本方案介绍了如何使用MEDUSA分析方法来定量评估每个基因敲除的死亡调控效应。内容包括优化灵敏度的实验条件确定方法，以及进行该分析的分步教程。
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本文内容
摘要
摘要
系统性筛选基因功能的获得或缺失扰动可用于表征几乎所有感兴趣细胞过程的遗传依赖性及调控机制。这类实验通常涉及对单个基因扰动文库进行分析，以评估每个基因扰动对细胞相对适应性的影响。当应用于药物疗效研究时（常称为化学遗传学分析），这些方法应能有效识别药物的作用机制。然而，基于适应性的化学遗传学分析在识别药物反应所有组分方面效果有限。例如，这类研究通常难以鉴定调控药物诱导细胞死亡的基因。多种因素会干扰在基于适应性的筛选中对死亡调控的识别，包括增殖速率差异的混杂效应、药物诱导的生长与死亡之间协调性的变化，以及在某些情况下无法将活细胞与死细胞的DNA区分开来。MEDUSA 是一种用于在常规化学遗传学分析数据中识别调控细胞死亡基因的分析方法。该方法通过计算模拟，估算产生观测到的适应性谱型的生长速率和死亡速率，而非直接评分适应性本身。该方法的有效应用依赖于对实验条件（包括药物剂量、起始细胞群体大小以及检测持续时间）的优化滴定。本文将介绍如何设置适用于 MEDUSA 分析的化学遗传学分析实验，并演示如何利用该方法在化学遗传学分析数据中定量细胞死亡速率。
引言
在化学-遗传谱型分析中，通过系统性遗传扰动来研究每个基因对特定药物反应的贡献1,2,3。这类实验具有重要价值，能够揭示有关药物反应的重要信息，包括药物的结合靶点以及药物进入和排出细胞的机制。然而，由于这些实验通常以混合方式同时评估所有基因，因此从化学-遗传谱型数据中获得机制性见解可能具有挑战性。
药物诱导的细胞死亡的调控机制和遗传依赖性在化学遗传学分析数据中往往难以解析。造成这一问题的原因有多种，但许多都源于细胞增殖差异的影响4。例如，由于细胞呈指数增殖，遗传扰动对增殖速率的影响对群体大小的作用远大于对细胞死亡率变化的影响。此外，由于这种偏倚性的敏感度随时间加剧，而此类实验通常持续数周，大多数研究被优化为对增殖缺陷高度敏感，而对药物诱导的细胞死亡变化基本不敏感。其他与增殖相关的问题还包括增殖与死亡之间协调关系的差异（例如，每个克隆在死亡的同时增殖速度有多快，以及不同遗传扰动之间是否存在差异），以及在无药物条件下各克隆增殖速率的差异，这会改变在药物无效时本应或可能回收的细胞数量。根本在于，化学遗传学分析实验通常通过与相对群体大小成比例的测量值来评估遗传扰动的影响，比较处理组与未处理组的群体。由于群体大小是细胞生长速率和细胞死亡速率共同作用的结果，....
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方案
1. 优化诱导细胞死亡的药物剂量
注意：以下方案旨在利用FLICK检测法优化一种细胞系、药物及剂量的组合7,8。本方案的示例数据描述了在U2OS细胞中对5 μM依托泊苷进行优化与筛选的过程，但相同的优化步骤也可适用于其他任意细胞系与药物/剂量组合。本方案无需收集或分析死亡细胞。该方案可用于悬浮培养细胞，前提是去除死亡细胞。对于悬浮培养细胞，可使用活力标记物或特异性细胞死亡标记物对死亡细胞进行分选/分离。
- 在进行FLICK实验之前，使用文献中详细描述的方案8优化细胞数量、Triton-X透化条件、SYTOX染料浓度以及酶标仪检测参数。
- 将细胞接种于黑色、透明底的96孔板中。通常每孔接种密度为1500–5000个细胞，具体数量需根据不同细胞系进行优化。将细胞在37 °C、5% CO2及适宜湿度条件下培养16–24小时。
- 在培养基中配制药物稀释液，并加入步骤(1.1)中确定的最佳SYTOX浓度。药物通常以对数梯度稀释的方式设置8–12个具有生物学或临床相关性的剂量进行测试。
注意：某些药物在与SYTOX相同的波长下可产生自发荧光，导致本实验无法准确定量。在此类情况下，可考虑使用在不同波长....
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结果
使用本实验方案，我们探究了依托泊苷诱导U2OS细胞死亡过程中的遗传依赖性。依托泊苷是一种常用的DNA损伤类化疗药物15该化学遗传学分析实验使用 GeCKOv2 文库进行16 在表达Cas9的U2OS细胞中5在这类实验中，通常通过比较药物处理组与未处理组中特定敲除克隆的相对丰度来推断基因功能（图1A-B）。然而，不能直接比较经处理与未处理条件下敲除细胞的计数，因为经处理与未处理的总体细胞数量可能存在显著差异。因此，常用的分析方法通常将敲除细胞的计数归一化至内部对照，例如含有非靶向sgRNA的细胞17,18 （即野生型细胞在 图1C）。因此，化学遗传学分析中使用的核心指标——通常为处理组与未处理组归一化计数的对数尺度倍数变化（L2F.......
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讨论
在本方案中，我们描述了使用MEDUSA分析方法对化学生物遗传学谱型数据进行定量，以评估遗传扰动如何改变药物诱导的细胞生长和死亡速率。由于化学生物遗传学谱型实验的主要输出结果与细胞群体数量相关，而非直接反映速率，因此需要通过模拟来推断其潜在的速率参数。因此，该方法的关键步骤在于准确地实验测定药物反应动力学参数，包括未处理细胞的增殖速率、药物诱导死亡的起始时间、药物诱导的死亡速率，以及通过药物GRADE推断得到的生长与死亡速率之间的协调关系。这些特征共同构成了将观测到的细胞群体数量映射到潜在动力学速率的规则体系。
尽管药物特异性参数化对MEDUSA推断结果的准确性至关重要，但理论上该分析方法仍可在缺乏药物特异性信息的情况下使用。例如，药物剂量、检测时长、生长速率以及细胞死亡水平通常无需特殊设备或专业知识即可量化，而生长与死亡之间协调性的量化可能对某些实验室而言较为困难。在此类情况下，用户可能更倾向于在不明确表征该特征的情况下运行MEDUSA。实际操作中，这相当于编码一系列合理的协调性取值，从而产生一系列不同的模型以及由MEDUSA推断出的不同生长与死亡速率。对于大多数基因而言，仍有可能.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢李氏实验室所有过去和现在的成员，他们为本实验室在评估药物反应方面的观点做出了贡献。本研究工作得到了美国国立卫生研究院的资助（对MJL的资助项目编号为U01CA265709、R21CA294000和R35GM152194，对MEH的资助项目编号为F31CA268847），以及Jayne Koskinas Ted Giovanis基金会对MJL的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm Fisherbrand TC 培养皿 | Fisher Scientific | FB012924 | 用于细胞培养及优化细胞群体规模 |
| 150 mm Fisherbrand TC 培养皿 | Fisher Scientific | FB012925 | 用于细胞培养及优化细胞群体规模 |
| DESeq2 | R 软件包 | v1.44.0 | 用于计算倍数变化 |
| DMEM | Corning | 10017CV | 用于接种细胞和药物处理 |
| DMSO | Fisher Scientific | MT-25950CQC | 用于接种细胞和药物处理 |
| Fisherbrand 96 孔细胞培养处理U型底微孔板 | Fisher Scientific | FB012932 | 用于接种细胞和药物处理（针板） |
| Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96 孔细胞培养处理平底微孔板 | Greiner | 655090 | 用于接种细胞和药物处理 |
| MATLAB | Mathworks | R2024a | 用于执行 FLICK、GRADE 和 MEDUSA 分析 |
| 微孔板荧光读板仪 | Tecan | Spark | 用于死细胞检测 |
| Sytox Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | 用于死细胞检测 |
| TKOV3 CRISPR 文库 | Addgene | 125517 | 用于开展 CRISPR 筛选 |
| Triton-X 100 | Thermo Fisher Scientific | J66624-AP | 用于细胞通透化处理 |
| 台盼蓝 | Corning | MT25900CI | 用于检测活细胞/死细胞比例 |
参考文献
- Przybyla, L., Gilbert, L. A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).
- Colic, M., Hart, T. Chemogenetic interactions in human cancer cells. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).
- Colic, M., Hart, T.
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