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方法文章

使用 体内 高效质粒构建组装

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DOI：

10.3791/67870

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2025年2月7日

 , 
1College of Medicine, Department of Biochemistry, Microbiology, and Immunology, University of Saskatchewan

本文内容

摘要

体内组装是一种不依赖连接酶的克隆方法，该方法依赖细菌内在的DNA修复酶通过同源重组将DNA片段组装在一起。该方案既节省时间又降低成本，所需试剂很少，且克隆效率可高达99%。

摘要

体内 组装（IVA）是一种分子克隆方法，利用细菌中存在的内在酶促进DNA片段间的分子间重组，从而构建质粒。该方法通过将具有15-50 bp同源区域的DNA片段转入常用的实验室 大肠杆菌 菌株及细菌利用不依赖RecA的修复途径将DNA片段组装成质粒。该方法比许多依赖于 体外 转化前质粒的组装 E. coli 菌株。这是因为 体外 方法需要购买专用酶并进行一系列酶促反应，这些反应需要孵育步骤。然而，与之不同的是 体外 方法上，IVA 尚未通过实验被证实能够组装线性质粒。在此，我们分享本实验室所采用的 IVA 方案，用于快速组装质粒，以及在具有不同复制起点和抗生素抗性标记的质粒之间亚克隆 DNA 片段。

引言

分子克隆包含一系列实验室技术，用于构建含有特定重组DNA的质粒1这些普遍使用的技术常常成为实验流程中的瓶颈2许多分子克隆技术依赖于DNA片段的组装 体外 在转化至宿主菌株之前，通过一系列酶促反应（例如， 大肠杆菌 DH5α）用于扩增3,4,5,6,7。当 体外 质粒组装方法依赖于酶，而购买或纯化酶既昂贵又耗时。

体内组装（in vivo assembly, IVA）是一种依赖于在合适宿主中进行DNA片段间分子重组的分子克隆方法8,9,10,11,12。该方法的基础是观察到常用的recA-型E. coli克隆菌株能够介导单链引物与经限制性内切酶切割的质粒之间的分子间重组13。20世纪90年代已有研究报道利用PCR生成同源DNA末端，以在E. coli中实现质粒组装，该方法被称为重组PCR（recombination PCR）3,14。据报道，重组PCR的效率约为50%14。然而，该方法并未被广泛采用，可能是因为引物成本较高，以及使用保真度较低的DNA聚合酶扩增大片段DNA时容易引入非预期突变。在20世纪90年代，这些缺点较为显著，而采用体外克隆方法（如限制性内切酶介导的克隆）则可避免这些问题。

近年来，引物成本不断降低，新型商用聚合酶也提高了PCR扩增的保真度。因此，重组PCR被重新评估为一种快速且经济高效的分子克隆技术，并被重新命名为IVA2,9,15,16。随着可行性的提高，IVA技术得到进一步探索，并经过优化使克隆效率高达99%16。优化研究确定了同源DNA的一些特征，例如碱基对数量和熔解温度，这些因素可最大化in vivo重组效率2,16。进一步分析表明，IVA可高效组装多达6个DNA片段，片段大小范围从150 bp至7 kbp15。此外，我们课题组近期利用IVA成功构建了一系列含有不同抗生素抗性盒和复制起点的质粒17。在该研究中，IVA克隆效率极高（71–100%），且每个质粒仅需检测少量克隆（n = 2）即可获得理想结果17。本文中，我们详细描述了本实验室所使用的IVA实验方案。

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方案

1. 设计带有同源末端的引物或DNA片段

  1. 使用文字处理软件或专业的DNA分析软件对目标质粒进行人工组装。
    注意：通常建议对来自不同来源的DNA片段采用不同颜色进行标注，并突出显示将在后续组装步骤中使用的同源区域。此外，对同源DNA进行颜色编码也有助于确保定向组装。
  2. 设计可结合至各DNA片段的引物，并在引物中包含15–50 bp的同源DNA序列（图1）2,15。
    1. 为提高IVA效率，应确保同源DNA片段的熔解温度在47–52 °C之间2。
      注意：熔解温度可通过在线软件18或以下公式计算：熔解温度 = 64.9 + 41 × (nG + nC - 16.4)/(nA + nT + nG + nC)，其中n表示序列中G、C、A或T的数目6,19。
    2. 避免使用具有高度重复序列（如CATCATCATCATCATCAT）的引物，因其可能编码HIS标签并引发不稳定性20。若应用中需要最终形成重复氨基酸序列（例如插入poly-HIS标签），可采用交替密码子（如CATCACCATCATCACCAC）以降低核酸序列的重复性。
      注意：引物可从任意偏好的供应商订购。若DNA片段将通过合成获得，应将同源末端整合至合成的DNA片段中。

2. 扩增含有同源末端的DNA产物

  1. 使用标准的市售DNA提取试剂盒或碱裂解法分离质粒DNA或基因组DNA模板6,17。
  2. 在PCR反应中，使用来自步骤2.1的模板DNA和含有同源区域的引物（步骤1.2），并采用市售的高保真DNA聚合酶。为减少下游反应中的模板DNA残留，每个PCR反应中应使用少量模板DNA（20 pg–1 ng）。请参考制造商提供的说明书，确定酶特异性的PCR反应体系组分及推荐的PCR循环条件。随后进行PCR反应。
    1. 配制PCR反应体系（50 µL），用于扩增图2所示的DNA片段，体系中包含100 µM dNTPs、每种DNA引物各0.2 µM、模板DNA（pSU19为50 pg，pSU18mCherry为1 ng）、含Mg2+的1× PCR反应缓冲液（终浓度为2 mM）以及1 U高保真DNA聚合酶。
    2. 采用降落PCR（touchdown PCR）循环程序扩增pSU19和mCherry（图2）。初始变性条件为95 °C、5分钟，随后进行10个循环：95 °C变性15秒，退火温度从55 °C开始每循环降低0.5 °C、持续15秒，72 °C延伸1分钟；接着进行额外20个循环：95 °C变性15秒，50 °C退火15秒，72 °C延伸1分钟。最后在72 °C延伸10分钟以完成PCR循环。
      注：若需扩增质粒骨架，应根据分子量调整模板DNA用量：每50 µL PCR反应体系中，质粒DNA用量约为20 pg/1 kbp（如pSU19使用50 pg）。此外，应调整PCR循环次数以尽量减少扩增过程中引入的突变：扩增质粒骨架时，仅需20–25个PCR循环即可。
  3. PCR反应完成后，取部分反应产物（2 µL），加入上样染料（至1×浓度），通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段21。使用紫外（UV）或LED透射成像仪观察琼脂糖凝胶中迁移的DNA片段。判断PCR产物是否单一，并与DNA分子量标记物比较，确认其分子量是否符合预期（图2）。若未观察到正确分子量的PCR产物，请参考制造商建议优化PCR反应条件。
    注：若PCR产物不单一，但存在一条丰度较高的、分子量符合预期的DNA条带，则可避免进行额外的PCR反应。
  4. 若琼脂糖凝胶中出现多条DNA条带，应从凝胶中切下对应于预期分子量的DNA条带，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该DNA片段。
  5. 为去除PCR产物中甲基化的模板DNA，直接向反应管中加入1 µL DpnI限制性内切酶。将反应体系在37°C孵育15分钟至过夜。
    注：此步骤为可选，但强烈建议执行，以减少模板DNA在后续实验中的残留。然而，若PCR反应中使用的模板DNA浓度极低，则可省略此步骤。
  6. 使用核酸纯化试剂盒去除酶反应残留的酶、盐类、引物二聚体及其他不需要的低分子量DNA副产物。
    注：若DNA片段为化学合成获得，则可跳过步骤2.1–2.6。
  7. 通过分光光度法或凝胶电泳估测法测定纯化后DNA片段的浓度。

3. 体外激活（图3）

  1. 计算每个 IVA 反应所需的 DNA 量（建议使用 25–50 ng 质粒 DNA）。对于分子量较高的质粒，应使用更多的质粒 DNA（例如，对于 2.3 kbp 的质粒，每个反应使用 25 ng 质粒 DNA；当质粒为 9 kbp 时，每个反应使用 50 ng）。计算反应所需的插入片段 DNA 体积；使用质粒 DNA 与插入片段 DNA 的摩尔比为 1:3 或 1:5。
    注：可使用在线生物计算工具或以下提供的公式来计算双链 DNA 片段的摩尔量，并确定各 DNA 片段的摩尔比。
    我们使用以下公式计算双链 DNA 片段的摩尔量：pmol =（质量，单位为 ng）× 1,000 /（碱基对数 × 650 道尔顿）。此外，摩尔比可通过以下公式计算：插入片段质量（g）= 所需插入片段/质粒摩尔比 × 质粒质量（g）× 插入片段长度与质粒长度之比6。
  2. 将计算所得体积的质粒 DNA 和插入片段 DNA 加入预冷的 1.5 mL 微量离心管中，并置于冰上保存。
  3. 将第 3.2 步中的质粒与插入片段 DNA 混合物转移至一份解冻的 recA- 化学感受态 E. coli（例如 E. coli DH5α；22）中（体积为 25–100 µL）。
    注：所用感受态细胞的体积取决于质粒与插入片段 DNA 混合物的体积；该混合物体积不应超过感受态细胞体积的 10%。
  4. 进行热激转化23。
    1. 将化学感受态 E. coli 与 DNA 的混合物在冰上孵育 30 分钟。
    2. 转移至 42 °C 水浴中 1 分钟，然后将离心管放回冰上 2 分钟。
    3. 无菌操作向管中加入 LB 培养基，使总体积达到 1 mL。
    4. 将 1 mL 混合液转移至玻璃培养管中，置于摇床培养箱中，设置温度为 37 °C、转速为 220 rpm，或根据细菌菌株和/或质粒推荐的温度（通常为 25 °C–37 °C）进行恢复培养，以促进质粒编码的抗生素筛选标记的表达。
  5. 细胞恢复培养 30 分钟至 1 小时后，取转化反应液的一部分（100 µL，总量为 1,000 µL）接种于固体选择性培养基上，并用无菌涂布棒将液体均匀涂布于琼脂平板表面。其余转化后的细胞通过离心（13,000 × g，1 分钟）收集，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 µL 无菌培养基中，如上所述接种至固体选择性培养基上。静置 30 分钟使液体完全渗入固体培养基，将培养皿倒置，于推荐温度下（针对细菌菌株和/或质粒）在培养箱中过夜培养。

4. 筛选正确的质粒构建产物

  1. 孵育后（步骤 3.5），从孵箱中取出培养皿，若每个培养皿上存在多个分离的细菌菌落，则通过直接计数法统计菌落数量。选择若干菌落（1–10 个）进行筛选，以确定其是否含有预期组装的质粒。
    1. 将添加了适当抗生素的无菌培养基转移至无菌培养管（玻璃或塑料）中。用无菌接种针或接种环接触单个菌落，将菌体接种至培养管中的培养基内。将培养管置于摇床孵箱中，在适合该细菌菌株和/或质粒的推荐温度下（通常为 25 °C 至 37 °C）振荡培养 16–18 小时。
  2. 次日，通过碱裂解法6或根据制造商说明书使用市售质粒提取试剂盒，从细菌培养物中分离质粒 DNA。
  3. 确定质粒是否正确组装。
    1. 通过分光光度法或凝胶估测法测定所提取质粒的 DNA 浓度。
    2. 取一份质粒 DNA 样品（50–150 ng）进行诊断性限制性酶切反应（终体积 10 µL）。根据预期在组装后质粒 DNA 上的切割位点选择限制性内切酶。
      注意：建议进行两个独立的反应：（1）使用预期在质粒上单一位点切割的限制性内切酶处理质粒 DNA；（2）使用两种预期可切出插入 DNA 片段全部或部分区域的限制性内切酶处理质粒 DNA。限制性内切酶为市售产品，应按照制造商说明书使用。
    3. 限制性酶切反应完成后，加入上样染料（至 1× 浓度），将全部反应混合物上样至琼脂糖凝胶，通过琼脂糖凝胶电泳21分离 DNA 片段。使用紫外光或 LED 透射仪观察在琼脂糖凝胶中迁移的 DNA 片段。将酶切后的 DNA 片段与分子量标准参照物比较，判断其分子量是否符合预期（图 4）。记录具有预期酶切图谱的质粒（称为阳性克隆）；丢弃不含预期酶切图谱的质粒所在的培养管（称为阴性克隆）。
  4. 为确认阳性克隆具有预期的核苷酸序列，送检部分阳性质粒克隆样品进行测序。
    注意：建议进行全质粒测序（例如纳米孔测序）。

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结果

在本研究中，作为 IVA 应用的一个示例，我们遵循所提供的 IVA 操作流程，将 mCherry 开放阅读框重新克隆至质粒 pSU19 的多克隆位点，从而构建出与 pSU19mCherry 完全相同的质粒（图3）17。根据方案步骤 1.1 和 1.2 设计适用于 IVA 的引物。随后，使用质粒提取试剂盒分别提取 pSU19 和 pSU18mCherry，作为 PCR 扩增质粒骨架和插入 DNA 的模板（方案步骤 2.1）。通过 PCR 扩增 pSU19 质粒骨架（引物对：pSU19_F：TAGGGTACCGAGCTCGAATTC 和 pSU19_R：CCCGGGGATCCTCTAGAGTC），并从 pSU18mCherry 中扩增 mCherry 开放阅读框（引物对 mCherry_F：ctctagaggatccccgggATGGTATCAAAAGGAGAGGAAG 和 mCherry_R：gaattcgagctcggtaccctaTTATCATTACTTGTACAGTTC；mCherry 引物中的小写字母序列表示与用于扩增 pS...

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讨论

成功进行IVA克隆最关键的步骤是DNA片段和引物的设计。当同源片段设计长度至少为15 bp，且熔解温度约为47–52 °C时，IVA效率显著提高。已有详细研究报道了IVA片段设计的优化方案16提高克隆效率的另一个重要步骤是在PCR扩增过程中尽可能使用少量的模板DNA。为进一步减少模板DNA的残留，我们对循环结束后的PCR产物进行处理，使用 DpnI 用于切割甲基化模板 DNA。这可以显著减少筛选阳性克隆所需的工作量。根据我们的经验，在 DpnI处理中，每个转化只需筛选1-2个菌落；无需 Dpn在I处理中，我们需要对每次转化筛选5-10个菌落。

尽管我们及其他研究者已报道IVA克隆可产生大量菌落形成单位16,17，但转化平板上仍可能无菌落生长。根据我们的经验，增加转入感受态细胞的DNA量（尤其是使用较大质粒骨架时）和/或增加所用感受态细胞的体积，均可提高转化效率。如果...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

HGB 由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的加拿大研究生奖学金-硕士项目和萨斯喀彻温大学院长博士生奖资助。本研究工作得到了 NSERC 发现基金（RGPIN-2021-03066）、萨斯喀彻温大学启动资金（授予 JLT）以及加拿大创新基金会 John R. Evans 领导者基金（项目编号 42269，授予 JLT）的支持。作者感谢 Eric Toombs 先生提供通过紫外光谱法进行 DNA 定量的实验照片。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 kb Plus DNA 标准品FroggaBioDM015-R500DNA 分子量标记物
AccuReady M 单通道 0.5-10 µLBulldog BioBPP020用于液体转移的移液器
AccuReady M 单通道移液器套装Bulldog BioBPK100用于液体转移的移液器
琼脂BioShop CanadaAGR003.1培养基凝固剂
琼脂糖BiobasicD0012用于制备 DNA 电泳用琼脂糖凝胶
Biometra TOne Analytikjena846-2-070-301PCR 仪
玻璃培养管盖Fisher Scientific14-957-91可重复使用的玻璃培养管盖
DNA 引物Integrated DNA TechnologiesN/A在 PCR 反应中结合并扩增模板 DNA
DpnI New England BiolabsR0176SPCR 扩增后切割甲基化的模板 DNA
EcoRINew England BiolabsR3101L限制性内切酶，附带相应缓冲液
Eppendorf 微量离心管 1.5 mLSarstedt72.690.300微量离心管，1.5 mL，锥底，聚丙烯材质，带平盖，模制刻度及磨砂书写区
溴化乙锭Fisher ScientificAAL0748203DNA 可视化/嵌入剂，有毒
EZ-10 旋转柱质粒 DNA 小量提取试剂盒BiobasicBS614从过夜培养的细菌中分离质粒 DNA
GelDoc Go-Gel 成像系统Bio-Rad12009077DNA 凝胶成像系统
玻璃培养管Fisher Scientific14-925E玻璃培养管
myGel Mini 电泳系统Sigma-AldrichZ742288用于凝胶电泳的系统
NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-W测定 DNA 浓度
DNA 测序用 PCR 产物纯化试剂盒BiobasicBT5100纯化 PCR 产物 
培养皿Sarstedt82.1473.011培养皿 92 × 16 mm，聚苯乙烯材质，透明，带通风槽
移液器吸头，1000 µLSarstedt70.305适用于 100–1000 µL 的移液器吸头
移液器吸头，2.5 µLSarstedt70.3010.265适用于最大 2.5 µL 的移液器吸头
移液器吸头，20 µLSarstedt70.3020.200适用于最大 20 µL 的移液器吸头
移液器吸头，200 µLSarstedt70.3030.020适用于 1–200 µL 的移液器吸头
盐（NaCl）Fisher ScientificS271-10细菌培养基组分（10 g/L）
带平盖的单个 0.2 mL PCR 管FroggaBioTF-1000PCR 管
胰蛋白胨（细菌学级）BioShop CanadaTRP402.5细菌培养基组分（10 g/L）
VeriFi 高保真 DNA 聚合酶PCR BiosystemsPB10.42-01高保真聚合酶，购买时附带含 Mg2+ 的 PCR 缓冲液和 dNTPs
Xba INew England BiolabsR0145S限制性内切酶，附带相应缓冲液
酵母提取物BioShop CanadaYEX401.205细菌培养基组分（5 g/L）

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