通过多色流式细胞术分析血小板亚群

摘要

血小板的多色流式细胞术可识别经典血小板亚群（如静息型、聚集型、促凝型和凋亡型血小板）内的新亚型，从而比较不同血小板激动剂诱导的亚群模式差异。本文详细描述了建立多色流式细胞术检测方案的操作流程。

摘要

血小板，或称血栓细胞，是体积微小且无细胞核的血细胞，在止血和血栓形成过程中发挥关键作用。血小板功能缺陷可导致心血管疾病患者出现出血或血栓事件。因此，对血小板进行表型表征，以将血小板亚群与其功能相对应，具有重要意义。使用血小板激动剂和激活剂刺激人血小板，可诱导血小板发生形态学和生理学变化，同时伴随其表面受体群体的改变，从而产生功能上多样化的血小板亚群。经典定义的血小板亚群包括静息型、聚集型、促凝型和凋亡型血小板。为了表征激动剂对血小板亚型的影响，我们建立了一种多色流式细胞术检测方法，该方法包含10种不同的抗体和染料（抗CD62P、抗CD63、抗CD61、抗CD41、抗CD42b、抗整合素_αIIbβ3（克隆：PAC-1）、抗CXCR4、抗ACKR3、Annexin V、Zombie NIR）。分离的人血小板经血小板激动剂孵育后，用特异性荧光标记的抗体和染料进行染色，随后通过流式细胞术进行检测。该方法使我们能够在经典的四种亚群基础上，进一步定义激动剂特异性的血小板亚型。综上所述，本研究中描述的10色流式细胞术检测面板结合了活化标志物（抗CD62P、抗CD63、抗整合素_αIIbβ3（克隆：PAC-1））、炎症标志物（抗CXCR4、抗ACKR3）和凋亡标志物（Annexin V、Zombie NIR），为定义更多可能与特定血小板功能相关的血小板亚型提供了可能。该方法可应用于血小板功能与生理学的基础研究，也可用于疾病模型和患者研究中新型血小板亚型的鉴定。

引言

血小板，也称为血栓细胞，是体积小、无细胞核的血细胞，对止血和血栓形成至关重要。^1,2它们可被多种血小板激动剂激活。经典的生理性血小板激动剂包括：腺苷二磷酸（ADP），其结合P2Y12和P2Y1受体；凝血酶，通过PAR1和PAR4受体激活血小板；以及胶原，与糖蛋白VI相互作用。胶原在实验中可被替代 体外 由胶原相关肽（CRP-XL）进行的实验^3,4最近研究表明，血红素可通过C型凝集素样受体（CLEC-2）与糖蛋白VI（GPVI）的相互作用诱导血小板活化，从而确立血红素作为一种新的内源性血小板激活剂/激动剂^5,6多种病理状况可导致溶血，从而释放出含三价铁的游离血红素。所有这些血小板激动剂均可改变血小板表面受体的表达。表面受体及质膜的改变程度取决于血小板激动剂的强度和浓度。^7,8,9因此，对血小板进行表型表征至关重要，以便将血小板亚群与其功能相对应。

流式细胞术等高维分析方法揭示了血小板可形成具有不同功能的亚群。这些亚群可通过不同的表面标志物进行分类。文献中已明确存在两种不同的血小板亚群：促凝血型血小板，其特征为磷脂酰丝氨酸外翻；以及聚集型血小板，其特征为整合素 α_IIIbβ₃ 的激活。除了经典的活化标志物外，还可使用荧光染料（如检测线粒体功能和氧化应激的 Glutathione-S-Aryloxide，GSAO）进一步分类，例如根据代谢状态区分促凝血型血小板¹⁰。这使得我们能够区分肿胀型与线粒体通透性转换孔（MPTP）形成的促凝血型血小板表型¹¹。

Heemskerk 等人通过分析磷脂酰丝氨酸（PS）暴露和整合素 α_IIbβ₃ 活性发现，不同的血小板亚群可调控不同的凝血步骤，且磷脂酰丝氨酸的暴露需要强效激活剂（如凝血酶和胶原）的参与¹²。此外，通过 GPVI 受体激活血小板（如使用胶原或特异性 GPVI 激动剂 convulxin）主要介导黏附性促凝血小板的形成。同样，花生四烯酸通过环氧化酶生成血栓素 A2，从而激活血小板并诱导 PS 暴露¹³。然而，与凝血酶或胶原相比，花生四烯酸是一种较弱的血小板激活剂¹⁴。Van Velzen 等人还分别在两次独立检测中评估了血小板表面抗原（CD42a/b、CD36、CD41、CD61）和活化标志物（PAC-1、CD63、CD62P）¹⁵。此外，van Velzen 等人还分析了血小板无力症患者的血液样本，并比较了健康个体与患者之间的血小板亚群差异。Hindle 等人使用两组独立的四标志物组合（PAC-1、Annexin V、CD62P、CD42b，或 CDCD154、CD62P、CD63、CD42b），检测了前列环素在凝血酶和 CRP-XL 处理后对血小板亚群的影响¹⁶。近期，多色流式细胞术已被用于定义静息型（CD42b⁺、PAC1^-、CD62P^-、Annexin V^-）、聚集型（CD42b⁺、PAC1⁺、CD62P⁺、Annexin V^-）、促凝型（CD42b⁺、PAC1^-、CD62P⁺、Annexin V⁺）和凋亡型（CD42b^-、PAC1^-、CD62P^-、Annexin V⁺）血小板亚群^7,17。Laspa 等人通过加入针对趋化因子受体 CXCR4 和 ACKR3 的抗体，进一步拓展和完善了多色流式细胞术的检测方法¹⁸。根据现有文献，这是首个用于分离人血小板的 10 色流式细胞术检测方案，可在单个试管中对分离的人血小板群体中单个血小板（单细胞水平）上的 10 种不同抗原进行检测。因此，该方法可同时测量单个血小板的活化、黏附和聚集潜能、趋化因子受体表达以及凋亡潜能，从而更精细地区分已存在的血小板亚群。该方法补充了 Johnson 等人的研究，后者使用四种标志物定义了四种主要血小板亚群（静息型、促凝型、聚集型、凋亡型）¹⁷。因此，建立多色流式细胞术检测体系，可实现对不同血小板激动剂在激活模式及其诱导经典血小板亚群内亚型形成方面的比较分析。

该方法可用于血小板功能与生理学分析的基础研究。此外，已建立的人类血小板多色流式细胞术检测可利用患者研究中获得的血小板进行，例如用于心血管疾病和血栓事件的研究，以解析这些疾病诱导产生的血小板亚群以及治疗对这些诱导表型的影响。例如，Mueller 等人已证明，在主动脉瓣狭窄患者中，血小板亚群可能存在差异¹⁹。所获得的知识可能为药物干预提供新的突破口。

方案

本研究的血液采集与处理已获得蒂宾根大学医学院及蒂宾根大学医院伦理委员会批准（伦理批件号：238/2018B02），研究方法符合《赫尔辛基宣言》所规定标准。健康供血者均已签署书面知情同意书。健康供血者的基线特征见表1。图1概述了流式细胞术实验流程。

1. 从全血中分离人血小板

注意：为确保以标准化方式分离血小板，样本采集、止血带使用以及抗凝剂的选择均遵循国际血栓与止血学会（ISTH）指南²⁰。

1. 缓冲液配制
   1. 酸-柠檬酸盐-葡萄糖（ACD）抗凝缓冲液：将12.50 g柠檬酸钠（Na₃-Citrat，85 mM C₆H₅Na₃O₇·2H₂O）、6.82 g柠檬酸（71 mM）和10.00 g葡萄糖（111 mM）溶于475 mL去离子水中。用1 M NaOH调节pH至4.69，再用去离子水定容至500 mL。随后用滤膜过滤除菌，并于4 °C保存备用。
      注：所有溶液均使用真空驱动的过滤系统进行过滤除菌，该系统采用孔径为0.22 µm的快速流速聚醚砜膜。
   2. Tyrode缓冲液（10倍浓度）：称取80.00 g NaCl、10.15 g NaHCO₃和1.95 g KCl，加去离子水至1 L。过滤除菌后于4 °C保存备用。
   3. Tyrode-HEPES缓冲液（1倍浓度；137 mM NaCl、2.8 mM KCl、12 mM NaHCO₃、5 mM葡萄糖、10 mM HEPES）：取10 mL 10倍浓度Tyrode缓冲液，加入90 mL去离子水。溶解0.1 g葡萄糖和0.1 g牛血清白蛋白（BSA）。用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）调节pH至7.4。将10 mL Tyrode缓冲液调至pH 7.4，其余90 mL Tyrode缓冲液用1 N HCl调节pH至6.5。
      注：BSA可能清除某些化学物质（如血红素）。在此情况下，应配制不含BSA的1倍浓度Tyrode缓冲液。所有缓冲液在使用前需恢复至室温或37 °C。
2. 血液样本采集
   1. 为每位供体准备一支含2 mL ACD抗凝剂的10 mL注射器，并将其置于培养箱中预热至室温或37 °C。保持1:5的稀释比例（ACD:血液）。
      注：可根据需要使用更小或更大的注射器采集血样。低温ACD缓冲液可能提前激活血小板，影响实验结果。
   2. 使用蝶形针头（21G）将供体血液缓慢注入预热的含ACD的注射器中。在注射器充满前松开止血带，以避免血小板提前激活。
      注：使用更大口径针头的注射器可减少剪切力引起的血小板激活。
   3. 将含ACD的血液缓慢转移至15 mL离心管中。应立即使用血液，以避免血小板提前激活。
3. 血小板分离
   1. 将含ACD的血液在室温（RT）下以209 × g离心20分钟（不启用刹车）。同时在50 mL离心管中准备25 mL pH为6.5的Tyrode-HEPES缓冲液。
   2. 小心地将获得的富血小板血浆（PRP，上层）转移至含有pH 6.5 Tyrode-HEPES缓冲液的50 mL离心管中。
   3. 在白细胞层（buffy coat）和红细胞层上方保留约1 mL PRP，以避免其他血细胞污染。
   4. 将悬液在室温下以430 × g离心10分钟，使血小板沉淀。小心地将沉淀重悬于200–300 µL pH 7.4的Tyrode缓冲液中。
   5. 使用细胞计数仪测定血小板浓度。用pH 7.4的Tyrode-HEPES缓冲液将血小板浓度调整至200 × 10³ 个/µL。后续血小板染色处理见步骤3。

2. 流式细胞术抗体的选择与滴定

1. 抗体和染料的选择
   1. 根据流式细胞仪选择带有合适荧光团的抗体和染料²¹。注意流式细胞仪制造商推荐的滤光片配置。下述流式细胞仪（BD LSR Fortessa，激光配置：紫色（402 nm）、蓝色（488 nm）、黄绿色（561 nm）、红色（640 nm））所用的血小板标志物及荧光团配置示例见表2和图2。
      注意：对于表达水平较低的抗原，应使用亮度较高的荧光染料。例如，弱表达的趋化因子受体（ACKR3 和 CXCR4）使用了高亮度的荧光染料 BV412 和 BV650^22,23,24。
2. 抗体和染料的滴定
   1. 对抗体进行滴定以确定其最佳工作浓度。滴定过程中，使用步骤1中分离的人血小板，并设置一系列不同浓度的抗体。
      注意：制造商提供的工作浓度通常可作为浓度梯度设置的良好起点。
      1. 若目标抗原仅在处理后表达，则应在染色前激活血小板，以确保能够同时检测到阴性和阳性细胞。例如，PAC-1 仅结合活化的整合素 α_IIbβ₃。因此，应强烈激活血小板以获得明亮的阳性信号，例如使用 10 µg/mL 的胶原相关肽（CRP；见图3）。
3. 样本的滴定
   1. 按照步骤1分离人血小板，并将血小板数量调整为每样本 1 × 10⁶ 个血小板。
      1. 对于染色前无需激活的受体：CD61、CD42b、CD41、CXCR7、CXCR4，每个抗体使用一个未染色样本和一个染色样本。对于染色前需激活的受体/标志物，例如使用 10 µg/mL CRP-XL 激活：PAC1、CD63、CD62P、Annexin V、Zombie NIR，应使用一个激活样本和一个非激活样本^15,25,26。
   2. 如需激活，将血小板（每样本 1 × 10⁶ 个）用 10 µg/mL CRP-XL 处理 30 分钟。随后，将分离的血小板（每样本 1 × 10⁶ 个）与不同浓度的荧光染料标记抗体或染料在 300 µL 的 1× Annexin Binding Buffer 中孵育 30 分钟以稀释样本（抗体浓度示例见表3）。
   3. 每个样本采集 10,000 个事件。
   4. 计算每个抗体的染色指数，以评估阳性与阴性细胞群之间的最佳分离效果，如补充图1所示。
   5. 绘制每个抗体浓度对应的染色指数曲线，以确定最佳浓度。

3. 流式细胞术染色

注意：四种不同血小板激活剂（CRP-XL、ADP、凝血酶、血晶素）染色示例见表4。

1. 血红素需新鲜配制。将粉末溶于1.4 M NaOH中，配成3 M溶液，并在450 rpm条件下于96 °C加热5分钟。随后用蒸馏H₂O稀释，得到3 mM的储备液。
2. 调整血小板计数后（每样本：1 × 10⁶ 个血小板），在试管中加入血小板激活剂，在室温下激活30分钟，具体激活剂见表4。
3. 向样本中加入43.3 µL抗体混合液，在室温避光条件下孵育血小板30分钟。
4. 孵育结束后，用300 µL 1× Annexin结合缓冲液（10 mM HEPES/NaOH，pH 7.4，140 mM NaCl，2.5 mM CaCl₂）稀释样本，以使Annexin V蛋白能够结合细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸。样本制备后应立即检测。
   注意：样本制备后需立即检测。由于样本未固定，延迟制备和检测可能增加结果的变异性。固定会干扰Annexin V的结合。

4. 补偿设置与荧光减一对照（FMO）检测

注意：在记录数据之前，需进行补偿设置。流式细胞仪可自动计算补偿参数；具体补偿步骤请参考流式细胞仪的常规使用手册。然而，应使用细胞或微珠作为补偿对照。

1. 补偿设置
   1. 使用微球进行补偿时，为每种荧光染料准备150 µL磷酸盐缓冲液（PBS），加入一滴微球和1 µL荧光标记抗体。
   2. 监测微球对不同物种的反应性。使用抗小鼠IgGκ以及聚苯乙烯微粒的阴性对照。为Annexin V进行补偿时，使用PE/Cy7标记的微球，并用与Annexin V相同荧光染料偶联的PE/Cy7抗人CD62L抗体进行标记。
   3. 对于胺反应性染料，使用胺反应性补偿微球。在150 µL PBS中加入两滴阳性微球和一滴阴性微球，并加入1 µL染料。确认胺反应性补偿微球与染料发生反应并呈现阳性信号；同时确认阴性微球不与胺反应性染料反应，呈现阴性信号。
      注意：对于Zombie NIR APC-Cy7，需使用阴性和阳性胺反应性微球。
   4. 将补偿样品在室温避光条件下孵育30分钟。
   5. 分别运行每个补偿管，并根据FSC和SSC对单一群体微球设门。微球群体表现为一个较小且集中的细胞群，在该群体周围绘制门控区域。
   6. 显示每个补偿管的直方图，并调整补偿值，直至不同抗体和染料的阳性峰之间无重叠。然后测量每个单独的补偿管，按照制造商的标准操作程序（SOP）自动计算荧光溢出值。
   7. 接着进行实际染色实验的数据采集，使用分离的人血小板（参见步骤3和表4）。在测量前调整SSC/FSC电压以识别血小板群体。由于CD61在血小板上普遍表达，可通过该荧光阈值检查是否能检测到所有尺寸的血小板。
   8. 每份样本采集20,000个事件。
2. FMO对照测量
   1. 根据表5为每个标记物准备相应的FMO对照。为了能够确定所有标记物之间的信号重叠情况，需同时准备未刺激和刺激后的样本。

5. 数据分析

1. 使用流式细胞术数据分析软件进行分析（图4）
   1. 将FSC文件拖放到软件中。利用FMO对照确定每个标记物的阳性细胞群。
      1. 通过在点图中将每个FMO对照与相应标记物进行比对来确定FMO结果。这可以直观显示荧光信号溢出至其他通道的情况。以具有最高荧光溢出的FMO门控作为边界，用于界定经处理的10色样本中的阳性细胞群。
2. 使用基于云平台的流式细胞术分析工具进行分析（图5）
   1. 打开软件并创建新数据集。将流式细胞仪获取的FCS文件拖放到软件中。
   2. 通过创建分析流程开始分析。补偿矩阵将从原始数据文件中自动生成。
   3. 运行UMAP分析，设置如下：邻近数（Neighbors）：15，最小距离（Minimum Distance）：0.4；主成分数（Components）：2；距离度量（Metric）：欧几里得（Euclidean）；学习率（Learning Rate）：1；训练轮次（Epochs）：200；嵌入初始化（Embedding Initialization）：谱方法（spectral）。选择所有文件及全部10个标记物（特征）。
   4. 添加Phenograph分析作为新任务，并按以下设置运行分析：K近邻数（K Nearest Neighbors）：20；距离度量（Distance Metric）：欧几里得（Euclidean）；Louvain聚类运行次数（Louvain Runs）：1；结果数量（Number of Results）：1。
   5. 添加门控任务以标注生成的细胞簇。分析运行完成后，可在不同图谱中展示数据，并支持导出。

结果

多色流式细胞术面板采集的原始数据有两种分析方式。一种方式是使用分析软件进行手动分析（图3 和 图4）。因此，需要将原始数据拖放到软件窗口中。首先，在散点图显示模式下，通过调整SSC/FSC比例，使血小板群体呈现为一个独立的点状云团，从而识别出细胞。然后，利用未处理样本和处理样本，切换至直方图模式，根据未处理样本的峰与处理样本的峰之间设定阈值，或在散点图模式下依据FMO对照设定门控，以确定各标记物的阳性细胞。

在点图中可以观察到血小板群体的明显偏移（图4A）。与其它激动剂相比，血红素（hemin）处理组产生更多低FSC的血小板。经ADP、凝血酶（thrombin）和CRP-XL处理的血小板中，约有40%–60%为CD42b阳性（图4B）。只有血红素显著降低了CD42b阳性血小板的比例（*p < 0.05；

讨论

多色流式细胞术可用于定义与特定功能相关的不同血小板簇/亚群^12,17,18。血小板亚群分析结果及受体表面表达水平的关键在于分离所得人血小板的质量。因此，本方案中的一个关键步骤是血小板的制备。血小板需轻柔地分离，以避免在使用不同激动剂处理样本前发生激活。即使该方法用于比较不同疾病状态，也必须缓慢采集患者血液，以防止非疾病因素引起的血小板激活，进而影响实验结果。

建立10色流式细胞术检测面板的最大挑战在于，为每种可检测的表面受体找到合适的荧光标记抗体，且该抗体需与现有的流式细胞仪兼容^21,27。由于不同荧光染料的发射光谱存在重叠，因此选择范围进一步受限，必须进行精确的补偿调节。此外，还需通过阳性对照、阴性对照以及荧光减一（FMO）对照对所用抗体和染料进行验证，以排除非生物学效应引起的信...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 结合缓冲液	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	缓冲液
腺苷二磷酸（ADP）	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Germany	70212	血小板激动剂
Annexin V PE-Cyanine7	Invitrogen, Carlsbad, California, USA	88-8103-74	染料
抗-CD41 AF 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303728	抗体
抗-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303727	抗体
抗-CD42b PerCP/Cyanine5.5	BioLegend, San Diego, CA, USA	303918	抗体
抗-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	744382	抗体
抗-CD62P PE	Beckman Coulter, Brea, California, USA	IM1759U	抗体
抗-CD63 PE/Cy5	Abcam, Cambrigde, UK	ab 234251	抗体
抗-CXCR4 BV650	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	740599	抗体
抗-CXCR7 BV421	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	566234	抗体
抗-PAC-1 FITC	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	340507	抗体
牛血清白蛋白（BSA）	Applichem, Darmstadt, Germany	A1391	-
柠檬酸	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6490.1	-
CRP-XL	CambCol Laboratories, Ely, UK	CRP-XL	血小板激动剂
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	G7528	-
Dubecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	D8537	-
血红素	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	H9039-10G	血小板激动剂
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	9105.3	-
氯化钾	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6781.3	-
氯化钠	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3957.1	-
碳酸氢钠	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	401676	-
凝血酶	Roche	10602400001	血小板激动剂
三水合柠檬酸钠	Applichem, Darmstadt, Germany	1416551211	-
Zombie NIR	BioLegend, San Diego, CA, USA	423105	胺反应性染料