黑腹果蝇基因座特异性核糖体 RNA 转录的单核苷酸多态性敏感 FISH 检测

Summary

该方案描述了单核苷酸多态性敏感荧光 原位 杂交 （SNP-FISH） 方法，用于区分源自 黑腹果蝇中 X 或 Y 染色体核糖体 DNA 基因座的核糖体 RNA 转录物。

Abstract

为了确保足够的核糖体 RNA （rRNA） 转录用于核糖体功能，基因组包含编码 rRNA 的序列的数百个串联重复，组成称为核糖体 DNA （rDNA） 基因座的区域。许多生物体的基因组包含多个分布在不同染色体上的 rDNA 位点，并且 rRNA 可以从多个 rDNA 位点或仅单个位点转录。rRNA 转录来源的变化通常表明核糖体痛苦。然而，rRNA 的均一性阻碍了区分 rRNA 是从多个还是单个 rDNA 位点转录而来的。在这里，我们描述了一种使用单核苷酸多态性敏感荧光 原位 杂交 （SNP-FISH） 来区分 X 和 Y 染色体上黑 腹果蝇 rDNA 位点之间的 rRNA 转录的方法。该方法利用基因座特异性 rRNA 变体，能够以单细胞分辨率轻松检测 rRNA 转录来源。该测定法可应用于任何 果蝇 细胞类型，并可适用于其他系统。

Introduction

核糖体功能所需的 18S、5.8S 和 28S 核糖体 RNA （rRNA） 在称为 45S pre-rRNA 的单个顺子中共转录。这三个 rRNA 在 45S pre-rRNA 中被两个内部转录间隔序列 （ITS） 分离，并在 5' 和 3' 末端被外部转录间隔序列 （ETS） 隔开。所有这些间隔序列都从 45S pre-rRNA 中去除，以便将成熟 rRNA 掺入核糖体中（参见¹）。为了满足支持核糖体活性所需的 rRNA 生产的高需求，所有真核生物基因组都包含数百个 45S 序列拷贝。这些拷贝以串联重复序列的形式聚集在一起，形成称为核糖体 DNA （rDNA） 位点的基因组区域。大多数真核生物基因组包含分布在不同染色体上的多个 rDNA 位点（参见²）。45S 拷贝的高冗余性意味着 45S 拷贝通常比转录所需的要多得多，并且大多数 45S 拷贝在转录中保持沉默并埋藏在异染色质³ 中。rDNA 位点的转录活性不均匀，并且在生物体中广泛观察到 rDNA 位点转录的变化 ^4,5,6，表明 45S 转录在单个 rDNA 位点受到差异调节。在植物、无脊椎动物和脊椎动物中观察到全位点 rDNA 沉默 7,8,9,10，表明全位点 rDNA 沉默是调节 rRNA 剂量的主要机制 ¹¹。rRNA 转录是核糖体生产的关键调节步骤，调节翻译活性的 rRNA 转录变化是正常分化和疾病状况的重要特征¹²。rDNA 位点转录的变化也与 rDNA 总拷贝数¹³ 的减少有关。因此，基因座特异性 rDNA 转录改变可能是细胞生理学中断的重要指标。

虽然基因座特异性沉默似乎是 rRNA 转录调控的主要来源，但建立这种沉默并指导哪些 rDNA 基因座具有转录活性的机制在很大程度上是未知的。rDNA 序列的同质性使得难以评估单个 rDNA 位点转录，从而阻止了对位点特异性 rDNA 转录活性的广泛分析。通过利用同一基因组内 rDNA 拷贝之间的结构和单核苷酸序列差异，可以克服这一挑战 4,5,6,13。其中一些变体可能在单个基因座的大多数或所有拷贝之间共享，从而产生区分 rDNA 基因座的多个变体的独特 rDNA 基因座单倍型。事实上，端粒-端粒联盟最近将 rDNA 变体映射到特定基因座揭示了人类基因组中基因座特异性共享的 rDNA 变异¹⁴。这种 rDNA 位点图谱可能能够从测序数据集中识别位点特异性转录;然而，这些地图目前的可用性仍然有限，并且不容易制作。由于 rDNA 位点仅存在于黑腹果蝇的性染色体上（X 和 Y 染色体各一个位点）¹⁵，因此 XX 女性不存在 Y 染色体 rDNA 位点。从 Y 染色体基因座中自然分离意味着 X 和 Y rDNA 基因座之间的单核苷酸多态性 （SNP） 变异可以在短读长测序中轻松识别为存在于雄性 （XY） 中但存在于雌性 （XX） 中的任何变异。通过对雄性和雌性 DNA 进行简单的 PCR 和 Sanger 测序，可以在未分型的果蝇菌株中快速检测先前鉴定的 SNP。此外，具有没有 rDNA 位点¹⁶ 的 X 染色体的果蝇菌株的可用性意味着可以单独分离单个 X 和 Y rDNA 位点，以实现更精确的 rDNA SNP 表征。果蝇 rDNA 位点之间 SNP 变异的简单识别使得确定独特的 X 和 Y rDNA 位点 SNP 单倍型成为可能¹³。X 染色体 rDNA 位点在雄性果蝇中通常也是完全沉默的，但两个 X 染色体位点在雌性中都是转录^{的 10,17}，^使果蝇成为研究基因座范围 rDNA 沉默的有用系统。

荧光原位杂交 （FISH） 是一种强大的工具，可以可视化组织单个细胞内特定 RNA 或 DNA 序列的存在。FISH 通过与荧光基团偶联的反义寡核苷酸探针标记靶标 RNA 或 DNA 序列。FISH 探针通常需要 ~20 个核苷酸长，以提供足够稳定的靶标结合以进行可视化，但这么长的探针也很容易与仅不同单个核苷酸的非靶序列结合（图 1A）。相反，足够短的探针以赋予单核苷酸特异性，其结合不够稳定，无法实现可视化。为了平衡特异性和稳定性，SNP 敏感的 FISH （SNP-FISH） 将 ~26 个核苷酸长的反义荧光探针与非荧光正义掩模寡核苷酸相结合，该寡核苷酸与探针除 5' 端外的所有部分结合¹⁸。该掩模仅留下探针的 10 个最 5' 核苷酸为单链，可用于靶标结合（图 1B）。探针的这个短单链部分赋予了靶标特异性，但阻止了与这 10 个核苷酸甚至只有一个错配的 RNA 的交叉反应性（图 1B）。一旦探针的 5' 端结合其目标，被动链位移就会从探针上剥离掩模，允许 3' 区域结合目标并产生稳定的目标标记（图 1B）¹⁸。因此，SNP-FISH 可以通过使用一对具有不同荧光团的探针来差异地可视化与单个 SNP 不同的 RNA，每个探针补充不同的 SNP，但共享一个共同的掩码（图 1C）。虽然这种方法只将单个荧光团偶联的探针募集到目标 SNP，但将多个探针掩码集汇集到共享 rDNA 单倍型中的多个 SNP 可用于扩增单个 rRNA 的 SNP 敏感检测（图 1D）。此外，由于 rRNA 的转录水平如此丰富，因此在 FISH 实验中，使用每个 RNA 的少量荧光标记，可以很容易地可视化 rRNA 转录本。每个 RNA 对荧光团的低要求意味着 SNP-FISH 只需几个独特的 SNP 即可可视化来自特定位点的 rRNA。该方法可以轻松检测各种果蝇组织和发育阶段中的基因座特异性 rRNA 转录¹⁷。它对果蝇雄性种系干细胞特别有效，在衰老过程中，果蝇在排他性 Y-rDNA 转录和 X 和 Y 染色体 rDNA 基因座的共表达之间发生变化¹³。在这里，我们提供了一个 SNP-FISH 方案来可视化果蝇睾丸中不同的 X 和 Y rRNA 转录本，以实现评估基因座特异性 rRNA 沉默的总体目标。该方法使用先前在常见的 y¹w¹ 实验室果蝇菌株的 X 和 Y 染色体上的 rDNA 基因座之间表征的四个 SNP（图 1D）。

Protocol

1. 缓冲液和试剂的制备

注:在整个步骤 1、3 和 4 中使用无 RNase 技术，并且应使用经认证的无 RNase 试剂。

1. 在化学通风橱中，通过将 10 mL 16% 甲醛和 4 mL 不含 RNase 的 10x PBS 添加到 26 mL 不含 RNase 的水中，在 1x PBS 固定溶液中制备 40 mL 4% 甲醛。分成 1 mL 等分试样，并在制备后 30 分钟内储存在 -20 °C 下。固定溶液可在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
   注意:溶液中含有甲醛。戴上手套和适当的个人防护装备处理并安全处理。
2. 通过将 1 mL 不含 RNase 的盐水柠檬酸钠 （SSC）、1 g 硫酸葡聚糖、100 μL 100 mg/mL 酿酒 酵母 tRNA、100 μL 200 mM 钒核糖核苷复合物、1 mL 不含 5% RNase 的 BSA、1 mL 去离子甲酰胺与 6 mL 不含 RNase 的水混合来制备 10 mL 杂交缓冲液。在 1.5 mL 微量离心管中分成 1 mL 等分试样，并在 -20 °C 下储存长达 1 个月。
3. 加入 5 mL 不含 RNase 的 SSC、5 mL 去离子甲酰胺、50 μL Triton-X 到 40 mL 不含 RNase 的水中，制备 50 mL 洗涤缓冲液。在室温下避光保存长达 1 个月。
4. 向 9.8 mL 水中加入 100 μL 1M Tris-HCl pH 7.5-8.0、20 μL 0.5M EDTA 和 50 μL 5M NaCl，制备 10 mL DNA 分离缓冲液。

2. X 和 Y 特异性 rRNA SNP 的样本基因分型

1. 在 0.2 mL 试管中收集个体未交配的纯合 X 雌性和携带相同 X 染色体的雄性，并在冰上冷却。
2. 将 50 μL DNA 分离缓冲液与每个样品中 0.5 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K 混合。
3. 向果蝇样品中加入 50 μL DNA 分离缓冲液/蛋白酶 K，并使用移液器吸头对样品进行均质化。
4. 将样品在 37°C 下孵育 30 分钟，然后在 95°C 下孵育 2 分钟。将 40 mL 样品（避免动物粪便）转移到干净的 1.5 mL 试管中。
5. 使用 10 μM 浓度的以下引物对，通过 PCR 分别扩增每个 DNA 样品中的每个 SNP 靶标区域:18S SNP 正向 + 反向;ITS1 SNP 正向 + 反向;28S SNP 正向 + 反向。引物序列和预期的 PCR 扩增子大小见 表 1。
6. 使用凝胶电泳在 1% 琼脂糖 1x TAE 凝胶上分离整个 PCR 样品，以确认预期的 PCR 产物。 表 1 中列出了预期的产品尺寸。
7. 使用任何市售的凝胶提取试剂盒从凝胶中分离 PCR 产物。
8. 通过 Sanger 测序对 PCR 产物进行测序。对每个靶标的 F 和 R 引物使用单独的单独反应对样品进行双向测序。
9. 在未交配的女性 DNA 样品中确定 表 2 中位置的 X 染色体 SNP 变体。预期的 X 单倍型如 表 2 所示。
10. 观察雄性 DNA 样品测序色谱图中的 SNP 位置。根据每个 SNP 位置已经确定的 X SNP 变体推断 Y 染色体 SNP 变体。预期的 Y 单倍型如 表 2 所示。

引物名称	序列	预期扩增子大小
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652 基点
18 秒 SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTGTTTC	955 基点
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG
28 秒 SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG	598 基点
28 秒 SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA

表 1:用于 rDNA SNP 测序的引物序列。 引物对，用于扩增在 18S、ITS1 和 28S rDNA 区域中包含先前表征的 SNP 的 rDNA 区域。列出了引物寡核苷酸序列和预期的 PCR 扩增子大小。

单倍型	SNP 位置	序列
X rDNA 抗体	18 秒	1603-阿塔特TTTTTCATATG-1625
	ITS1-1 系列	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ITS1-2 系列	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28 秒	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA 抗体	18 秒	1603-阿塔特CTTTTCATATG-1624
	ITS1-1 系列	2873-CGTTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ITS1-2 系列	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28 秒	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

表 2:预期的 rDNA 单倍型。 在 y¹w¹ 果蝇菌株中 X 和 Y 染色体 rDNA 位点的预期 SNP。SNP 以粗体和下划线表示。根据共有 45S rRNA 序列列出位置（补充文件 1）。

3. 睾丸解剖、固定和透化

1. 用 70% 乙醇（或其他 RNase 处理）清洁立体显微镜、工作站、解剖盘和解剖镊子。
2. 在立体显微镜下，解剖 果蝇 以在 1x 无 RNAse PBS 中分离睾丸。用一对镊子抓住动物腹部的中间，用另一对镊子抓住腹部末端，轻轻地将动物拉开。睾丸会与动物分离，可以使用镊子进一步分离。每个样本收集 30 - 40 个睾丸。
3. 使用镊子拾取睾丸并将其从解剖皿转移到含有 0.5 mL 1x RNase 无 PBS 的 1.5 mL 微量离心管中。
4. 吸出 PBS 并加入 1 mL 固定溶液。在章动摇床上室温孵育 30 分钟。吸出固定剂。
5. 在章动摇床上用 1 mL 的 1x 不含 RNase 的 PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。吸出 1x PBS 并加入 1 mL 不含 RNase 的 70% 乙醇 （EtOH）。在 4 °C 下在章动摇床上孵育过夜。

4. SNP 敏感的核糖体 RNA FISH

1. 吸出乙醇并加入 1 mL 洗涤缓冲液。在章动摇床上室温孵育 3 分钟，然后将试管直立放置 2 分钟。
2. 将探针和掩模与杂交缓冲液混合，每个样品的总体积为 100 μL。探针、掩模序列和荧光团标记见 表 3。当使用所有 4 个 SNP 时，准备 80 μL 杂交缓冲液、10 μM Y-SNP 探针各 1 μL（共 4 μL）、10 μM X-SNP 探针各 1 μL（共 4 μL）和 10 μM 通用掩码各 3 μL（共 12 μL）
3. 吸出洗涤缓冲液，然后加入 100 μL 杂交溶液。在管的边缘贴上透明薄膜，用铝箔包裹以避光，并在 37 °C 水浴中孵育至少 24 小时。
4. 向样品中加入 1 mL 洗涤缓冲液，而不吸出杂交溶液。在 37 °C 水浴中避光孵育 30 分钟。
5. 吸出洗涤缓冲液，然后向样品中加入 1 mL 洗涤缓冲液。在 37 °C 水浴中避光孵育 30 分钟。
6. 吸出洗涤缓冲液并加入 50 μL 封固剂。样品可以立即封片在载玻片上，或在封片前在 4 °C 下储存长达 1 周。

SNP 位置	寡 核苷酸	序列		3' 偶联荧光基团
18 秒	X SNP 探针	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		亚历克萨 488
	Y SNP 探针	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		亚历克萨 647
	面具	TATGTGATTAAATACT
ITS1-1 系列	X SNP 探针	AAATATTTATTAACGGTAAGGATATT		亚历克萨 488
	Y SNP 探针	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		亚历克萨 647
	面具	AATATCCTTACCGTTA
ITS1-2 系列	X SNP 探针	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		亚历克萨 488
	Y SNP 探针	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		亚历克萨 647
	面具	GTTTCGAACATGAAAA
28 秒	X SNP 探针	TTAGGCATTTTTGTTTTACTTGAAAA		亚历克萨 488
	Y SNP 探针	TTAGCCATTTTTTTTACTTGAAAA		亚历克萨 647
	面具	TTTTCAAGTAAAACAA

表 3:rDNA SNP-FISH 的探针和掩蔽序列。 SNP 位置以粗体突出显示。与掩蔽寡核苷酸结合的探针部分用下划线标出。列出了合适的 3' 偶联荧光基团的示例，但可以使用任何兼容的荧光基团。

5. 制备成像样品

1. 在解剖立体显微镜下工作，使用广口移液器将样品转移到显微镜载玻片上。
2. 使用镊子将睾丸排成一条线，以便在成像时轻松找到样本（不需要特定方向）。用盖玻片盖住样品。用组织擦拭布吸干盖玻片边缘以去除多余的封固剂。
3. 用指甲油密封盖玻片的边缘。将玻片在室温下避光放置 10 分钟，让指甲油干燥。载玻片可立即用于共聚焦成像，或在成像前在 4 °C 下储存长达一个月^。

Results

SNP 基因分型的测序结果有望检测 X 和 Y rDNA 位点之间的 SNP 差异。通过直接评估测序色谱图中的 SNP 位置来检测这些 SNP （图 2）。预计女性样本的测序在 SNP 位置有一个测序信号，表明两条 X 染色体之间的 SNP 纯合性 （图 2A）。预计雄性样本测序结果在 SNP 位置会有一个双峰 （图 2B）。根据从女性样本测序中确定的 X 染色体基因型，非 X 变体被推断为 Y 染色体 rDNA SNP（即图 2 中 18S SNP 测序的 X = T、Y = C）。或者，雄性样品中 SNP 位置的单个测序峰表明该 SNP 位置的雄性和雌性 rDNA 位点之间的纯合性，并且该位置不适用于 rRNA SNP-FISH。

按照 SNP FISH 的方案，可以通过安装在载玻片上并放置在密封的盖玻片下来观察样品，然后进行共聚焦显微镜检查。使用表 3 中列出的探针，通过 Alexa Fluor 647 发射检测 Y 衍生的 rRNA 信号，通过 Alexa Fluor 488 发射检测 X 衍生的 rRNA 信号。预计在核仁中观察到 rRNA 信号，这可以被识别为细胞核中 DAPI 贫乏的空穴（图 3A）。由于胚核和核仁大，核仁在生殖细胞中特别容易识别（图 3A）。微弱的信号通常也可以在细胞质中找到（图 3），但这是一种非特异性信号，也可以在不含互补 SNP 的 rRNA 的样品中检测到（即，在缺乏 Y rDNA 的细胞中发出 Y 信号，或在缺乏 X rDNA 的细胞中检测到 X 信号;图 3B-C）。此外，有时可以在体细胞枢纽中检测到 X 和 Y rRNA 的人工共标记，即使在缺乏 X 或 Y rDNA 位点的样品中也是如此（图 3B-C，黄色箭头）。因此，应仅使用核信号来评估基因座特异性转录。大多数细胞，尤其是体细胞，预计只有 Y rRNA 信号，这表明 rRNA 完全从 Y rDNA 基因座转录（图 3A、黄色虚线圆圈和红色箭头）^10,17。然而，在生殖细胞中经常检测到 X 和 Y rRNA 的共表达，尤其是生殖干细胞¹³（图 3A，白色虚线圆圈）。共表达细胞中的 X 和 Y rRNA 信号可以是相邻的并形成单个核仁（图 3A 顶部细胞），也可以分开，形成两个核仁（图 3A 底部细胞）。图 3 中的示例来自 rDNA SNP-FISH，使用仅靶向两个 SNP（两个 ITS1 SNP）的探针集，表明 rDNA SNP-FISH 只需要两个 SNP。然而，当使用靶向所有四个 SNP 的探针时，可以观察到更稳健的信号¹³。

阴性对照是该检测的一个重要内容，用于确认探针不会与错误的 SNP 靶标发生交叉反应，尤其是在首次对方法进行故障排除时。X 染色体阴性对照包括任何缺乏 X 染色体 rDNA 的情况，例如携带 r DNA 缺失的 X 染色体的男性。预计 X 染色体阴性对照仅检测 Y rRNA 信号，而不检测 X rRNA （图 3B）。Y 染色体阴性对照包括任何缺乏 Y 染色体 rDNA 的情况。这些情况的一些例子是任何 XX 女性组织、来自缺乏 Y 染色体的男性组织或携带 r DNA 缺失¹⁵ 的 Y 染色体的男性组织。预计 Y 染色体阴性对照仅检测 X rRNA 信号，没有可检测的 Y rRNA 信号 （图 3C）。请注意，这些对照不仅对于确定探针特异性很重要，而且对于确定任何信号背景或伪影也很重要。任何在此类对照中提供特异性的新型探针或检测条件都可以准确用于检测基因座特异性 rDNA 转录。

不同的遗传、发育或环境条件可能会改变 rDNA 仅从 Y 染色体 rDNA 基因座转录的可能性^13,17。可以定量单个基因座或多个基因座的 rDNA 转录频率，并在样品之间直接进行比较。为了定量比较 rDNA 位点转录的差异，必须将每个细胞单独分类为 Y 显性、共显性或 X 显性。如果仅检测到相应的信号，则细胞仅被归类为 Y 显性和 X 显性。任何同时具有 Y 和 X rRNA 信号的细胞都被认为是共显性的，即使一个信号比另一个信号弱得多。因此，包含非常强的 X 和 Y 信号的细胞在定性上被认为与具有强 Y 和弱 X 或强 X 和弱 Y 信号的细胞相同。可以通过卡方检验比较每个类别中所有样品中所有细胞的总百分比。虽然该测定法可以很好地定性地确定特定的 rDNA 位点是否被转录，但在直接量化单个 SNP-FISH 信号的荧光强度时，我们没有观察到样品之间的一致评估。因此，我们不建议对样品之间的 FISH 信号强度或单个细胞内 X 和 Y rDNA 信号的相对强度进行定量评估。这种荧光强度不一致的来源尚不清楚，但这可能是由于未与所有靶 rRNA 结合的掩蔽探针的结合效率低下。

图 1:SNP-FISH 方法示意图。 （A） 传统的 FISH 反义寡核苷酸探针与仅差一个核苷酸的非靶 RNA 发生交叉反应。（B） SNP-FISH 方法使用与寡核苷酸探针的 3' 区域结合的互补掩蔽寡核苷酸。掩蔽只留下 10 个核苷酸自由结合到目标序列上。未掩蔽的探针区域不能稳定地与一个或多个核苷酸不同的非靶序列结合。探针与靶标结合后，掩膜从探针上解离，从而允许探针和靶标之间稳定结合。（C） 不同标记的配对 SNP 探针与共同掩模相结合，可特异性结合差异为单个核苷酸的靶标，而不会发生交叉反应。（D） 可以将多个探针混合在一起，以特异性标记不同的 rRNA 单倍型。在 y¹w¹ 黑腹果蝇 菌株中，X 和 Y rDNA 位点之间已经表征了 4 个 SNP 差异。一个 SNP 在 18S rRNA 中，一个在 28S rRNA 中，两个在 ITS1 前体 rRNA 部分。显示了用于 SNP-FISH 的 X 和 Y 特异性 rRNA 单倍型。靶向四个 rRNA SNP 的 X rDNA 变体的探针与共同的荧光基团偶联（绿色），靶向 Y rDNA 变体的探针与不同的荧光基团（品红色）偶联。每个 SNP 都使用一个通用掩码（总共四个）。在 rRNA 上每个 SNP 位置的 SNP 特异性探针结合可以使用多达四个 FISH 寡核苷酸探针特异性标记 X 和 Y rDNA 位点的 rRNA。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:纯合子和杂合子 rDNA SNP 测序结果的示例。 来自 （A） 女性和 （B） 男性样品 DNA 的 18S SNP 测序的示例色谱图。18S SNP 位置由星号 （*） 表示。女性样品中 SNP 位置的单个胸腺嘧啶 （T） 信号表明胸腺嘧啶位于 X 染色体 rDNA 基因座中的 SNP 位置。在雄性样本中，胸腺嘧啶和胞嘧啶 （C） 之间 SNP 位置的双信号表明 Y 染色体 rDNA 基因座中 SNP 位置的胞嘧啶（通过知道胸腺嘧啶位于 X 染色体基因座来推断）。使用 ApE – 质粒编辑器软件¹⁹ 查看测序结果。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:仅使用两个 SNP-FISH 探针组的 果蝇 睾丸中的 SNP-FISH 结果示例。 动物睾丸中具有 （A） X 和 Y rDNA、（B） 仅 Y rDNA 或 （C） 仅具有 X rDNA 的动物睾丸中的 SNP FISH 示例。这些示例仅使用标记两个 ITS1 rRNA SNP 的探针组，表明 rRNA SNP FISH 适用于两个目标 SNP。生殖细胞通过其大圆核识别，而体细胞则通过其较小和较小的圆核识别。种系干细胞通过它们在体细胞枢纽旁边的位置来识别，用星号 （*） 标记。从 X 和 Y rDNA 基因座转录 rDNA 的生殖细胞可通过 X 和 Y 核 FISH 信号（白色虚线圆圈，A-A''）进行鉴定。仅转录来自 Y rDNA 位点的 DNA 的生殖细胞只有一个 Y 核 FISH 信号（黄色虚线圆圈）。仅表达 Y 的体细胞用红色箭头标记。可以在体细胞枢纽（黄色箭头）中观察到 X 和 Y rDNA 位点的人工共标记。比例尺为 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件 1:X 染色体基因座的 rRNA 序列。请点击此处下载此文件。

Discussion

在这里，我们描述了一种使用 SNP-FISH 区分源自 黑腹果蝇 组织中 X 和 Y 染色体 rDNA 基因座的 45S rRNA 转录本的方法。该方案中最关键的步骤是对用作 SNP-FISH 靶标的 45S SNP 进行准确基因分型。我们提供对四种已知 果蝇 45S SNP 进行基因分型的引物和方案，但其他测序方法可能会揭示可用于检测的新 SNP。在 X 和 Y 染色体 rDNA 基因座之间发现的任何 SNP 位置相同（即，雄性 DNA 样品中只有一个测序峰）都不能用于 SNP FISH。在单个 rDNA 位点中，可能会发现一些 SNP 位置是异质的（即，测序结果没有给出 XX 样本的单个 SNP 变体，或者 XY 样本中只有一个非常小的第二个测序峰）。在单个 rDNA 位点内异质性的 SNP 也不适合这种检测，因为其中一个变体将在两个 rDNA 位点之间共享，从而使来自单个位点或多个位点的转录无法区分。此外，由于雌性精子储存²⁰，从交配雌性中分离的 DNA 可能含有 Y 染色体 rDNA。因此，将未交配的雌性用于 XX 测序分析至关重要。重要的是，这种方法需要至少两个染色体特异性 SNP，以使至少两个基因座特异性探针能够结合每个 rRNA 分子进行检测，从而将其应用于 rDNA 基因座，它们之间至少有两个不同的 SNP。更多 SNP 的可用性允许更多的探针结合每个 rRNA，并且可以提供更高的信号有效性。有趣的是，这种方法仅标记核仁中的 rRNA，尽管有两个探针对靶向 18S 和 28S rRNA 中的 SNP，这些 SNP 被输出到细胞质中（包含两个 ITS1 靶位点的 rRNA 仅存在于核仁中）。缺乏细胞质 FISH 信号表明两种非排他性的可能性:1） 单独的 18S 和 28S 探针不足以检测细胞质 rRNA，可能是因为 rRNA 在整个细胞质中比在核仁中更分散，或 2） 探针对整合到成熟核糖体亚基中的 rRNA 的结合效率低于与未加工的 45S rRNA 的结合效率。18S 和 28S rRNA 中的其他 SNP 可能使细胞质 rRNA 的 SNP 敏感 FISH 检测成为可能。

评估基因座特异性 rRNA 转录的其他方法包括 rRNA 测序方法，该方法区分分配给特定基因座的 rRNA 变体的表达⁶。同样，qPCR 可以差异评估 rRNA 变体的表达，这些变体足够独特，可实现独特检测 ^5,21，但尚不清楚这些变体的沉默是否代表整个 rDNA 基因座的沉默。虽然这些方法可以有效地定量特定 rRNA 变体的表达，但它们不能用单细胞分辨率来完成。果蝇组织中 X 染色体 rDNA 沉默的异质性表明 rDNA 基因座转录存在很强的细胞间变异¹⁷，并突出了对能够解释这种变异性的技术的需求。与 rDNA 基因座活性转录相关的成像特征，例如 H3.3 组蛋白变体¹⁰ 或 Pol I 转录因子 UBF²²，已被用于鉴定具有单细胞分辨率的基因座特异性 rRNA 转录。然而，这两种方法都需要有丝分裂细胞的浓缩染色体，以区分发生在任何特定 rDNA 基因座的转录。在果蝇细胞中，X 和 Y 染色体的 rDNA 位点可以通过染色体形状¹⁰ 来识别，但鉴定人类细胞中具有转录活性的 rDNA 位点也需要与染色体特异性标记物共染色²²。SNP-FISH 方法不需要染色体特异性共标记或转录标记物标记，可以在任何细胞周期阶段或有丝分裂后细胞中进行评估，为在不同组织和实验条件下的使用提供了灵活性。

这种 rRNA SNP-FISH 方法可以修改以用于区分 果蝇 rRNA 的其他 SNP，或可能应用于区分其他生物体中 rDNA 位点的 SNP。将这种方法应用于具有两个以上 rDNA 基因座的生物体将要求一个基因座具有独特的 rDNA 变体单倍型，其中包含至少两个 SNP，这两个 SNP 不存在于任何其他 rDNA 基因座上，并且在该基因座的所有 45S 拷贝之间共享。这一要求意味着与所有其他基因座相比，该方法只能指定来自一个特定基因座的转录（即，来自基因座 1 的 rRNA SNP 与基因座 2 和 3 共享的 SNP 相比）。然而，如果每个 rDNA 基因座都有一个兼容的单倍型，则可以结合多个实验来一次单独评估每个基因座的转录。该方案中使用的杂交温度 （37 °C） 的相对较低的严格性允许强烈的探针结合，特别是考虑到探针的短而未掩蔽的部分，尽管在较高温度 （50-75 °C） 下的杂交已被证明可以增强某些 FISH 探针的信号²³。较高的杂交温度可能会增强掩膜链置换并增加探针结合，但过高的温度可能会破坏探针-掩膜结合的稳定性并失去 SNP 特异性。因此，我们不希望 SNP-FISH 特异性标记 DNA，因为熔解双链 DNA 靶标以实现探针结合所需的温度也会破坏探针-掩膜结合的稳定性并消除 SNP 敏感靶标特异性。尽管如此，优化新 rRNA SNP 探针的杂交温度可能会增加信号，特别是当只有两个 SNP 位点可用时。X 染色体 rDNA 沉默的缺失与 果蝇¹³ 中 rDNA 拷贝数的减少有关，因此开发 SNP-FISH 检测试剂盒来表征其他系统中基因座特异性 rRNA 转录，可以作为评估 rDNA 完整性和核糖体功能的有用工具。此外，该方法已被修改为与 果蝇中的缺失变体一起使用，并且这种单一结构 rRNA 变体适合检测（可能是由于没有探针掩码的靶标结合亲和力更高）¹⁷。使用结构 rRNA 变体可能与 SNP 变体结合，拓宽了在其他系统中应用的可能性。由于调节 rDNA 位点转录的机制在很大程度上仍不清楚，rRNA SNP-FISH 的灵活性和对其他系统的潜在适应性使其成为未来研究 rRNA 转录的有力工具。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 热循环仪	Bio Rad	12015382	任何热循环仪均可使用
0.2 mL 8 联排平盖 PCR 管	VWR	89133-912	任何兼容管
1 kb DNA 分子量标准	NEB	N3232S	通过凝胶电泳检查测序 PCR 扩增子大小时使用
1.5 mL 刻度微量离心管	USA Scientific	1615-5510	任何经认证的无 RNase 试管均可进行
2 mM dNTP 混合	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE 缓冲液	Bio Rad	1610743	用于凝胶电泳。可以使用任何 TAE 缓冲液。
5M NaCl			任何 NaCl 都可以使用或从任何来源制备
琼脂糖	VWR	97064-250	任何琼脂糖都可以使用
ApE - 质粒编辑器软件	N/A	N/A
透明指甲油			可以使用任何零售商的任何指甲油
盖玻片，1 号厚度	Thomas Scientific	6672A38
去离子甲酰胺	Fisher Scientific	NC9569627
葡聚糖硫酸钠	Sigma Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Green PCR 预混液	ThermoFisher Scientific	K1081
Dumont #5 镊子	精细科学工具	11252-20	用于解剖样品
EDTA （0.5M），Ph 8.0	ThermoFisher Scientific	R1021	可以使用任何类似产品
乙醇	VWR	89125-172	可以使用任何 200 标准乙醇。用于稀释至 70% 乙醇，用于透化和清洁无 RNASE 条件
溴化乙锭	ThermoFisher Scientific	15585011
水平微型凝胶电泳系统	Fisher Scientific	14-955-170	任何凝胶电泳系统均可使用
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
微量测试染色皿	电子显微镜科学	71564	用于解剖样品
章动摇床	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	任何章动摇床都可以使用
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
磷酸盐缓冲盐水 （10X） pH 7.4，无 RNase	Life Technologies	AM9624
Pierce 16% 甲醛 （w/v），无甲醇	Life Technologies	28908
Precision 通用水浴	Life Technologies	TSGP02	任何水浴均可使用
QIAquick 凝胶提取试剂盒	Qiagen	28704	任何凝胶提取试剂盒
蛋白酶 K 溶液 （20 mg/mL）	Invitrogen	AM2546	任何类似产品均可使用
不含 Rnase 的 UltraPure BSA	ThermoFisher Scientific	AM2618
S. cerevisiae tRNA	Sigma Aldrich	R8759
SSC （20X），无RNase	的Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl缓冲液，pH 7.5	ThermoFisher Scientific	15567027	任何类似的产品都可以使用
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水	Life Technologies	10977023
Vanadyl 核糖核苷复合物	NEB	S1402S
VECTASHIELD 封固剂与 DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VWR Superfrost 显微镜载玻片	VWR	48311-601
y[1]w[1] 黑腹果蝇 系列	布卢明顿果蝇库存中心	1495
蔡司 LSM 980 共聚焦显微镜	蔡司显微镜		任何具有兼容发射和检测的共聚焦显微镜 蔡
Stemi 2000-C 体视显微镜和光源	显微镜 中央	显微镜 455053	任何立体显微镜都可以使用