我们对现有的单核细胞-单层试验（MMA）进行了改进并更新了方法，该试验利用巨噬细胞帮助更好地预测输血医学和免疫学中红细胞同种抗体的临床相关性。该试验被命名为单核细胞-巨噬细胞试验（M-MA）。
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摘要
摘要
源自骨髓中的单核细胞，巨噬细胞是体积较大的天然免疫细胞，在清除死亡细胞、碎片、肿瘤细胞以及外来病原体方面发挥重要作用。单核细胞与巨噬细胞的吞噬能力差异目前尚未被充分理解。本研究旨在利用改良和更新的经典单核细胞单层法（MMA），比较单核细胞与M1/M2型巨噬细胞对多种调理红细胞的吞噬作用差异。外周血单个核细胞（PBMCs）从供体的血沉棕黄层中分离获得。通过纯化单核细胞，分别诱导生成具有促炎特性的M1型巨噬细胞和具有抗炎特性的M2型巨噬细胞。 体外 培养与极化。收集M1/M2细胞并用于一种类似于MMA的检测，我们称之为M-MA，以解析不同红细胞抗体在临床意义上的吞噬作用。吞噬指数（PI） > 5 被认为是单核细胞吞噬作用具有临床意义的阈值。吞噬指数（PI） > 12 被认为是使用 M1/M2 巨噬细胞时具有临床意义的吞噬作用。与单核细胞和 M1 巨噬细胞相比，M2 巨噬细胞表现出更强的吞噬包被红细胞的能力。同一种弱抗体（抗-S）仅在 M2 巨噬细胞中引起显著的吞噬作用（吞噬指数=43），而在 M1 巨噬细胞（吞噬指数=2）和单核细胞（吞噬指数=0）中则无此现象，该结果已通过多种抗体反复验证。使用 M2 巨噬细胞替代单核细胞可能获得更准确的结果，因为这些细胞具有更强的吞噬活性，从而进一步提升该检测的临床相关性。未来针对红细胞的不同抗体开展进一步研究，包括使用已知具有临床意义的抗体对单核细胞-巨噬细胞吞噬试验（M-MA）进行验证，可能将进一步揭示 M-MA 的应用价值。 有助于预测具有临床意义的红细胞同种抗体及输血反应。该方法将推动输血医学和免疫学领域的发展。
引言
预测输血反应在输血医学领域仍是一项重大挑战。在过去40年中，Tong 和 Branch 开创的单核细胞单层试验（MMA）1,2，已作为有价值的 体外 用于预测输血患者溶血临床结局的细胞检测方法1事实上，该检测在区分具有临床意义与无临床意义的红细胞（RBC）抗体方面发挥了关键作用2尽管单核细胞传统上是该检测中使用的标准白细胞，但我们的研究旨在探索使用单核细胞来源的巨噬细胞作为替代细胞的潜在优势。这些细胞可能增强该检测评估红细胞同种抗体临床相关性的能力。
在传统的混合淋巴细胞培养试验（MMA）中，作为巨噬细胞前体的单核细胞——即在输血不良反应中负责清除和破坏红细胞的免疫细胞——被引入到一个 体外 与红细胞和抗体一起进行的检测1,2,3,4,5,6
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方案
本研究严格遵守机构关于开展涉及人类受试者的伦理研究的指导方针。伦理批准由加拿大血液服务研究伦理委员会（REB）授予，批准编号为CBSREB#2023.008。本方案的所有步骤均须在生物安全柜中以无菌条件进行。
1. 外周血单个核细胞的分离
- 从供体获取装有抗凝剂（ACD）管的全人血。将血液在室温（18 °C–22 °C）下保存，最长不超过36小时。
- 将全血ACD管转移至50 mL离心管中（每两支ACD管使用一支50 mL离心管）。加入室温的RPMI-1640完全培养基，定容至终体积为35 mL。
- 在新的50 mL离心管中加入15 mL室温密度梯度介质。小心地将稀释后的全血叠加在密度梯度介质上方，尽量减少界面混合，以实现血液成分的最佳分离。
- 将分层混合液以700 x g 离心30分钟，关闭刹车。密度梯度离心将混合物自上而下分离为以下几层：血浆、白膜层（含PBMCs）、密度梯度介质、粒细胞和红细胞。
- 吸除并弃去最上层的大部分液体（血浆）。使用移液器小心吸取白膜层（PBMCs），避免带入其他物质。将收集的PBMCs转移至新的50 mL离心管中。
- 用pH 7.4的PBS溶液对分离得到的白膜层进行一次洗涤，350 x g 离心10分钟，开启全刹车。
- 使用70 µm细胞滤网去除....
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结果
实验结果 图1 与文献报道一致，表明巨噬细胞已成功从M0状态极化为后续的M1/M2状态。M1和M2型巨噬细胞培养8天（前6天使用生长因子，后2天进行极化），随后检测经抗-D或抗-k致敏的红细胞 (图2)M2 巨噬细胞对经抗-D（对照）或抗-k 致敏的红细胞表现出较高的吞噬指数，与 M1 巨噬细胞相比差异显著。该结果与其他使用 M-MA 进行的初步实验结果一致（见 表1）。与M1型巨噬细胞或单核细胞相比，M2型巨噬细胞具有更强的吞噬能力，即使在存在强效红细胞抗体的情况下也是如此（图2B). 表1 显示了4种具有临床重要意义特异性的红细胞同种异体抗体的初步结果。用于包被抗原阳性红细胞并加入单核细胞单层吞噬试验（MMA）中的抗体表现出较弱的吞噬作用（吞噬指数PI＜2）。 < 5). 将经相同抗体调理的红细胞加入M1型巨噬细胞后，同样表现出较弱的吞噬作用（吞噬指.......
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讨论
为确保该方法的成功，必须遵循以下关键步骤：1）成功实现M1/M2极化，2）生成巨噬细胞层及RhD+对照，3）吞噬指数的定量分析。尽管本方法中指出使用分离的单核细胞进行细胞培养，也可使用外周血单个核细胞（PBMCs），但我们建议使用经纯化的 单核细胞。已知PBMCs包含多种细胞类型，这些细胞会分泌多种不同的细胞因子和介导因子，可能影响M1/M2巨噬细胞的分化或极化；因此，使用纯化的单核细胞将获得更优的结果。 另外，需注意当使用STEMCELL单核细胞分离试剂盒时，从原始PBMCs中仅能获得约10%的单核细胞。观察发现，50 × 106个PBMCs是获得约5 × 106个单核细胞的最低起始数量。在清洗贴壁单核细胞的培养瓶时，务必轻柔地以旋转方式洗涤，避免细胞脱落。由于培养箱中会发生蒸发，因此在培养第4天补充培养基的步骤是必要的。请勿丢弃任何原有培养基，而应直接向培养瓶中添加新鲜培养基，因为M1/M2细胞所分泌的细胞因子对分化过程至关重要。完成2天极化后，M1/M2巨噬细胞即可用于实验，或继续在培养中维持最多7天。 极化时间具有灵活性，可根据观察结果进行调整，但成功.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由位于安大略省多伦多的加拿大血液服务中心创新中心资助和支持。研究在安大略省多伦多圣迈克尔医院的基南生物医学科学研究中心开展。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1X PBS，pH 7.4，不含 Ca²⁺/Mg²⁺ | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | 4°C 或室温保存 |
| Accutase™ | STEMCELL Technologies | 7920 | 细胞解离溶液 |
| ACK 裂解缓冲液 | STEMCELL Technologies | 07850, 07800 | 4°C 保存 |
| 抗人球蛋白 | NOVACLONE, Immunocor. | N/A | 用于 IAT 检测的 NOVACLONE Anti-igG |
| 抗-Rh(D)（WinRho SDF CDN） | Saol Therapeutics | 1003092 | 任何商业来源的 Rh 免疫球蛋白均可使用 |
| 细胞刮刀 | UofT Medstore | 83.395 | 细胞解离 |
| 70 µm 尼龙细胞筛 | Falcon | 352350 | 细胞过滤 |
| 带盖 Nunc Lab-Tek™ II 腔室载玻片，RS 玻璃载片，无菌 | Thermo Fisher Scientific | 154534 | MMA 实验用腔室载片 |
| 盖玻片 | VWR | 48393-081 | 24 × 50 mm |
| Cytiva Ficoll Paque Plus，密度 1.077 g/L | Thermo Fisher Scientific | 17-1440-03 | 从全血中分离 PBMCs；密度梯度介质 |
| Elvanol 封片介质 | N/A | N/A | 不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 Dulbecco’s PBS（D-PBS）、15%（w/v）聚乙烯醇树脂和 30%（v/v）甘油。 |
| 新鲜全血（ACD 管）或血沉棕黄层 | Canadian Blood Services | 可在室温下静置最多 36 小时 | |
| 人重组 GM-CSF | STEMCELL Technologies | 78015.1 | M1 巨噬细胞极化的细胞因子 |
| 人重组 IFN-γ | STEMCELL Technologies | 78020 | M1 巨噬细胞极化的细胞因子 |
| 人重组 IL-4 | STEMCELL Technologies | 78045.1 | M2 巨噬细胞极化的细胞因子 |
| 人重组 M-CSF | STEMCELL Technologies | 78057.1 | M2 巨噬细胞极化的细胞因子 |
| ID-CellStab | Bio-Rad | 005650 05740 | 红细胞储存/稳定溶液 |
| 分离培养基 | N/A | N/A | 无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA |
| 脂多糖（LPS） | Sigma Aldrich | L3024-5MG | M1 巨噬细胞极化的细胞因子 |
| 甲醇（100%） | N/A | N/A | 载玻片固定 |
| 单核细胞分离试剂盒 STEMCELL EasySep 人单核细胞富集试剂盒（不含 CD16 耗竭） | STEMCELL Technologies | 19058 | 从 PBMCs 中分离单核细胞 |
| 多聚-L-赖氨酸 | UofT Medstore | P6407 | 细胞贴附溶液 |
| Rh(D) 阳性 R2R2 红细胞 | Canadian Blood Services | N/A | 也可商业获取 |
| RPMI-1640 | Wisent Bioproducts | 350-000-CL | 添加 10% 热灭活 FBS、1 mM GlutaMAX 补充剂、1 mM HEPES 和 1% 青霉素/链霉素。4°C 保存。 |
| 台盼蓝溶液 | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | 细胞计数溶液 |
参考文献
- Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a monocyte monolayer assay to evaluate Fcγ receptor-mediated phagocytosis. J Vis Exp. (119), e55039(2017).
- Tong, T. N., Cen, S., Branch, D. R. The monocyte monolayer assay: Past, present and future. Transfus Med Rev. 33 (1), ....
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