使用 体内 高效质粒构建组装

摘要

体内组装是一种不依赖连接酶的克隆方法，该方法依赖细菌内在的DNA修复酶通过同源重组将DNA片段组装在一起。该方案既节省时间又降低成本，所需试剂很少，且克隆效率可高达99%。

摘要

体内 组装（IVA）是一种分子克隆方法，利用细菌中存在的内在酶促进DNA片段间的分子间重组，从而构建质粒。该方法通过将具有15-50 bp同源区域的DNA片段转入常用的实验室 大肠杆菌 菌株及细菌利用不依赖RecA的修复途径将DNA片段组装成质粒。该方法比许多依赖于 体外 转化前质粒的组装 E. coli 菌株。这是因为 体外 方法需要购买专用酶并进行一系列酶促反应，这些反应需要孵育步骤。然而，与之不同的是 体外 方法上，IVA 尚未通过实验被证实能够组装线性质粒。在此，我们分享本实验室所采用的 IVA 方案，用于快速组装质粒，以及在具有不同复制起点和抗生素抗性标记的质粒之间亚克隆 DNA 片段。

引言

分子克隆包含一系列实验室技术，用于构建含有特定重组DNA的质粒¹这些普遍使用的技术常常成为实验流程中的瓶颈²许多分子克隆技术依赖于DNA片段的组装 体外 在转化至宿主菌株之前，通过一系列酶促反应（例如， 大肠杆菌 DH5α）用于扩增^3,4,5,6,7。当 体外 质粒组装方法依赖于酶，而购买或纯化酶既昂贵又耗时。

体内组装（in vivo assembly, IVA）是一种依赖于在合适宿主中进行DNA片段间分子重组的分子克隆方法^8,9,10,11,12....

方案

1. 设计带有同源末端的引物或DNA片段

1. 使用文字处理软件或专业的DNA分析软件对目标质粒进行人工组装。
   注意：通常建议对来自不同来源的DNA片段采用不同颜色进行标注，并突出显示将在后续组装步骤中使用的同源区域。此外，对同源DNA进行颜色编码也有助于确保定向组装。
2. 设计可结合至各DNA片段的引物，并在引物中包含15–50 bp的同源DNA序列（图1）^2,15。
   1. 为提高IVA效率，应确保同源DNA片段的熔解温度在47–52 °C之间²。
      注意：熔解温度可通过在线软件¹⁸或以下公式计算：熔解温度 = 64.9 + 41 × (nG + nC - 16.4)/(nA + nT + nG + nC)，其中n表示序列中G、C、A或T的数目^6,19。
   2. 避免使用具有高度重复序列（如CATCATCATCATCATCAT）的引物，因其可能编码HIS标签并引发不稳定性²⁰

结果

在本研究中，作为 IVA 应用的一个示例，我们遵循所提供的 IVA 操作流程，将 mCherry 开放阅读框重新克隆至质粒 pSU19 的多克隆位点，从而构建出与 pSU19mCherry 完全相同的质粒（图3）¹⁷。根据方案步骤 1.1 和 1.2 设计适用于 IVA 的引物。随后，使用质粒提取试剂盒分别提取 pSU19 和 pSU18mCherry，作为 PCR 扩增质粒骨架和插入 DNA 的模板（方案步骤 2.1）。通过 PCR 扩增 pSU19 质粒骨架（引物对：pSU19_F：TAGGGTACCGAGCTCGAATTC 和 pSU19_R：CCCGGGGATCCTCTAGAGTC），并从 pSU18mCherry 中扩增 mCherry 开放阅读框（引物对 mCherry_F：ctctagaggatccccgggATGGTATCAAAAGGAGAGGAAG 和 mCherry_R：gaattcgagctcggtaccctaTTATCATTACTTGTACAGTTC；mCherry 引物中的小写字母序列表示与用于扩增 pS.......

讨论

成功进行IVA克隆最关键的步骤是DNA片段和引物的设计。当同源片段设计长度至少为15 bp，且熔解温度约为47–52 °C时，IVA效率显著提高。已有详细研究报道了IVA片段设计的优化方案¹⁶提高克隆效率的另一个重要步骤是在PCR扩增过程中尽可能使用少量的模板DNA。为进一步减少模板DNA的残留，我们对循环结束后的PCR产物进行处理，使用 DpnI 用于切割甲基化模板 DNA。这可以显著减少筛选阳性克隆所需的工作量。根据我们的经验，在 DpnI处理中，每个转化只需筛选1-2个菌落；无需 Dpn在I处理中，我们需要对每次转化筛选5-10个菌落。

尽管我们及其他研究者已报道IVA克隆可产生大量菌落形成单位^16,17，但转化平板上仍可能无菌落生长。根据我们的经验，增加转入感受态细胞的DNA量（尤其是使用较大质粒骨架时）和/或增加所用感受态细胞的体积，均可提高转化效率。如果.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 kb Plus DNA 标准品	FroggaBio	DM015-R500	DNA 分子量标记物
AccuReady M 单通道 0.5-10 µL	Bulldog Bio	BPP020	用于液体转移的移液器
AccuReady M 单通道移液器套装	Bulldog Bio	BPK100	用于液体转移的移液器
琼脂	BioShop Canada	AGR003.1	培养基凝固剂
琼脂糖	Biobasic	D0012	用于制备 DNA 电泳用琼脂糖凝胶
Biometra TOne	Analytikjena	846-2-070-301	PCR 仪
玻璃培养管盖	Fisher Scientific	14-957-91	可重复使用的玻璃培养管盖
DNA 引物	Integrated DNA Technologies	N/A	在 PCR 反应中结合并扩增模板 DNA
DpnI	New England Biolabs	R0176S	PCR 扩增后切割甲基化的模板 DNA
EcoRI	New England Biolabs	R3101L	限制性内切酶，附带相应缓冲液
Eppendorf 微量离心管 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300	微量离心管，1.5 mL，锥底，聚丙烯材质，带平盖，模制刻度及磨砂书写区
溴化乙锭	Fisher Scientific	AAL0748203	DNA 可视化/嵌入剂，有毒
EZ-10 旋转柱质粒 DNA 小量提取试剂盒	Biobasic	BS614	从过夜培养的细菌中分离质粒 DNA
GelDoc Go-Gel 成像系统	Bio-Rad	12009077	DNA 凝胶成像系统
玻璃培养管	Fisher Scientific	14-925E	玻璃培养管
myGel Mini 电泳系统	Sigma-Aldrich	Z742288	用于凝胶电泳的系统
NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	测定 DNA 浓度
DNA 测序用 PCR 产物纯化试剂盒	Biobasic	BT5100	纯化 PCR 产物
培养皿	Sarstedt	82.1473.011	培养皿 92 × 16 mm，聚苯乙烯材质，透明，带通风槽
移液器吸头，1000 µL	Sarstedt	70.305	适用于 100–1000 µL 的移液器吸头
移液器吸头，2.5 µL	Sarstedt	70.3010.265	适用于最大 2.5 µL 的移液器吸头
移液器吸头，20 µL	Sarstedt	70.3020.200	适用于最大 20 µL 的移液器吸头
移液器吸头，200 µL	Sarstedt	70.3030.020	适用于 1–200 µL 的移液器吸头
盐（NaCl）	Fisher Scientific	S271-10	细菌培养基组分（10 g/L）
带平盖的单个 0.2 mL PCR 管	FroggaBio	TF-1000	PCR 管
胰蛋白胨（细菌学级）	BioShop Canada	TRP402.5	细菌培养基组分（10 g/L）
VeriFi 高保真 DNA 聚合酶	PCR Biosystems	PB10.42-01	高保真聚合酶，购买时附带含 Mg2+ 的 PCR 缓冲液和 dNTPs
Xba I	New England Biolabs	R0145S	限制性内切酶，附带相应缓冲液
酵母提取物	BioShop Canada	YEX401.205	细菌培养基组分（5 g/L）