本方案提供了一种用于动脉粥样硬化斑块定量分析的综合方法，以促进对动脉粥样硬化机制及进展的深入研究。
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方法文章
动脉粥样硬化小鼠模型中主动脉弓及主动脉根部病变的分离与分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病因，需要对病变的发生和发展进行详细研究。本研究介绍了一种针对广泛使用的动脉粥样硬化小鼠模型——低密度脂蛋白受体基因敲除（Ldlr-/-）小鼠——主动脉弓和主动脉根部病变的分离与组织学分析的完整实验方案。主动脉弓和主动脉根部是动脉粥样硬化病变的关键部位，对其检测对于评估动脉粥样硬化的起始、进展或消退，预测心血管事件风险，以及发现潜在治疗靶点具有重要意义。本方案详细描述了在主动脉弓和主动脉根部定量动脉粥样硬化负荷的方法，包括组织分离、固定、油红O染色、主动脉根部切片、苏木精-伊红（HE）染色、弹力纤维-范吉森（VVG）染色以及图像分析。油红O染色用于测定主动脉弓中的斑块面积，评估动脉粥样硬化的严重程度；主动脉根部的HE染色可显示斑块的组成成分，如脂质核心和纤维帽，有助于评估斑块的稳定性及破裂风险。VVG染色可特异性标记组织中的胶原纤维，进一步揭示斑块的组成及其相关特征。该系统的分析方法为深入理解病变发展机制提供了重要信息，并可能指导预防和治疗动脉粥样硬化的新疗法的开发。
引言
心血管疾病，特别是动脉粥样硬化，已成为全球范围内重要的健康负担和主要死亡原因1,2。动脉粥样硬化是一种慢性进行性炎症性疾病，其特征是脂质在动脉壁中逐渐积聚并形成斑块，最终导致动脉管腔狭窄，甚至斑块破裂，从而引发急性心血管事件，如心肌梗死和脑卒中1,2,3。鉴于其对人类健康的深远影响，迫切需要深入理解动脉粥样硬化的发病机制，并开发有效的治疗策略。
近年来，动物模型在推动我们对动脉粥样硬化理解方面发挥了关键作用。在多种物种中，小鼠因其繁殖速度快、操作方便以及具备先进的遗传操作技术而成为首选模型4,5。特别是低密度脂蛋白受体敲除（Ldlr-/-）小鼠和ApoE-/-小鼠已被广泛用于模拟人类动脉粥样硬化，因为它们表现出与人类相似的病理生理特征4,5,6....
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方案
本研究中使用的所有动物实验方案均经上海体育大学动物实验伦理审查委员会批准。
1. 试剂与解剖工具的准备
- 提前使用高压灭菌器对解剖工具（包括精细剪刀、直头镊子、弯头镊子、弹簧剪刀和大头针）进行灭菌处理。
- 75% 乙醇：将 75 mL 无水乙醇与 25 mL 去离子水（ddH2O）混合。
- 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）：将 0.01 M 的 PBS 粉末溶解于 2 L 去离子水（ddH2O）中。
- 4% 多聚甲醛（PFA）溶液：在通风橱中，将 800 mL 1× PBS 溶液置于磁力搅拌器上加热至约 60 °C。缓慢加入 40 g 多聚甲醛粉末，并持续搅拌。用 1 N NaOH 滴定至完全溶解。冷却至室温后，用 1× PBS 定容至 1 L，过滤，并调节 pH 至 7.2–7.4。
注意：PFA 为危险化学品，操作时需谨慎，并严格遵守安全操作规程。 - 油红 O 储存液：将 2.5 g 油红 O 粉末溶解于 500 mL 100% 异丙醇中，密封于棕色瓶内，长期储存时置于 4 °C 冰箱中。
注意：异丙醇为有毒有害化学品，为确保健康与安全，操作时必须佩戴必要的个人防护装备（PPE），包括手套。 - 油红 O 工作液：按 3:2 的比例将储存液与无菌去离子水（ddH<....
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结果
代表性结果展示了在动脉粥样硬化小鼠模型中，主动脉弓和主动脉根部病变的分离与分析技术的应用。这些结果明确证明了该技术在识别和表征动脉粥样硬化病变方面的能力。例如，采用特异性染色（如油红O）的组织学图像可突出显示脂质积聚，而苏木精-伊红（H&E）染色则揭示了动脉粥样硬化病变的整体形态，包括动脉壁结构、脂质核心的存在以及坏死区域。通过对H&E染色切片的分析，可评估病变发展的程度以及主动脉的结构变化，从而全面了解斑块进展和组织重塑过程。
在本实验方案中，我们分析了喂食西方饮食（WTD）4个月的12周龄C57 Ldlr基因敲除小鼠以及喂食普通饲料的Ldlr-/-小鼠的动脉粥样硬化病变程度，后者作为对照组。
经过12周的普通饮食和西方饮食喂养后，西方饮食组的Ldlr基因敲除小鼠体重显著高于对照组。此外，西方饮食组的小鼠血脂水平也发生变化，血浆甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平显著升高，TG和TC通过从小鼠尾部血液中采集样本并采用酶联免疫吸附测定法检测得到（.......
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讨论
本文详细介绍了载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉取样方法及斑块的定量分析。
解剖操作的精确性是最大的技术挑战 体内 在动脉粥样硬化小鼠模型中进行主动脉剥离。根据我们的经验，关键要点如下：（1）使用PBS冲洗动脉内所有血液，以增强主动脉弓分支与周围血管脂肪组织的对比度；（2）保持耐心。由于小鼠主动脉体积较小，操作必须在体视显微镜下进行，并使用高质量的显微剪刀和镊子，以最大限度减少操作误差；（3）必须确保剥离起始位置准确且方向正确，以避免对血管造成切割或损伤。
关于小鼠主动脉油红O染色，分离的小鼠主动脉在正式染色前应于显微镜下去除周围脂肪组织，并须保持组织完整性，以避免影响染色结果。油红O染色过程需精确控制染色时间；染色时间过长或过短均可能影响染色效果，导致结果不准确。
在小鼠主动脉根部包埋过程中，需要控制组织的脱水时间，以避免切片时组织出现裂纹。主动脉根部切片应保持厚度均匀，以确保染色均匀，过薄或过厚的切片均可能影响观察效果。同时，在显微镜下观察时，需准确定位三.......
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致谢
本工作得到了上海运动与代谢健康前沿科学研究中心、上海体育大学运动与公共健康研究项目（0831）、上海高校青年教师培养资助计划（A2-0213-22-0058-5）以及上海市科学技术委员会优秀学术带头人计划（21XD1403200）对刘龙华的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 黏附性显微镜载玻片（25×75毫米 | CITOTEST | 货号# 80312-3161 | |
| 包埋盒 | CITOTEST | 货号 80106-1100-16 | |
| 伊红染色液 | Beyotime | 货号 C0109 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 货号# 10009218 | |
| 苏木精染色液 | Beyotime | 货号 C0107 | |
| 低剖面一次性刀片 | Leica | 货号 14035838925 | |
| 显微镜盖玻片(24×50 mm | CITOTEST | 货号 10212450C | |
| 中性树胶封片剂 | Sango Biotech | 货号 E675007-0100 | |
| 油红O粉末 | Sigma-Aldrich | Cat# 1320-06-5 | |
| 石蜡与微晶蜡 | 国药集团化学试剂有限公司 | 货号 69019461 | |
| 多聚甲醛 | Servicebio | 货号 G1101 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS，粉末） | Servicebio | 货号 G0002-2L | |
| Ponceau S 染色液 | EveryLab | 货号# FM024 | |
| 维多利亚蓝’B | Aladdin | Cat# 2580-56-5 | |
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | Cat# 104-81-4 |
参考文献
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 56(2019).
- Herrington, W., Lacey, B., Sherliker, P., Armitage, J., Lewington, S. Epidemiology of atherosclerosis and the potential to reduce the global burden of atherothrombotic disease. Circ Res. 118<....
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重印与许可
