一种从单个小鼠胚胎干细胞生成神经管类器官的稳健且可重复的实验方案

摘要

由小鼠胚胎干细胞衍生的三维神经管类器官（NTOs）是研究中枢神经系统早期发育的有力工具。本文逐步演示一种优化的NTOs培养方案 体外，提供了稳定的培养条件以及可靠的、可重复的NTO生成的故障排除策略。

摘要

哺乳动物的发育是一个高度复杂的过程，其特征在于需要精确的浓度和时间依赖性信号传导，以实现正确的模式形成和形态发生。尽管技术不断进步并积累了大量知识，哺乳动物发育的许多方面仍然不甚清楚。在研究整个生物体时，很难解析个别信号通路的作用，或阐明外部刺激如何引导周围组织和因子相互作用的机制。为应对这一复杂性，三维（3D） 体外 类器官等模型已成为重要的研究工具。类器官源自胚胎干细胞（ESCs）或诱导性多能干细胞（iPSCs），具有类似组织的特征，与其来源组织高度相似 体内 在表达模式和功能方面与其对应物相似。重要的是，它们可在受控的实验条件下进行操作并开展广泛的生物学研究。尽管来源于多能性细胞培养，类器官系统常表现出异质性和显著的变异性，这限制了其在研究复杂精细生物学问题时的应用。因此，迫切需要制定详细的实验方案，以统一操作流程，获得高质量且可重复的数据，减少材料使用，并能够深入探究复杂的生物学现象。在此背景下，本文提供了一种优化的神经管类器官（NTOs）培养方案 体外 本文介绍了一种通过建立稳定的培养条件并提供全面的故障排除策略，以可靠且可重复地生成神经管类器官（NTOs）的方法。该模型适用于研究神经诱导、模式形成及中枢神经系统早期发育等相关科学问题。

引言

哺乳动物的发育始于一个单一的全能性干细胞，是一个涉及模式形成和形态发生诱导的复杂过程^1,2。这一发育过程需要严格调控的细胞程序，以协调细胞与其环境之间的动态相互作用。干细胞具有内在能力，可感知、整合并响应包括形态发生素浓度梯度³、机械边界⁴、细胞增殖以及环境重塑⁵在内的系统性和局部信号。外部的时空信号同样驱动多细胞协同响应，最初在均质组织中发挥作用，以确保复杂结构的精确构建。干细胞以其自我更新^6,7和分化能力为特征，在胚胎发育和成体组织修复中发挥关键作用，主要包括胚胎干细胞（ESCs）、成体干细胞（ASCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）。

胚胎干细胞（ESCs）从囊胚的内细胞团（ICM）中分离获得，通常使用特定培养基在饲养细胞或细胞外基质上进行二维（2D）培养，以维持其多能性⁸近年来，对更接近生理条件的细胞培养环境和技术的需求急剧增加，因此建立了三维（3D）细胞和组织模型，用于研究基本的生物医学过程⁹在发....

方案

注意：在进行任何后续操作（如更换培养基、处理、固定等）之前，需每天检查细胞和神经管类器官（NTOs）的质量。所有需要将细胞直接暴露于空气中的操作均须在生物安全柜内进行，以确保无菌并防止培养物污染。

1. 神经管类器官分化用小鼠 ESC 的维持、传代与接种

1. 传代
   1. 将胚胎干细胞（ESCs）培养在预先用0.15%明胶在37℃下孵育30分钟的细胞培养皿或6孔板的孔中 °C.
   2. 每2-3天传代一次胚胎干细胞，从第2天开始每日更换培养基。
   3. 预热所有试剂（培养基、PBS、酶溶液）至至少 21 °C 和最高 37 °使用前置于冰上。
   4. 在相差显微镜下观察细胞（参见代表性图像， 图2）。确保细胞集落具有适当的大小和正确的形态（图 2A），同时确认其已贴附于培养皿底部。
      注意：如果超过10%的小鼠ESC发生分化，则弃去该培养物图2B），并准备新复苏的培养物，在将胚胎干细胞（ESCs）接种用于分化实验之前，至少传代两次。有经验的研究人员可通过视觉评估进行判断（另请参见 Mulas 等人）。²⁸

结果

本研究中所有图示的代表性示例均使用R1小鼠胚胎干细胞（ESCs）。其他类型的小鼠ESCs在用于NTOs培养时，可能在上皮化时间、神经分化或模式形成效率方面表现出轻微差异，但结果应与本文所示数据无显著差异。

只有高质量的 ESC（图 2A）以适当的细胞密度接种（图 3）才能形成高质量的 NTO（图 4B）。当高质量的 ESC（图 2）以适当的密度（图 3）接种于细胞培养基质中时，这些单个细胞将在两天内发生克隆性扩增并发生上皮化（图 4B、C）。NTO 呈光滑、圆形至椭圆形，具有单个腔室。未能完成上皮化的 NTO 缺乏腔室形成，仍可见单个细胞（图 4E

讨论

在此，针对原始方案进行了多项优化改进，以生成高质量的NTOs，从而促进各实验室间的标准化。关键修改包括不同的ESC培养条件、减少起始细胞数量、改进的分化培养基、优化的分化流程，以及为使用多孔板进行高通量分析而调整的接种密度。该方案中多个环节对于获得可靠且可重复的结果尤为关键。首先，必须使用具有适当蛋白浓度的正确细胞培养基质，因为不合适的浓度会负面影响NTO的模式形成效率（参见 表3。其次，细胞必须以单细胞形式按正确密度接种；若接种细胞团块，则可能导致 "葡萄状" 类器官形成及具有多个腔室的非上皮化 NTOs³²第三，接种前必须完全去除ESC维持培养基中的2iLIF，因为任何残留都可能影响NTO上皮化（参见 表3第四，第2天使用250 nM视黄酸（RA）处理18小时对正确的模式形成至关重要，这与参考文献24中的发现一致，因为较低浓度或较短的处理时间会降低模式形成的效率。第五，固定应使用2% PFA进行，因为较高浓度可能溶解细胞培养基质。第六，建议进行长时间染色，即抗体孵育过夜，以确保充分渗透，便于后续三维分析.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿 | 1.5 号盖玻片 | 14 mm 玻璃直径 | 未包被	MatTek Corporation	Cat# P35G-1.5-14-C
Accutase	Invitrogen	Cat# 00-4555-56
牛血清白蛋白（BSA）V 组分（pH 7.0）	Panreac AppliChem	Cat# A1391
全反式维甲酸	Merck	Cat# R2625
B-27 添加剂（50X），无血清	Gibco	Cat# 17504044
基底膜基质（Matrigel）	Corning	Cat# BDL354234	蛋白浓度 10 mg/ml
CellCarrier-96 超微孔板	PerkinElmer	Cat# 6055302
CellProfiler 4	Stirling et al. 2021		https://cellprofiler.org
CHIR 99021	Tocris	Cat# 4423
CUBIC-R+(N)	Matsumoto et al, 2019	N/A
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	Cat# D2650
DMEM/F-12，无谷氨酰胺	Gibco	Cat# 21331020
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS, 1X）	Gibco	Cat# 14190144
Eppendorf 离心机 5810 R	Eppendorf	Cat# 5811000015
Eppendorf 微量离心管 3810X	Merck	Cat# EP0030125150
Falcon 锥形离心管	Corning	Cat# 352095
明胶	Merck	Cat# G2500
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	Cat# A2916801
HeracellVIOS 160i CO2 培养箱，165 L	ThermoFisher Scientific	Cat# 51033557
Imaris	Oxford Instruments		https://imaris.oxinst.com
倒置 LED 相差显微镜（CKX53）	Olympus
2-巯基乙醇（50 mM）	Gibco	Cat# 31350010
单克隆小鼠抗 OCT-3/4	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-5279; RRID:AB_628051	使用比例 1:200
单克隆小鼠抗 PAX3	DSHB	Cat# PAX3-C; RRID:AB_528426	使用比例 1:100
单克隆兔抗 SHH	Cell Signalling Technologies	Cat# 2207; RRID:AB_2188191	使用比例 1:300
单克隆兔抗-β3-微管蛋白	Cell Signalling Technologies	Cat# 5568; RRID:AB_10694505	使用比例 1:500
单克隆小鼠抗 ZO-1	Invitrogen	Cat# 33-9100; RRID:AB_2533147	使用比例 1:200
小鼠白血病抑制因子（LIF）	Qkine	Cat# Qk018-1000
N-2 添加剂（100X）	Gibco	Cat# 17502048
Neurobasal 培养基	Gibco	Cat# 21103049
多聚甲醛，试剂级，结晶状	Merck	Cat# P6148
PD 0325901	Tocris	Cat# 4192
青霉素-链霉素溶液	Gibco	Cat# 15140130
相差显微镜
多克隆山羊抗 FOXA2	R&D	Cat# AF2400; RRID:AB_2294104	使用比例 1:400
多克隆山羊抗 SOX1	R&D Systems	Cat# AF3369; RRID:AB_2239879	使用比例 1:200
与图6相关的RNA-Seq数据	Ishihara et al., 2022	GEO: GSE214368
SafeFAST Premium 微生物安全柜	Dasit group FASTER	Cat# F00025200000
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	Cat# 11360070
转盘共聚焦倒置显微镜（IX3）	Olympus
Triton X-100	Sigma Aldrich	Cat# 9036-19-5