色反应性（菌落固定、染色与观察）以及生化试验（如过氧化氢酶、氧化酶、脲酶和糖发酵试验）来检测微生物培养物的纯度^21,25。
   注意：纯培养物应表现出一致的菌落形态、稳定的显微特征以及可重复的生化特性。
4. 进行分子鉴定。
   1. 从纯化的细菌菌落中提取DNA，并对16S rRNA基因进行测序以鉴定细菌种类。使用细菌通用引物对16S rRNA基因进行PCR扩增，随后测序，并与GenBank等数据库中的已知序列进行比对²⁶。
5. 建立生物样本库培养物。
   1. 通过将纯培养物接种至非选择性培养基并观察是否有杂菌生长，检测其无菌性。将无菌培养物保存以用于中长期使用。
      注意：标准保存方法包括在选择性培养基斜面上划线后于室温保存；将培养物悬浮于由选择性培养基与甘油（20:80 或 50:50）配制的保存液中；或采用液体培养物冻干（冷冻干燥）后于 -80 °C 冷冻保存。

结果

实验方法的工作流程如图1所示。

图1：两栖动物皮肤样本的采样、处理与加工工作流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

该方案的第一个关键步骤是使用无菌手套和拭子，按照动物伦理要求从两栖动...

讨论

我们建立了一种从两栖动物皮肤微生物群中获取可培养细菌群落的最佳实践方案，并以Speleomantes italicus为例进行了演示。如上述应用所示，为成功分离两栖动物皮肤中的微生物，必须采取多个关键步骤。采集过程应采用轻柔的拭子技术并使用无菌材料，这对于获取足量的微生物样本并避免污染至关重要。将拭子置于添加甘油的生理盐水中，并在4 °C条件下运输和保存，是维持微生物活性直至进一步分析的必要条件。接种与培养是关键环节，需采用适当的稀释和划线方法，以便在琼脂平板上分离出不同的微生物物种³³。20–25 °C的培养温度有助于促进定植于两栖动物皮肤上的微生物生长，同时减少不同物种之间的竞争。菌落的选择与纯化同样是至关重要的步骤。继代培养对于维持细菌菌株的纯度必不可少，这是后续分析（包括分子鉴定）的前提条件。此外，建立无菌培养物需要在继代培养和保存过程中严格保持无菌状态，因为纯培养物对于科学研究、实际应用以及生物保藏均具有重要意义³⁴。

拭子采样技术...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
劳里亚-贝尔塔尼琼脂	Merk Millipore	L3027
胰蛋白胨大豆琼脂	Merk Millipore	22091
胰蛋白胨大豆酵母提取物琼脂	Merk Millipore	17221
营养琼脂	Merk Millipore	70148
甘油溶液	Merk Millipore	49781