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方法文章

动脉粥样硬化小鼠模型中主动脉弓及主动脉根部病变的分离与分析

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DOI：

10.3791/67875

⸱

2025年2月14日

 ,  , 
1School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了一种用于动脉粥样硬化斑块定量分析的综合方法，以促进对动脉粥样硬化机制及进展的深入研究。

摘要

动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病因，需要对病变的发生和发展进行详细研究。本研究介绍了一种针对广泛使用的动脉粥样硬化小鼠模型——低密度脂蛋白受体基因敲除（Ldlr-/-）小鼠——主动脉弓和主动脉根部病变的分离与组织学分析的完整实验方案。主动脉弓和主动脉根部是动脉粥样硬化病变的关键部位，对其检测对于评估动脉粥样硬化的起始、进展或消退，预测心血管事件风险，以及发现潜在治疗靶点具有重要意义。本方案详细描述了在主动脉弓和主动脉根部定量动脉粥样硬化负荷的方法，包括组织分离、固定、油红O染色、主动脉根部切片、苏木精-伊红（HE）染色、弹力纤维-范吉森（VVG）染色以及图像分析。油红O染色用于测定主动脉弓中的斑块面积，评估动脉粥样硬化的严重程度；主动脉根部的HE染色可显示斑块的组成成分，如脂质核心和纤维帽，有助于评估斑块的稳定性及破裂风险。VVG染色可特异性标记组织中的胶原纤维，进一步揭示斑块的组成及其相关特征。该系统的分析方法为深入理解病变发展机制提供了重要信息，并可能指导预防和治疗动脉粥样硬化的新疗法的开发。

引言

心血管疾病，特别是动脉粥样硬化，已成为全球范围内重要的健康负担和主要死亡原因1,2。动脉粥样硬化是一种慢性进行性炎症性疾病，其特征是脂质在动脉壁中逐渐积聚并形成斑块，最终导致动脉管腔狭窄，甚至斑块破裂，从而引发急性心血管事件，如心肌梗死和脑卒中1,2,3。鉴于其对人类健康的深远影响，迫切需要深入理解动脉粥样硬化的发病机制，并开发有效的治疗策略。

近年来，动物模型在推动我们对动脉粥样硬化理解方面发挥了关键作用。在多种物种中，小鼠因其繁殖速度快、操作方便以及具备先进的遗传操作技术而成为首选模型4,5。特别是低密度脂蛋白受体敲除（Ldlr-/-）小鼠和ApoE-/-小鼠已被广泛用于模拟人类动脉粥样硬化，因为它们表现出与人类相似的病理生理特征4,5,6,7,8,9。

小鼠的动脉粥样硬化病变可发生在主动脉的多个部位，但尤其容易出现在与血流动力学密切相关的区域，例如主动脉根部、主动脉弓和头臂干，而降主动脉受累程度相对较轻10。为了准确评估小鼠模型中动脉粥样硬化病变的负荷，分析斑块的存在、大小和分期，进而研究不同药物或因素对动脉粥样硬化起始、进展及消退的影响，必须结合组织学染色技术与影像分析方法11。油红O染色是一种成熟的方法，可特异性地染色中性脂质和脂蛋白12，从而直接可视化显示主动脉弓中的斑块形成情况13。与此同时，主动脉根部的苏木精-伊红（HE）染色不仅能够界定斑块区域，还能提供纤维帽和脂质坏死核心等详细的结构特征。这些信息对于评估斑块稳定性以及预测斑块破裂风险至关重要11。综合而言，这些技术有助于全面评估动脉粥样硬化病变的严重程度和进展情况。

本方案以饲喂普通饮食和西方饮食的 C57BL6/J Ldlr-/- 小鼠为例，旨在提供一份详细的分步操作指南，用于通过油红O染色检测主动脉弓以及通过石蜡包埋主动脉根部切片的苏木精-伊红染色结合图像分析，评估小鼠动脉粥样硬化病变负荷。该方案涵盖了主动脉分离与固定、石蜡包埋与切片、染色步骤及图像分析的各个方面，同时纳入了关键步骤的操作细节与注意事项，以确保实验结果的可重复性与可靠性。通过遵循本方案，研究人员可准确、高效地评估治疗干预措施的效果，并深入理解动脉粥样硬化的潜在机制。

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方案

本研究中使用的所有动物实验方案均经上海体育大学动物实验伦理审查委员会批准。

1. 试剂与解剖工具的准备

  1. 提前使用高压灭菌器对解剖工具（包括精细剪刀、直头镊子、弯头镊子、弹簧剪刀和大头针）进行灭菌处理。
  2. 75% 乙醇：将 75 mL 无水乙醇与 25 mL 去离子水（ddH2O）混合。
  3. 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）：将 0.01 M 的 PBS 粉末溶解于 2 L 去离子水（ddH2O）中。
  4. 4% 多聚甲醛（PFA）溶液：在通风橱中，将 800 mL 1× PBS 溶液置于磁力搅拌器上加热至约 60 °C。缓慢加入 40 g 多聚甲醛粉末，并持续搅拌。用 1 N NaOH 滴定至完全溶解。冷却至室温后，用 1× PBS 定容至 1 L，过滤，并调节 pH 至 7.2–7.4。
    注意：PFA 为危险化学品，操作时需谨慎，并严格遵守安全操作规程。
  5. 油红 O 储存液：将 2.5 g 油红 O 粉末溶解于 500 mL 100% 异丙醇中，密封于棕色瓶内，长期储存时置于 4 °C 冰箱中。
    注意：异丙醇为有毒有害化学品，为确保健康与安全，操作时必须佩戴必要的个人防护装备（PPE），包括手套。
  6. 油红 O 工作液：按 3:2 的比例将储存液与无菌去离子水（ddH2O）混合。每次使用前新鲜配制，并使用 0.22 µm 无菌注射器滤器或大号滤纸过滤溶液。
  7. 维多利亚蓝 染色液：将 0.5 g 维多利亚蓝 B 溶解于 100 mL 70% 乙醇中。

2. 主动脉和心脏的分离

  1. 所有小鼠均饲养于SPF级设施中，采用独立通气笼具（IVC），环境条件受控（23.1 ± 1 °C，相对湿度40–50%，12 小时光照/黑暗循环），自由摄食并提供无菌水。每笼饲养3至5只动物，饲喂标准饲料（chow）或含0.2%胆固醇和21.2%脂肪的西方型饮食（WTD）。选择12周龄、体重在25至30 g之间的C57BL6/J LDLr-/-雄性小鼠。在为期12周的研究期间，每4周测量一次体重。使用CO2麻醉箱（70%/30% CO2/O2置换）处死小鼠。
  2. 解剖前，将小鼠仰卧位（腹面朝上）固定于覆盖1–2层吸水纸的泡沫板上，并用针固定四肢。
  3. 用75%乙醇喷洒小鼠腹部，以清洁并润湿毛发。
  4. 用镊子夹住小鼠腹侧皮肤，使用精细剪刀从腹部基部向颈部顶端剪开皮肤。
  5. 切开腹壁后，用镊子提起胸骨，剪断膈肌和肋骨，暴露胸腔。
  6. 移除食管和气管，以便更方便地清洁颈动脉。保留位于腹膜后方的肾脏及脊柱旁的腹主动脉，同时移除肝脏、肺、脾脏、胃肠道和胰腺等器官。在解剖肠系膜动脉时，务必提起肠道，并远离腹主动脉进行切口，以防损伤腹主动脉。
  7. 为获得清晰的观察视野，将小鼠置于体视显微镜下，并调整冷光源使其对准解剖区域。
  8. 将装有10 mL PBS的注射器连接0.45 x 15 (II) RWLB针头，缓慢插入左心室心尖部，并观察主动脉的扩张情况。
  9. 用纸巾轻轻擦拭解剖区域的血液和液体，充分暴露视野。
  10. 胸主动脉易于暴露，可作为解剖突破口：用镊子夹住附着于胸主动脉末端的膈段，使用弹簧剪剪断主动脉与胸壁肌肉之间的结缔组织。
  11. 用镊子轻拉心脏，提起胸主动脉，观察主动脉弓的分支，并沿胸主动脉向上仔细剥离主动脉弓及其分支周围的外膜脂肪和结缔组织。
    注意：操作需谨慎，保持主动脉完整，避免撕裂或损伤，并彻底清除周围脂肪和结缔组织。此步骤需反复练习以达到熟练操作。
  12. 沿胸主动脉向下解剖腹主动脉和髂总动脉。
  13. 在髂总动脉分叉下方1–2 mm处剪断，沿脊柱方向修剪主动脉上的小分支以游离主干，靠近肾脏处分离肾动脉，从远端切断颈部的三条分支血管，最后在靠近心脏处剪断升主动脉。
  14. 在解剖主动脉弓前，将其下方放置一个颜色深、与血管对比度高的小型垫片，并拍摄主动脉弓区域照片。
  15. 修剪心脏组织，沿平行于心房的平面切去下半部分心脏，并固定修剪后的心脏（图1A）。

3. 主动脉弓的固定与预处理

  1. 预先在1.5 mL离心管中配制1 mL的4% PFA溶液。
  2. 将主动脉放入管中，在室温下固定至少24小时。
    注意：主动脉可在4% PFA中保存长达1个月，不影响Oil Red O染色的质量。为保持其正常形态，固定前可将组织置于橡胶片上，此方法较为合适。
  3. 将主动脉转移至含有PBS的培养皿中，防止其干燥。在体视显微镜下，使用镊子和弹簧剪仔细去除解剖过程中未完全清除的残留外膜脂肪，以减少对主动脉内斑块定量分析的干扰。
  4. 使用弹簧剪沿主动脉内侧纵轴小心剪开，随后沿外侧依次剪开主动脉弓的三个分支，直至主动脉弓弯曲处水平，使其充分展开（图1C）。
  5. 此时可直接用于Oil Red O染色，或保存于4% PFA中。

4. 主动脉弓的油红O染色

  1. 将切开的主动脉放入12孔板中。每孔加入1 mL无菌ddH2O，在摇床上洗涤5分钟，重复2次。
  2. 将去除溶液后的12孔板置于通风橱中，风干20分钟，直至无可见水渍。
  3. 每孔加入1 mL新鲜配制的油红O工作液，在摇床上震荡染色20分钟，然后吸去油红O工作液。
  4. 每孔加入2 mL无菌ddH2O，洗涤5分钟，重复此步骤3次。之后将主动脉保存在ddH2O中。
  5. 将主动脉置于载玻片上，在体视显微镜下展平。为增强对比度，可在载玻片下方放置黑色橡胶垫。
  6. 将载玻片置于白纸上以进一步增强对比度，旁边放置标尺，并用相机拍照。为保持主动脉湿润，将处理后的主动脉保存在含有1 mL PBS的1.5 mL离心管中。

5. 主动脉弓的影像分析

  1. 在配备 Image J 软件的计算机上打开捕获的主动脉图像。
  2. 使用矩形框选择包含整个主动脉的区域（例如 450 像素 × 900 像素），并将其保存为新的 .tiff 图像。
  3. 在 Image J 中打开新保存的 .tiff 图像。点击 编辑 > 反转，然后选择图像并点击 类型 > RGB 合成。
  4. 进入图像菜单，点击 图像堆栈 > 堆栈转图像，然后选择对比度最佳的绿色通道图像。
  5. 进入图像菜单，点击 调整 > 亮度/对比度。将最小值调整至约 200，在保持各图像背景相似的前提下尽量降低背景强度，然后点击 应用。
  6. 进入分析菜单并选择 设置测量。勾选 面积、面积分数、限定于阈值 和 显示标签，然后点击 确定。
  7. 进入分析菜单，选择 测量，并将结果复制到电子表格中。
  8. 进入分析菜单，点击 工具 > ROI 管理器，然后用矩形框选主动脉的弓部区域。进入 ROI 管理器，选择 添加 [t]，然后点击 测量。将测得的结果复制到电子表格中。
  9. 根据正态性检验结果，分析各组小鼠的测量面积。p < 0.05 表示差异具有统计学意义。
    注：根据实验设计选择合适的统计学方法。

6. 心脏的石蜡包埋

  1. 切除心脏的心尖部分，并确保切口平直，与瓣膜根部方向对齐（图1B）。
  2. 将每份心脏样本单独放入石蜡包埋盒中，并用铅笔标记包埋盒。
  3. 在通风橱内，将含有组织的石蜡包埋盒置于空容器中，用流水冲洗包埋盒3分钟。
  4. 使用浓度递增的乙醇进行组织脱水，具体如下：50%乙醇处理2小时，75%乙醇处理30分钟，85%乙醇处理30分钟，95%乙醇处理30分钟，100%乙醇处理10分钟。每一步均需更换新的乙醇，重复操作。
  5. 使用二甲苯进行组织透明化处理，具体如下：1:1的二甲苯与乙醇混合液处理20分钟，纯二甲苯处理15分钟，更换二甲苯后重复一次。
  6. 提前在60 °C的烘箱中熔化石蜡。将样本依次用二甲苯与石蜡的混合液处理30分钟，随后用软石蜡处理2小时，再用硬石蜡处理1小时。
    注意：乙醇为易燃且易挥发的有机溶剂。二甲苯具有中等毒性，使用时需做好防护。
  7. 石蜡包埋
    1. 选择合适尺寸的模具，打开电源，并提前预热包埋机。
    2. 向模具中加入熔融石蜡后，用预热过的镊子从包埋盒中取出组织，将其切面朝下放置于模具底部中央位置。
    3. 将模具置于冷冻台上冷却，待石蜡完全凝固后，将标注好的包埋盒盖置于模具上方，并加入适量石蜡填充。
    4. 待石蜡完全冷却固化后，将蜡块从模具中取出，并保存于4 °C冰箱中（图1D）。

7. 主动脉根部的石蜡切片

  1. 清除包埋盒盖周围多余的石蜡，然后将石蜡块牢固地固定在石蜡切片机头部的夹座上。调整石蜡块位置，使其略微偏离切片切割位置，确保石蜡块内的组织切面与刀片的切割刃平行。首次切片时，将切片厚度设为 10 µm，以显露组织位置。
  2. 在显微镜下找到首个切面后，将切片厚度调整为 6 µm，并进行连续切片。在切片机中进行切割、切片并拾取切片，直至在显微镜下可见三个完整的主动脉瓣，此时开始切片前的准备。每只小鼠每隔 6 µm 保留一张切片，并将不同位置的切片置于不同的玻片载体上，例如第 1、11、21、31 张切片，以获得完整的整体视图。
  3. 将切片漂浮于盛有 37 °C 温水的展片台上，使组织展平，然后用载玻片捞取组织。待水分干燥后，将切片置于 42 °C 烤片机中过夜。
  4. 这 8 张切片的平均斑块面积代表每只小鼠主动脉根部斑块面积的数值。染色这些切片后，测量平均斑块面积和斑块面积。

8. 苏木精-伊红染色

  1. 将切片置于60 °C的烘箱中干燥30分钟。在通风橱内，使用染色架，依次将切片放入二甲苯中10分钟（更换二甲苯后重复此步骤一次），再依次放入100%乙醇中5分钟（更换乙醇后重复此步骤一次）、95%乙醇中5分钟、85%乙醇中5分钟和75%乙醇中5分钟。
  2. 用流水冲洗5分钟。将切片浸入苏木精染液中染色8分钟，然后在流水中冲洗。
  3. 用1%盐酸酒精分化数秒，流水冲洗，并在显微镜下观察切片是否变为蓝紫色。
  4. 将切片浸入伊红染色液中染色5分钟。将切片在95%乙醇中浸洗7次，然后在100%乙醇中处理30秒。
  5. 用二甲苯透明至少30秒。用中性树胶封片，在显微镜下拍照，并保存高分辨率图像，建议采用.tiff格式。

9. Verhoeff-Van Gieson（VVG）染色

  1. 对石蜡切片进行常规脱蜡和复水操作，步骤同8.1和8.2节所述。
  2. 用70%乙醇短暂漂洗后，将切片浸入维多利亚蓝B染色液中染色15分钟。
  3. 在95%乙醇中分化数秒，用蒸馏水洗涤切片2次。
  4. 采用滴加法用猩红染色液染色5分钟，随后用100%乙醇进行分化和脱水。
    注意：猩红染色后，避免切片接触任何水分。
  5. 用二甲苯透明至少30秒，用中性树胶封片，并在显微镜下拍照。

10. 主动脉根部斑块的图像分析

  1. 在配备 Image J 软件的计算机上打开图像。选择任意矩形工具框选斑块。
  2. 进入 Image 菜单，点击 Overlay > Add Selection，然后点击 Measure 以测量斑块面积。将测量结果复制到电子表格中。
  3. 根据正态性检验结果，分析各组小鼠中测得的面积差异。p < 0.05 表示差异具有统计学显著性。

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结果

代表性结果展示了在动脉粥样硬化小鼠模型中，主动脉弓和主动脉根部病变的分离与分析技术的应用。这些结果明确证明了该技术在识别和表征动脉粥样硬化病变方面的能力。例如，采用特异性染色（如油红O）的组织学图像可突出显示脂质积聚，而苏木精-伊红（H&E）染色则揭示了动脉粥样硬化病变的整体形态，包括动脉壁结构、脂质核心的存在以及坏死区域。通过对H&E染色切片的分析，可评估病变发展的程度以及主动脉的结构变化，从而全面了解斑块进展和组织重塑过程。

在本实验方案中，我们分析了喂食西方饮食（WTD）4个月的12周龄C57 Ldlr基因敲除小鼠以及喂食普通饲料的Ldlr-/-小鼠的动脉粥样硬化病变程度，后者作为对照组。

经过12周的普通饮食和西方饮食喂养后，西方饮食组的Ldlr基因敲除小鼠体重显著高于对照组。此外，西方饮食组的小鼠血脂水平也发生变化，血浆甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平显著升高，TG和TC通过从小鼠尾部血液中采集样本并采用酶联免疫吸附测定法检测得到（...

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讨论

本文详细介绍了载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉取样方法及斑块的定量分析。

解剖操作的精确性是最大的技术挑战 体内 在动脉粥样硬化小鼠模型中进行主动脉剥离。根据我们的经验，关键要点如下：（1）使用PBS冲洗动脉内所有血液，以增强主动脉弓分支与周围血管脂肪组织的对比度；（2）保持耐心。由于小鼠主动脉体积较小，操作必须在体视显微镜下进行，并使用高质量的显微剪刀和镊子，以最大限度减少操作误差；（3）必须确保剥离起始位置准确且方向正确，以避免对血管造成切割或损伤。

关于小鼠主动脉油红O染色，分离的小鼠主动脉在正式染色前应于显微镜下去除周围脂肪组织，并须保持组织完整性，以避免影响染色结果。油红O染色过程需精确控制染色时间；染色时间过长或过短均可能影响染色效果，导致结果不准确。

在小鼠主动脉根部包埋过程中，需要控制组织的脱水时间，以避免切片时组织出现裂纹。主动脉根部切片应保持厚度均匀，以确保染色均匀，过薄或过厚的切片均可能影响观察效果。同时，在显微镜下观察时，需准确定位三...

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致谢

本工作得到了上海运动与代谢健康前沿科学研究中心、上海体育大学运动与公共健康研究项目（0831）、上海高校青年教师培养资助计划（A2-0213-22-0058-5）以及上海市科学技术委员会优秀学术带头人计划（21XD1403200）对刘龙华的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黏附性显微镜载玻片（25×75毫米CITOTEST货号# 80312-3161
包埋盒CITOTEST货号 80106-1100-16
伊红染色液Beyotime货号 C0109
乙醇国药集团化学试剂有限公司货号# 10009218
苏木精染色液Beyotime货号 C0107
低剖面一次性刀片Leica货号 14035838925
显微镜盖玻片(24×50 mmCITOTEST货号 10212450C
中性树胶封片剂Sango Biotech货号 E675007-0100
油红O粉末Sigma-AldrichCat# 1320-06-5
石蜡与微晶蜡国药集团化学试剂有限公司货号 69019461
多聚甲醛Servicebio货号 G1101
磷酸盐缓冲液（PBS，粉末）Servicebio货号 G0002-2L
Ponceau S 染色液EveryLab货号# FM024
维多利亚蓝’BAladdinCat# 2580-56-5
二甲苯Sigma-AldrichCat# 104-81-4

参考文献

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动脉粥样硬化小鼠模型中主动脉弓及主动脉根部病变的分离与分析
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