通过多色流式细胞术分析血小板亚群

摘要

血小板的多色流式细胞术可识别经典血小板亚群（如静息型、聚集型、促凝型和凋亡型血小板）内的新亚型，从而比较不同血小板激动剂诱导的亚群模式差异。本文详细描述了建立多色流式细胞术检测方案的操作流程。

摘要

血小板，或称血栓细胞，是体积微小且无细胞核的血细胞，在止血和血栓形成过程中发挥关键作用。血小板功能缺陷可导致心血管疾病患者出现出血或血栓事件。因此，对血小板进行表型表征，以将血小板亚群与其功能相对应，具有重要意义。使用血小板激动剂和激活剂刺激人血小板，可诱导血小板发生形态学和生理学变化，同时伴随其表面受体群体的改变，从而产生功能上多样化的血小板亚群。经典定义的血小板亚群包括静息型、聚集型、促凝型和凋亡型血小板。为了表征激动剂对血小板亚型的影响，我们建立了一种多色流式细胞术检测方法，该方法包含10种不同的抗体和染料（抗CD62P、抗CD63、抗CD61、抗CD41、抗CD42b、抗整合素_αIIbβ3（克隆：PAC-1）、抗CXCR4、抗ACKR3、Annexin V、Zombie NIR）。分离的人血小板经血小板激动剂孵育后，用特异性荧光标记的抗体和染料进行染色，随后通过流式细胞术进行检测。该方法使我们能够在经典的四种亚群基础上，进一步定义激动剂特异性的血小板亚型。综上所述，本研究中描述的10色流式细胞术检测面板结合了活化标志物（抗CD62P、抗CD63、抗整合素_αIIbβ3（克隆：PAC-1））、炎症标志物（抗CXCR4、抗ACKR3）和凋亡标志物（Annexin V、Zombie NIR），为定义更多可能与特定血小板功能相关的血小板亚型提供了可能。该方法可应用于血小板功能与生理学的基础研究，也可用于疾病模型和患者研究中新型血小板亚型的鉴定。

引言

血小板，也称为血栓细胞，是体积小、无细胞核的血细胞，对止血和血栓形成至关重要。^1,2它们可被多种血小板激动剂激活。经典的生理性血小板激动剂包括：腺苷二磷酸（ADP），其结合P2Y12和P2Y1受体；凝血酶，通过PAR1和PAR4受体激活血小板；以及胶原，与糖蛋白VI相互作用。胶原在实验中可被替代 体外 由胶原相关肽（CRP-XL）进行的实验^3,4最近研究表明，血红素可通过C型凝集素样受体（CLEC-2）与糖蛋白VI（GPVI）的相互作用诱导血小板活化，从而确立血红素作为一种新的内源性血小板激活剂/激动剂^5,6多种病理状况可导致溶血，从而释放出含三价铁的游离血红素。所有这些血小板激动剂均可改变血小板表面受体的表达。表面受体及质膜的改变程度取决于血小板激动剂的强度和浓度。^7,8,9因此，对血小板进行表型表征至关重要，以便将血小板亚群与其功能相对应。

方案

本研究的血液采集与处理已获得蒂宾根大学医学院及蒂宾根大学医院伦理委员会批准（伦理批件号：238/2018B02），研究方法符合《赫尔辛基宣言》所规定标准。健康供血者均已签署书面知情同意书。健康供血者的基线特征见表1。图1概述了流式细胞术实验流程。

1. 从全血中分离人血小板

注意：为确保以标准化方式分离血小板，样本采集、止血带使用以及抗凝剂的选择均遵循国际血栓与止血学会（ISTH）指南²⁰。

1. 缓冲液配制
   1. 酸-柠檬酸盐-葡萄糖（ACD）抗凝缓冲液：将12.50 g柠檬酸钠（Na₃-Citrat，85 mM C₆H₅Na₃O₇·2H₂O）、6.82 g柠檬酸（71 mM）和10.00 g葡萄糖（111 mM）溶于475 mL去离子水中。用1 M NaOH调节pH至4.69，再用去离子水定容至500 mL。随后用滤膜过滤除菌，并于4 °C保存备用。
      注：所有溶液均使用真空驱动的过滤系统进行过滤除菌，该系统采用孔径为0.22 µm的快速流速聚醚砜膜。
   ....

结果

多色流式细胞术面板采集的原始数据有两种分析方式。一种方式是使用分析软件进行手动分析（图3 和 图4）。因此，需要将原始数据拖放到软件窗口中。首先，需在散点图显示模式下调整SSC/FSC比例，使血小板群体呈现为一个独立的点状云团，从而识别出细胞。然后，通过未处理样本和处理样本，在直方图模式下将显示切换至相应通道，根据未处理样本的峰与处理样本的峰之间设定阈值，或在散点图模式下依据FMO对照设定门控，从而确定各标记物的阳性细胞群。

在点图中可以观察到血小板群体的明显偏移（图4A）。与其它激动剂相比，血红素（hemin）处理导致更多低FSC的血小板。经ADP、凝血酶（thrombin）和CRP-XL处理的血小板中，约有40%-60%为CD42b阳性（图4B）。只有血红素显著降低了CD42b阳性血小板的比例（*p < 0.05；

讨论

多色流式细胞术可用于定义与特定功能相关的不同血小板簇/亚群^12,17,18。血小板亚群分析结果及受体表面表达水平的关键在于分离所得人血小板的质量。因此，本方案中的一个关键步骤是血小板的制备。血小板需轻柔地分离，以避免在使用不同激动剂处理样本前发生激活。即使该方法用于比较不同疾病状态，也必须缓慢采集患者血液，以防止非疾病因素引起的血小板激活，进而影响实验结果。

建立10色流式细胞术检测面板的最大挑战在于，为每种可检测的表面受体找到合适的荧光标记抗体，且该抗体需与现有的流式细胞仪兼容^21,27。由于不同荧光染料的发射光谱存在重叠，因此选择范围进一步受限，必须进行精确的补偿调节。此外，还需通过阳性对照、阴性对照以及荧光减一（FMO）对照对所用抗体和染料进行验证，以排除非生物学效应引起的信.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 结合缓冲液	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	缓冲液
腺苷二磷酸（ADP）	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Germany	70212	血小板激动剂
Annexin V PE-Cyanine7	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	染料
抗-CD41 AF 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303728	抗体
抗-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303727	抗体
抗-CD42b PerCP/Cyanine5.5	BioLegend, San Diego, CA, USA	303918	抗体
抗-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	744382	抗体
抗-CD62P PE	Beckman Coulter, Brea, California, USA	IM1759U	抗体
抗-CD63 PE/Cy5	Abcam, Cambrigde, UK	ab 234251	抗体
抗-CXCR4 BV650	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	740599	抗体
抗-CXCR7 BV421	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	566234	抗体
抗-PAC-1 FITC	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	340507	抗体
牛血清白蛋白（BSA）	Applichem, Darmstadt, Germany	A1391	-
柠檬酸	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6490.1	-
CRP-XL	CambCol Laboratories, Ely, UK	CRP-XL	血小板激动剂
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	G7528	-
Dubecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	D8537	-
血红素	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	H9039-10G	血小板激动剂
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	9105.3	-
氯化钾	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6781.3	-
氯化钠	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3957.1	-
碳酸氢钠	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	401676	-
凝血酶	Roche	10602400001	血小板激动剂
三水合柠檬酸钠	Applichem, Darmstadt, Germany	1416551211	-
Zombie NIR	BioLegend, San Diego, CA, USA	423105	胺反应性染料