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方法文章

利用单核-巨噬细胞试验预测红细胞抗体的临床意义

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DOI：

10.3791/67877

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2025年2月7日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services, Keenan Research Centre, 3Polytech Clermont, 4Department of Medicine, University of Toronto

本文内容

摘要

我们对现有的单核细胞-单层试验（MMA）进行了改进并更新了方法，该试验利用巨噬细胞帮助更好地预测输血医学和免疫学中红细胞同种抗体的临床相关性。该试验被命名为单核细胞-巨噬细胞试验（M-MA）。

摘要

源自骨髓中的单核细胞，巨噬细胞是体积较大的天然免疫细胞，在清除死亡细胞、碎片、肿瘤细胞以及外来病原体方面发挥重要作用。单核细胞与巨噬细胞的吞噬能力差异目前尚未被充分理解。本研究旨在利用改良和更新的经典单核细胞单层法（MMA），比较单核细胞与M1/M2型巨噬细胞对多种调理红细胞的吞噬作用差异。外周血单个核细胞（PBMCs）从供体的血沉棕黄层中分离获得。通过纯化单核细胞，分别诱导生成具有促炎特性的M1型巨噬细胞和具有抗炎特性的M2型巨噬细胞。 体外 培养与极化。收集M1/M2细胞并用于一种类似于MMA的检测，我们称之为M-MA，以解析不同红细胞抗体在临床意义上的吞噬作用。吞噬指数（PI） > 5 被认为是单核细胞吞噬作用具有临床意义的阈值。吞噬指数（PI） > 12 被认为是使用 M1/M2 巨噬细胞时具有临床意义的吞噬作用。与单核细胞和 M1 巨噬细胞相比，M2 巨噬细胞表现出更强的吞噬包被红细胞的能力。同一种弱抗体（抗-S）仅在 M2 巨噬细胞中引起显著的吞噬作用（吞噬指数=43），而在 M1 巨噬细胞（吞噬指数=2）和单核细胞（吞噬指数=0）中则无此现象，该结果已通过多种抗体反复验证。使用 M2 巨噬细胞替代单核细胞可能获得更准确的结果，因为这些细胞具有更强的吞噬活性，从而进一步提升该检测的临床相关性。未来针对红细胞的不同抗体开展进一步研究，包括使用已知具有临床意义的抗体对单核细胞-巨噬细胞吞噬试验（M-MA）进行验证，可能将进一步揭示 M-MA 的应用价值。 有助于预测具有临床意义的红细胞同种抗体及输血反应。该方法将推动输血医学和免疫学领域的发展。

引言

预测输血反应在输血医学领域仍是一项重大挑战。在过去40年中，Tong 和 Branch 开创的单核细胞单层试验（MMA）1,2，已作为有价值的 体外 用于预测输血患者溶血临床结局的细胞检测方法1事实上，该检测在区分具有临床意义与无临床意义的红细胞（RBC）抗体方面发挥了关键作用2尽管单核细胞传统上是该检测中使用的标准白细胞，但我们的研究旨在探索使用单核细胞来源的巨噬细胞作为替代细胞的潜在优势。这些细胞可能增强该检测评估红细胞同种抗体临床相关性的能力。

在传统的混合淋巴细胞培养试验（MMA）中，作为巨噬细胞前体的单核细胞——即在输血不良反应中负责清除和破坏红细胞的免疫细胞——被引入到一个 体外 与红细胞和抗体一起进行的检测1,2,3,4,5,6,7随后通过计数单核细胞内吞噬的红细胞来直观评估吞噬作用。吞噬指数（PI）为 < 每100个单核细胞中吞噬5个红细胞表明该患者发生输血不良反应的风险较低，该抗体被认为在临床上无显著意义4,5,6,7初步实验表明，使用外周血来源的单核细胞可能并不适合用于确定临床意义，因为其吞噬能力低于活化的单核细胞和某些类型的巨噬细胞。

单核细胞是存在于血液、脾脏和骨髓中的一类细胞亚群，在人体中占白细胞总数的10%8。这些细胞通常在血液循环中存留1-2天，随后被不同组织招募，并进一步分化为巨噬细胞8。这一过程通常发生在造血过程中，骨髓生成单核细胞并将其释放入血液循环，最终发育为定居于脾脏和肝脏的组织巨噬细胞2。巨噬细胞作为抵御外来病原体的第一道防线，是一类具有吞噬功能的大型单核细胞，在适应性免疫和固有免疫中均发挥重要作用9。在免疫系统复杂而精细的功能中，对巨噬细胞表型的理解与鉴定仍是一项尚未完全解决的重大挑战。在过去二十年中，巨噬细胞极化概念日益受到重视，近期研究已采用单细胞RNA测序技术来解析巨噬细胞所存在的表型谱系。

经典活化的M1型和M1样巨噬细胞在主要由Toll样受体（TLRs）介导的炎症环境中产生10这些细胞可能与自身免疫性疾病和动脉粥样硬化有关，并表达MHC-II、CD80和CD86等表面标志物11,12抗炎性的M2型及M2样巨噬细胞存在于以Th2型免疫反应为主的微环境中，不表达CD80，但表达CD209和CD206等表面标志物。11,12M1/M2型巨噬细胞可进行培养 体外 从外周血单个核细胞中分离，并通过脂多糖（LPS）及细胞因子（如GM-CSF和IFNγ诱导M1极化，M-CSF和IL-4诱导M2极化）刺激其极化10,12.

本手稿及相关研究旨在证明，与M1型巨噬细胞和单核细胞相比，M2型巨噬细胞在吞噬作用中表现出更高的敏感性。在红细胞同种抗体及输血医学背景下，针对M1/M2型巨噬细胞与单核细胞吞噬活性的研究尚属空白领域。本文介绍了目前正在进行的M1/M2型巨噬细胞制备工作，并将经典的单核细胞单层吞噬试验（MMA）与一种新型的单核细胞-巨噬细胞吞噬试验进行比较，后者采用缩写M-MA以区别于单核细胞试验，从而提升预测价值 体外 吞噬作用检测。

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方案

本研究严格遵守机构关于开展涉及人类受试者的伦理研究的指导方针。伦理批准由加拿大血液服务研究伦理委员会（REB）授予，批准编号为CBSREB#2023.008。本方案的所有步骤均须在生物安全柜中以无菌条件进行。

1. 外周血单个核细胞的分离

  1. 从供体获取装有抗凝剂（ACD）管的全人血。将血液在室温（18 °C–22 °C）下保存，最长不超过36小时。
  2. 将全血ACD管转移至50 mL离心管中（每两支ACD管使用一支50 mL离心管）。加入室温的RPMI-1640完全培养基，定容至终体积为35 mL。
  3. 在新的50 mL离心管中加入15 mL室温密度梯度介质。小心地将稀释后的全血叠加在密度梯度介质上方，尽量减少界面混合，以实现血液成分的最佳分离。
  4. 将分层混合液以700 x g 离心30分钟，关闭刹车。密度梯度离心将混合物自上而下分离为以下几层：血浆、白膜层（含PBMCs）、密度梯度介质、粒细胞和红细胞。 
  5. 吸除并弃去最上层的大部分液体（血浆）。使用移液器小心吸取白膜层（PBMCs），避免带入其他物质。将收集的PBMCs转移至新的50 mL离心管中。
  6. 用pH 7.4的PBS溶液对分离得到的白膜层进行一次洗涤，350 x g 离心10分钟，开启全刹车。
  7. 使用70 µm细胞滤网去除PBMCs中的碎片或不需要的物质，再转移至15 mL离心管中。 随后用pH 7.4的PBS溶液洗涤两次，每次350 x g 离心10分钟，开启全刹车。
  8. 可选步骤：若存在较多红细胞残留，可用ACK裂解缓冲液裂解。根据沉淀物大小加入5–10 mL ACK裂解缓冲液，在室温孵育不超过3分钟。孵育后补加pH 7.4 PBS，350 x g 离心10分钟（开启全刹车），并洗涤一次。仅当红细胞数量过多时执行此步骤。
    注意：为获得更佳结果，应尽量避免使用ACK缓冲液。替代方法是使用水去除未被吞噬的红细胞，即加入水孵育不超过15秒，然后立即加入1X PBS进行洗涤。
  9. 用2–3 mL RPMI-1640完全培养基重悬PBMC沉淀（每支初始ACD管使用0.5 mL）。取PBMC与台盼蓝按1:1比例混合后，用血细胞计数板计数活细胞（未被台盼蓝染色的细胞）。将PBMC重悬于RPMI-1640完全培养基中，调整浓度至2 x 106 个细胞/mL。

M1/M2 巨噬细胞的培养

  1. 第0天 单核细胞接种
    1.  为每种巨噬细胞群体准备一个25 mL细胞培养瓶。向每个瓶中加入5 mL聚-D-赖氨酸（50 mg/500 mL），在超净台中静置至少1小时。用PBS冲洗培养瓶，以去除残留的聚-D-赖氨酸。
    2. 常规方法从血沉棕黄层或患者样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs）（见步骤1）。 当获得PBMC沉淀后，将其重悬于10 mL预热的RPMI-1640完全培养基中。
    3. 计数细胞数量，并使用单核细胞分离试剂盒开始单核细胞分离。使用该试剂盒时，至少需要50 × 106个细胞。
    4. 将细胞重悬于分离缓冲液中，浓度为50 × 106个细胞/mL。根据所获得的细胞数量，使用单核细胞分离试剂盒推荐的紫色（0.25–2 mL）或灰色（0.5–8.5 mL）磁珠。
    5. 按照试剂盒说明书操作，将样本加入所需规格的聚丙烯管（5 mL或14 mL）。按每毫升样本加入50 µL的比例加入富集混合液。
    6. 用移液器反复吹打或涡旋混匀样本，然后在冰浴中于2–8 °C孵育10分钟。 同时，将磁性颗粒涡旋振荡30秒。孵育结束后，按每毫升样本加入100 µL的比例加入磁性颗粒。
    7. 用移液器反复吹打或涡旋混匀样本，然后在2–8 °C孵育5分钟。 根据需要，用刻度移液管补充分离缓冲液至2.5 mL或10 mL。 上下吹打2–3次以充分混匀。 
    8. 将试管（不盖盖子）放入磁架中，室温孵育2.5分钟。 拿起磁架，连续动作将磁架和试管一同翻转，将细胞悬液倒入新的5 mL或14 mL试管中。 
    9. 将细胞重悬于RPMI-1640培养基中并进行计数。此步骤应尽快完成。将1 × 106–5 × 106个单核细胞接种至先前已用聚-D-赖氨酸预包被的25 mL培养瓶中。如有必要，用RPMI-1640补足至5 mL体积。
    10. 在37 °C、5% CO2条件下孵育至少2小时。同时，准备M1和M2分化培养基。分别准备第0天（10 mL）和第4天（2 mL）所需的补充量。
      注：M1分化培养基：RPMI-1640 + 2.5 ng/mL GM-CSF；M2分化培养基：RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF。
    11. 孵育结束后，每瓶用PBS洗涤1次，再用完全RPMI-1640洗涤2次。根据待分化的细胞类型，向每瓶中加入10 mL分化培养基。 
    12. 将细胞在37 °C、5% CO2培养箱中继续分化6天。由于蒸发损失，需在第4天补充分化培养基。
  2. 第4天 补充培养基
    1. 向对应的培养瓶中各加入2 mL相应的分化培养基。 直接将培养基加入培养瓶中。
  3. 第6天 巨噬细胞极化
    1. 准备M1和M2极化培养基。 对于M1极化培养基，准备5 mL M1极化培养基用于加入相应培养瓶。最终浓度应为RPMI-1640中含50 ng/mL IFNγ、10 ng/mL LPS和2.5 ng/mL GM-CSF。最终培养瓶总体积为15 mL（已有10 mL + 新加5 mL），请据此进行计算。
    2. 对于M2极化培养基，准备5 mL M2极化培养基用于加入相应培养瓶。最终浓度应为RPMI-1640中含20 ng/mL IL-4和50 ng/mL M-CSF。注意最终培养瓶总体积为15 mL（已有10 mL + 新加5 mL）；请据此进行计算。
    3. 向每个培养瓶中加入5 mL M1或M2极化培养基。 将巨噬细胞在37 °C、5% CO2培养箱中继续极化至少2天，但不超过4天。
  4. 第8天 收获细胞并进行流式细胞术分析
    1. 在收获M1或M2巨噬细胞前，将上清液收集至1.5 mL离心管中以备后续使用（如需要）。 向培养瓶中加入1 mL细胞解离液，置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育5分钟。
    2. 加入3 mL完全RPMI-1640以终止反应。将液体收集至15 mL离心管中。再向培养瓶中加入3 mL完全RPMI-1640，并使用细胞刮刀将细胞从瓶底刮下。
    3. 将细胞收集至15 mL离心管中。将培养瓶置于显微镜下（10倍物镜），观察确认瓶底无残留贴壁细胞。
    4. 用PBS洗涤细胞两次。将细胞重悬于完全RPMI-1640中，并使用血细胞计数板进行计数。
    5. 为分析M1/M2巨噬细胞的数量与质量，进行流式细胞术检测。每管使用0.5 × 106个细胞，染色方案如下：M1：CD80+ CCR7+ CD209- M2：CD206+ CD209+ CD80-。本实验所用设门策略：#1 前向散射光（FSC-A）对侧向散射光（SSC-A）点图，#2 前向散射光高度（FSC-H）对前向散射光面积（FSC-A）点图用于排除双联体，#3 侧向散射光（SSC-A）对DAPI-A点图用于区分活/死细胞，#4 侧向散射光（SSC-A）对单参数点图或直方图（例如SSC-A对FITC-A），#5 双参数点图（例如FITC-A对APC-A）。

3. 使用M1/M2型巨噬细胞进行MMA

  1. 获得M1/M2型巨噬细胞后，使用血细胞计数板，以1:1比例与台盼蓝染色后进行细胞计数。用RPMI-1640完全培养基将M1/M2型巨噬细胞重悬至浓度为1 × 106 个细胞/mL。
  2. 使用微量移液器将400 μL细胞悬液（含400,000个细胞）接种至8孔腔室载玻片的每个孔中，在37 °C、5% CO2的完全湿化组织培养孵箱中孵育至少1.5小时。每项检测应至少设置三个复孔。
  3. 待测样本及RhD阳性R2R2红细胞的调理作用
    1. 将RhD阳性R2R2红细胞用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤3次，每次以350 × g离心5分钟。我们倾向于使用R2R2型RhD阳性红细胞作为对照，因其D抗原密度较高，但也可使用其他RhD阳性红细胞替代。使用目标抗体对检测样本（如患者或供体）的红细胞进行调理。通过将15 μL压积红细胞加入300 μL抗体混合液中，制备5%红细胞悬液。将15 μL压积R2R2红细胞加入300 μL Anti-D抗体混合液（100 ng/mL）中，对R2R2红细胞进行Anti-D抗体调理。
    2. 在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。孵育过程中需间歇性重新混匀沉降至管底的 红细胞（例如每15分钟涡旋混匀一次）。 调理后的红细胞用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤3次，每次以350 × g离心5分钟。
    3. 为验证红细胞是否完成调理，进行间接抗人球蛋白试验（IAT）。在已结合的初级调理抗体基础上，加入次级调理用抗人抗体。若在30秒内观察到红细胞凝集或聚集现象，则可判断调理成功13。
    4. 将洗涤后的调理RhD阳性R2R2红细胞用RPMI-1640完全培养基重悬至1.25%（v/v）浓度。将15 μL红细胞加入1,200 μL培养基中，使每孔终浓度为1.25%（v/v）。
  4. Fc受体介导的吞噬作用
    1. M1/M2型巨噬细胞孵育1.5小时后，使其充分贴附于腔室载玻片孔底，采用轻柔操作方式吸除上清液并弃去，注意移液枪头仅接触孔的边缘，避免触碰孔中央区域。此时巨噬细胞应已贴壁。切勿用枪头触碰孔中央。
    2. 用pH 7.4的PBS缓冲液轻柔洗涤孔1次。向每个复孔中加入400 μL适当配制的1.25%（v/v）调理红细胞混合液。在37 °C、5% CO2条件下静置孵育2小时，避免扰动。
    3. 孵育结束后，准备两个烧杯，每个烧杯中加入100 mL pH 7.4的PBS缓冲液。
    4. 使用厂家提供的适配器取下8孔腔室。在纸巾上轻拍以去除多余液体，同时保持载玻片湿润。
    5. 将载玻片浸入盛有废弃上清液的烧杯中，缓慢前后移动（20–30次）进行洗涤，以去除未被吞噬的红细胞。
    6. 随后将载玻片浸入第二个烧杯中，再缓慢洗涤20–30次。将载玻片从PBS中取出，在纸巾上轻拍去除多余液体。避免触碰腔室正面。此时可将载玻片浸入水中1分钟，以去除黏附但未被吞噬的红细胞，但若能区分吞噬与黏附的红细胞，则此步骤可省略。自然晾干。
    7. 将载玻片浸入100%甲醇中固定45秒，随后自然晾干。使用实验室自制封片剂封片，并加盖盖玻片（24 × 75 mm）。封片后静置过夜，再进行定量分析。 
  5. 吞噬作用的定量分析
    1. 使用相差显微镜，40倍物镜，结合手动细胞计数器对吞噬作用进行定量。
    2. 双手各持一个手动细胞计数器，一手计数已吞噬的红细胞数量，另一手计数单核细胞/巨噬细胞总数。每孔计数300个单核细胞/巨噬细胞。
    3. 通过将吞噬的红细胞数量除以计数的单核细胞总数，再乘以100，计算每组检测（三个复孔）的平均吞噬指数（PI）。数据以平均PI ± 均值标准误（SEM）表示。
      PI = （吞噬的红细胞数 / 300个巨噬细胞） × 100

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结果

实验结果 图1 与文献报道一致，表明巨噬细胞已成功从M0状态极化为后续的M1/M2状态。M1和M2型巨噬细胞培养8天（前6天使用生长因子，后2天进行极化），随后检测经抗-D或抗-k致敏的红细胞 (图2)M2 巨噬细胞对经抗-D（对照）或抗-k 致敏的红细胞表现出较高的吞噬指数，与 M1 巨噬细胞相比差异显著。该结果与其他使用 M-MA 进行的初步实验结果一致（见 表1）。与M1型巨噬细胞或单核细胞相比，M2型巨噬细胞具有更强的吞噬能力，即使在存在强效红细胞抗体的情况下也是如此（图2B). 表1 显示了4种具有临床重要意义特异性的红细胞同种异体抗体的初步结果。用于包被抗原阳性红细胞并加入单核细胞单层吞噬试验（MMA）中的抗体表现出较弱的吞噬作用（吞噬指数PI＜2）。 < 5). 将经相同抗体调理的红细胞加入M1型巨噬细胞后，同样表现出较弱的吞噬作用（吞噬指...

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讨论

为确保该方法的成功，必须遵循以下关键步骤：1）成功实现M1/M2极化，2）生成巨噬细胞层及RhD+对照，3）吞噬指数的定量分析。尽管本方法中指出使用分离的单核细胞进行细胞培养，也可使用外周血单个核细胞（PBMCs），但我们建议使用经纯化的 单核细胞。已知PBMCs包含多种细胞类型，这些细胞会分泌多种不同的细胞因子和介导因子，可能影响M1/M2巨噬细胞的分化或极化；因此，使用纯化的单核细胞将获得更优的结果。  另外，需注意当使用STEMCELL单核细胞分离试剂盒时，从原始PBMCs中仅能获得约10%的单核细胞。观察发现，50 × 106个PBMCs是获得约5 × 106个单核细胞的最低起始数量。在清洗贴壁单核细胞的培养瓶时，务必轻柔地以旋转方式洗涤，避免细胞脱落。由于培养箱中会发生蒸发，因此在培养第4天补充培养基的步骤是必要的。请勿丢弃任何原有培养基，而应直接向培养瓶中添加新鲜培养基，因为M1/M2细胞所分泌的细胞因子对分化过程至关重要。完成2天极化后，M1/M2巨噬细胞即可用于实验，或继续在培养中维持最多7天。  极化时间具有灵活性，可根据观察结果进行调整，但成功...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由位于安大略省多伦多的加拿大血液服务中心创新中心资助和支持。研究在安大略省多伦多圣迈克尔医院的基南生物医学科学研究中心开展。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1X PBS，pH 7.4，不含 Ca²⁺/Mg²⁺Wisent Bioproducts 311-425-CL4°C 或室温保存 
Accutase™STEMCELL Technologies 7920细胞解离溶液
ACK 裂解缓冲液 STEMCELL Technologies 07850, 078004°C 保存
抗人球蛋白NOVACLONE, Immunocor. N/A用于 IAT 检测的 NOVACLONE Anti-igG 
抗-Rh(D)（WinRho SDF CDN）Saol Therapeutics 1003092任何商业来源的 Rh 免疫球蛋白均可使用 
细胞刮刀UofT Medstore83.395细胞解离 
70 µm 尼龙细胞筛Falcon352350细胞过滤 
带盖 Nunc Lab-Tek™ II 腔室载玻片，RS 玻璃载片，无菌 Thermo Fisher Scientific 154534MMA 实验用腔室载片 
盖玻片 VWR48393-08124 × 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus，密度 1.077 g/LThermo Fisher Scientific 17-1440-03从全血中分离 PBMCs；密度梯度介质
Elvanol 封片介质N/AN/A不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 Dulbecco’s PBS（D-PBS）、15%（w/v）聚乙烯醇树脂和 30%（v/v）甘油。
新鲜全血（ACD 管）或血沉棕黄层Canadian Blood Services可在室温下静置最多 36 小时 
人重组 GM-CSFSTEMCELL Technologies 78015.1M1 巨噬细胞极化的细胞因子
人重组 IFN-γSTEMCELL Technologies 78020M1 巨噬细胞极化的细胞因子
人重组 IL-4STEMCELL Technologies 78045.1M2 巨噬细胞极化的细胞因子
人重组 M-CSFSTEMCELL Technologies 78057.1M2 巨噬细胞极化的细胞因子
ID-CellStabBio-Rad005650 05740红细胞储存/稳定溶液 
分离培养基 N/AN/A无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA
脂多糖（LPS）Sigma AldrichL3024-5MGM1 巨噬细胞极化的细胞因子
甲醇（100%）N/AN/A载玻片固定 
单核细胞分离试剂盒 STEMCELL EasySep 人单核细胞富集试剂盒（不含 CD16 耗竭） STEMCELL Technologies 19058从 PBMCs 中分离单核细胞
多聚-L-赖氨酸 UofT Medstore P6407细胞贴附溶液 
Rh(D) 阳性 R2R2 红细胞Canadian Blood ServicesN/A也可商业获取
RPMI-1640Wisent Bioproducts 350-000-CL添加 10% 热灭活 FBS、1 mM GlutaMAX 补充剂、1 mM HEPES 和 1% 青霉素/链霉素。4°C 保存。 
台盼蓝溶液 Thermo Fisher Scientific 15250061细胞计数溶液 

参考文献

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