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方法文章

MEDUSA：用于识别化学遗传学谱型数据中死亡调控基因

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DOI：

10.3791/67892

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2025年2月7日

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

本文内容

摘要

本方案介绍了如何使用MEDUSA分析方法来定量评估每个基因敲除的死亡调控效应。内容包括优化灵敏度的实验条件确定方法，以及进行该分析的分步教程。

摘要

系统性筛选基因功能的获得或缺失扰动可用于表征几乎所有感兴趣细胞过程的遗传依赖性及调控机制。这类实验通常涉及对单个基因扰动文库进行分析，以评估每个基因扰动对细胞相对适应性的影响。当应用于药物疗效研究时（常称为化学遗传学分析），这些方法应能有效识别药物的作用机制。然而，基于适应性的化学遗传学分析在识别药物反应所有组分方面效果有限。例如，这类研究通常难以鉴定调控药物诱导细胞死亡的基因。多种因素会干扰在基于适应性的筛选中对死亡调控的识别，包括增殖速率差异的混杂效应、药物诱导的生长与死亡之间协调性的变化，以及在某些情况下无法将活细胞与死细胞的DNA区分开来。MEDUSA 是一种用于在常规化学遗传学分析数据中识别调控细胞死亡基因的分析方法。该方法通过计算模拟，估算产生观测到的适应性谱型的生长速率和死亡速率，而非直接评分适应性本身。该方法的有效应用依赖于对实验条件（包括药物剂量、起始细胞群体大小以及检测持续时间）的优化滴定。本文将介绍如何设置适用于 MEDUSA 分析的化学遗传学分析实验，并演示如何利用该方法在化学遗传学分析数据中定量细胞死亡速率。

引言

在化学-遗传谱型分析中，通过系统性遗传扰动来研究每个基因对特定药物反应的贡献1,2,3。这类实验具有重要价值，能够揭示有关药物反应的重要信息，包括药物的结合靶点以及药物进入和排出细胞的机制。然而，由于这些实验通常以混合方式同时评估所有基因，因此从化学-遗传谱型数据中获得机制性见解可能具有挑战性。

药物诱导的细胞死亡的调控机制和遗传依赖性在化学遗传学分析数据中往往难以解析。造成这一问题的原因有多种，但许多都源于细胞增殖差异的影响4。例如，由于细胞呈指数增殖，遗传扰动对增殖速率的影响对群体大小的作用远大于对细胞死亡率变化的影响。此外，由于这种偏倚性的敏感度随时间加剧，而此类实验通常持续数周，大多数研究被优化为对增殖缺陷高度敏感，而对药物诱导的细胞死亡变化基本不敏感。其他与增殖相关的问题还包括增殖与死亡之间协调关系的差异（例如，每个克隆在死亡的同时增殖速度有多快，以及不同遗传扰动之间是否存在差异），以及在无药物条件下各克隆增殖速率的差异，这会改变在药物无效时本应或可能回收的细胞数量。根本在于，化学遗传学分析实验通常通过与相对群体大小成比例的测量值来评估遗传扰动的影响，比较处理组与未处理组的群体。由于群体大小是细胞生长速率和细胞死亡速率共同作用的结果，从细胞死亡的角度来看，增殖构成了混杂因素。

为解决这些问题，我们创建了一种基于模拟辅助方法评估细胞死亡（Method for Evaluating Death Using a Simulation-assisted Approach, MEDUSA）5。MEDUSA 通过计算模拟来解读所观察到的相对群体大小数据，推断出每种基因克隆在药物反应中所对应的药物诱导生长率和死亡率的组合。先前的数据表明，该方法能够准确推断基因扰动如何影响药物诱导的细胞死亡率，但该方法的准确性依赖于对药物如何协调细胞增殖与细胞死亡，以及这些速率随时间变化的深入理解5,6。此外，基于 MEDUSA 的推断要求所测试药物的剂量能够引起显著的细胞死亡。重要的是，这些药物处理条件引发了对起始细胞群体大小和实验持续时间的额外考量，这些因素应被仔细评估并优化。在本方案中，我们描述了如何建立适用于 MEDUSA 分析的化-遗传谱型研究，并详细说明了该分析方法的使用。MEDUSA 的总体目标是确定每个基因缺失对药物诱导的生长率和死亡率的影响。

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方案

1. 优化诱导细胞死亡的药物剂量

注意：以下方案旨在利用FLICK检测法优化一种细胞系、药物及剂量的组合7,8。本方案的示例数据描述了在U2OS细胞中对5 μM依托泊苷进行优化与筛选的过程，但相同的优化步骤也可适用于其他任意细胞系与药物/剂量组合。本方案无需收集或分析死亡细胞。该方案可用于悬浮培养细胞，前提是去除死亡细胞。对于悬浮培养细胞，可使用活力标记物或特异性细胞死亡标记物对死亡细胞进行分选/分离。

  1. 在进行FLICK实验之前，使用文献中详细描述的方案8优化细胞数量、Triton-X透化条件、SYTOX染料浓度以及酶标仪检测参数。
  2. 将细胞接种于黑色、透明底的96孔板中。通常每孔接种密度为1500–5000个细胞，具体数量需根据不同细胞系进行优化。将细胞在37 °C、5% CO2及适宜湿度条件下培养16–24小时。
  3. 在培养基中配制药物稀释液，并加入步骤(1.1)中确定的最佳SYTOX浓度。药物通常以对数梯度稀释的方式设置8–12个具有生物学或临床相关性的剂量进行测试。
    注意：某些药物在与SYTOX相同的波长下可产生自发荧光，导致本实验无法准确定量。在此类情况下，可考虑使用在不同波长发射荧光的SYTOX衍生物。此外，本实验不能用于评估影响SYTOX荧光信号或阻碍其与DNA结合的药物反应。
  4. 使用步骤(1.1)中优化的Triton-X浓度裂解一块培养板（T0时间点）。细胞裂解后，利用酶标仪检测SYTOX荧光强度，并根据预先建立的荧光信号与细胞数量之间的经验关系，确定初始总细胞数（参见FLICK实验方案7,8）。
  5. 使用步骤(1.1)中优化的检测参数，通过酶标仪测定实验组培养板在T0时间点的SYTOX荧光信号。
  6. 连续监测SYTOX信号达三天。为准确拟合动力学数据，每天至少采集三个时间点的数据，各时间点间隔4小时。
    注意：本实验方案评估细胞死亡和生长变化的时间为3天。该时长通常足以检测诱导细胞死亡的药物效应；但也可根据药物引起的不同细胞死亡动力学特征适当缩短或延长实验时间。
  7. 在最后一个时间点结束后，使用Triton-X裂解实验组培养板，以确定各处理条件下最终的细胞群体大小。
  8. 计算相对存活率（Fractional Viability, FV），并将终点数据拟合至剂量-反应曲线，具体方法参见FLICK实验方案7,8。
  9. 通过分析FV剂量-反应曲线，确定可诱导约50%细胞死亡的药物剂量。
    注意：SYTOX识别死亡细胞的前提是细胞质膜破裂和核膜崩解。由于这些膜结构需要持续维持，因此无论药物诱导何种类型的细胞死亡机制，SYTOX均可检测到死亡细胞。然而，不同形式的细胞死亡中上述过程的发生效率存在差异，可能影响SYTOX对死亡细胞的精确检测能力。此外，不同细胞死亡机制产生的细胞残骸稳定性也各不相同。但我们发现，迄今为止测试的所有细胞死亡方式均会导致SYTOX结合DNA（无论位于通透化的细胞核内还是培养基中）。该SYTOX信号在72小时实验期间通常保持稳定，但可通过比较实验起始和结束时的总细胞数对其进行监控。

2. 选择检测时长

  1. 利用步骤1中收集的FLICK数据，按照FLICK实验方案7,8所述方法，计算每种条件下随时间变化的致死分数（Lethal Fraction, LF）。按照先前描述的方法9，将LF的动力学数据拟合至滞后-指数死亡（lag-exponential death, LED）模型。
  2. 针对步骤1中确定的每种致死剂量，绘制LF随时间变化的曲线。选择一个能够产生约50% LF的剂量和时间点。
    注意：约50%的致死分数可在CRISPR筛选数据中富集出强效且特异性的死亡信号，同时保留足够数量的活细胞以维持文库的代表性5。然而，某些药物可能受限于已有文献报道或仅在较窄的剂量范围内才能诱导出特定的期望表型。若剂量受到限制，应相应缩短或延长检测终点时间，以确保所选剂量达到约50%的LF。若无法实现50%致死率，则可能需要增加起始细胞群体的规模。

3. 确定起始种群数量

  1. 根据上述优化结果，选择合适的药物剂量，以进一步优化筛选条件。
  2. 将细胞接种于含完全培养基的10 cm培养皿中。每种实验条件应设置技术重复三份，并确保有足够的生物学重复，以便在整个筛选过程中每12–24小时进行一次细胞计数，包括T = 0时间点。
    注意：接种的细胞数量可能需要针对未处理组和处理组分别优化，需考虑净群体生长速率和细胞大小。通常情况下，接种密度应使细胞在实验终点时的融合度不会影响细胞健康（例如，对于多数细胞类型，融合度应<80%）。在筛选过程中，若有必要，也可对处理组和未处理组细胞进行重新接种，但需确保文库的代表性得以维持。
  3. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  4. 向处理组培养皿中加入目标浓度的药物。同时，收集3个未处理组培养皿中的细胞，使用血细胞计数板计数活细胞数量。用台盼蓝（或类似的细胞活力染料）对死细胞进行染色，以确保仅计数活细胞。这些数据用于确定T = 0时间点的细胞数量。
  5. 12–24小时后，收集3个未处理组和3个处理组培养皿中的细胞，计数活细胞数量。重复此收集过程，直至达到实验终点。为充分理解药物作用及细胞死亡动力学，建议在步骤（2.2）确定的时间点之后继续监测活细胞24–48小时。
  6. 通过绘制群体大小（y轴）随时间（x轴）的变化曲线，可视化细胞活力的变化情况。
    注意：根据观察到的最大细胞数量和最终群体大小，可粗略估算实验终点时的致死比例。该结果应与使用FLICK检测法获得的相对活力分数和致死分数数据（步骤1.9和步骤2.2）进行比较，以确认达到了预期的细胞死亡水平。
  7. 确定群体大小最小的时间点。根据药物存在下细胞生长的程度，该时间点可能位于CRISPR筛选的起始或结束阶段。
  8. 选择一个起始细胞群体大小。确保起始细胞数量经过优化，以在整个筛选过程中维持至少500x–1000x的文库覆盖度。
    注意：例如，TKOv3文库包含70,948个sgRNA。为实现500x的覆盖度，每个条件每个重复在整个实验过程中应维持不少于35,474,000个细胞。这种瓶颈群体大小通常出现在实验开始阶段，或在未处理组或增殖条件下经胰酶消化和稀释取样后。相比之下，对于诱导显著细胞死亡的药物处理，瓶颈群体大小通常由实验终点时的群体大小决定。
  9. 如有需要，可在将用于CRISPR筛选的培养皿（例如15 cm培养皿）上重复上述优化步骤，以确认药物效应随规模扩增仍保持一致。

4. 进行 CRISPR 筛选

注意：在优化药物剂量和检测时间后，可采用已建立的CRISPR筛选方法对细胞进行筛选。可使用已建立的实验方案（例如Moffat实验室的TKO筛选方案10,11）来制备CRISPR筛选文库、产生病毒、执行CRISPR筛选，并为测序制备文库（图1A-B）。以下方案描述了MEDUSA分析特有的步骤，这些步骤应在测序后的计数水平数据上进行。

  1. 按以下所述，计算每个 sgRNA 的实验观察到的倍数变化（图 1C）。
    1. 生成 sgRNA 水平的计数表，以准备测序数据进行分析。使用标准流程对测序文库进行修剪和比对，如文献5,12所述。
    2. 标准化测序文库深度。可通过手动方式或使用 DESeq2 等内置函数进行标准化，如文献5,12所述。可针对所有向导序列进行标准化，或基于非靶向向导序列的分布进行标准化。
    3. 将非靶向 sgRNA 随机分配至非靶向基因。例如，若某文库中每个基因对应四个 sgRNA，则每个非靶向基因也应分配四个非靶向 sgRNA。
    4. 对于每个感兴趣的比较（未处理/T0 和/或处理/未处理），计算 log2(倍数变化)。建议使用 DESeq2 中的参数化拟合方法进行计算，但也可手动计算倍数变化。 
    5. 剔除计数较低的 sgRNA。合适的剔除策略取决于重复样本间的噪声水平及其随计数变化的情况。这些特征会因 CRISPR 文库而异，建议对新数据并行测试多个截断阈值。根据文献惯例常用的截断策略包括：剔除计数最低的 5% 的向导序列，或剔除低于某一标称阈值的向导序列13。
  2. 按以下所述，确定每个单基因敲除对生长速率的影响。
    1. 计算未处理细胞的净群体生长率（NPG）（即观察到的群体倍增时间，图 1D）。该值可从第 1 步的 FLICK 数据、第 3 步随时间变化的活细胞计数，或目标细胞系先前的实验测量结果中提取。
    2. MEDUSA 建模未处理条件需要三个参数：NPG：净群体生长率，单位为倍增/小时；Tstart：起始时间点，单位为小时，通常默认设为 0；Tendunt：未处理条件的最终时间点，单位为小时。
    3. 模拟所有可能的 NPG 速率扰动。使用 for 循环评估一系列可能的 NPG 值。对于每个相对生长速率，计算在检测终点可观察到的 log2(倍数变化)。
    4. 针对第 4.1.5 步中的每个实验 sgRNA，找出与观察数据最接近的模拟倍数变化。将产生该模拟倍数变化的相对生长速率分配给该 sgRNA。
  3. 按以下所述，表征药物存在下生长与死亡之间的协调关系。
    注意：MEDUSA 所需参数可通过使用 GRADE 分析方法分析 FLICK 类型数据获得14。可使用（1）和（2）中的数据，或额外进行一次参数化实验。
    1. MEDUSA 使用四个参数来表征药物存在下生长与死亡的协调关系：GRdrug1：死亡发生前的药物诱导生长率，单位为倍增/小时；DO：死亡发生时间，单位为小时；GRdrug2：死亡发生后的药物诱导生长率，单位为倍增/小时；DRdrug：药物诱导死亡率，单位为致死分数/小时。为确定 DO 的参数，使用 LF 动力学，从 LED 拟合中提取死亡发生时间。
  4. 利用 LF 动力学确定 DRdrug。通过将最终的 LF 除以死亡发生后的时间（单位为小时），计算平均死亡率。
  5. 根据第 3 步的活细胞计数数据确定 GRdrug1。在死亡发生前，通过将数据拟合至简单的指数方程，确定药物诱导的生长率。
    1. 结合第 3 步数据和药物 GRADE14 确定 GRdrug2。计算并绘制所选药物剂量的 GRADE 值于 GRADE 图上。若 GRADE = 0，则假设 GRdrug2 为 0；若 GRADE > 0，则利用 GRADE 确定群体的平均生长率。基于实验测定的 GRdrug1 值，确定能产生观察到的平均生长率的 GRdrug2 值。
      注意：可通过计算观察数据点（即某药物的 GR 与 FV 数据对）与 GRADE 空间中各点之间的成对距离，并找出最近点，从而从 GRADE 图中推断平均药物诱导生长率。详细操作步骤见参考文献14。药物诱导的生长率和死亡率并非药物的固定值，而是特定于给定细胞背景下某一剂量的药物。
  6. 按以下所述，生成所有可能的生长率与死亡率组合的模拟倍数变化。
    1. 基于实验测定的药物诱导生长率与死亡率的协调关系，构建一个模拟药物诱导群体大小随时间变化的模型（图 1D）。该模型可构建为分段函数，结合药物响应的两个独立阶段（死亡发生前和死亡发生后）。
    2. 对于完整的 MEDUSA 模型，包含以下八个参数：NPG：净群体生长率，单位为倍增/小时；GRdrug1：死亡发生前的药物诱导生长率，单位为倍增/小时；DO：死亡发生时间，单位为小时；GRdrug2：死亡发生后的药物诱导生长率，单位为倍增/小时；DRdrug：药物诱导死亡率，单位为致死分数/小时；Tstart：起始时间点，单位为小时，通常默认设为 0；Tendunt：未处理条件的最终时间点，单位为小时；Tendtr：处理条件的最终时间点，单位为小时。
    3. 对于基础模型，模拟所有可能的生长率和死亡率扰动。针对每种组合，计算可观察到的 log2(倍数变化)。
      注意：在 MEDUSA 中，假设对生长率的扰动在 NPG、GRdrug1 和 GRdrug2 之间呈比例关系。例如，NPG 速率降低 80%，则两种药物诱导的生长率也相应降低 80%。
  7. 按以下所述，推断每个基因敲除的死亡率（图 1D-E）。
    1. 对于每个 sgRNA，通过三角定位法推断产生观察到的倍数变化所需的药物诱导死亡率。首先，提取第（4.2.4）步中确定的相对生长率。
    2. 确定 GRdrug1 和 GRdrug2 的速率。将 NPG 的相对生长率按比例应用于 GRdrug1/GRdrug2，计算其相应的生长率。
    3. 在 NPG、GRdrug1 和 GRdrug2 的约束条件下，找出与每个 sgRNA（处理/未处理）观察到的倍数变化最接近的模拟倍数变化。结合这些观察结果反向推算药物诱导的死亡率。
  8. 按以下所述，计算基因水平的生长率和死亡率。
    1. 确定文库中每个基因的基因水平速率。计算与特定基因相关联的所有 sgRNA（通常为 4–10 个）的每种生长率和死亡率的平均值。
    2. 为计算经验 p 值，对 sgRNA 水平数据进行自助抽样（bootstrap）。使用 Benjamini-Hochberg 方法进行 FDR 校正。
      注意：我们 GitHub 仓库（https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA）中包含了补充说明以及使用 MEDUSA 分析 CRISPR 筛选数据的示例数据。 

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结果

使用本实验方案，我们探究了依托泊苷诱导U2OS细胞死亡过程中的遗传依赖性。依托泊苷是一种常用的DNA损伤类化疗药物15该化学遗传学分析实验使用 GeCKOv2 文库进行16 在表达Cas9的U2OS细胞中5在这类实验中，通常通过比较药物处理组与未处理组中特定敲除克隆的相对丰度来推断基因功能（图1A-B）。然而，不能直接比较经处理与未处理条件下敲除细胞的计数，因为经处理与未处理的总体细胞数量可能存在显著差异。因此，常用的分析方法通常将敲除细胞的计数归一化至内部对照，例如含有非靶向sgRNA的细胞17,18 （即野生型细胞在 图1C）。因此，化学遗传学分析中使用的核心指标——通常为处理组与未处理组归一化计数的对数尺度倍数变化（L2F...

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讨论

在本方案中，我们描述了使用MEDUSA分析方法对化学生物遗传学谱型数据进行定量，以评估遗传扰动如何改变药物诱导的细胞生长和死亡速率。由于化学生物遗传学谱型实验的主要输出结果与细胞群体数量相关，而非直接反映速率，因此需要通过模拟来推断其潜在的速率参数。因此，该方法的关键步骤在于准确地实验测定药物反应动力学参数，包括未处理细胞的增殖速率、药物诱导死亡的起始时间、药物诱导的死亡速率，以及通过药物GRADE推断得到的生长与死亡速率之间的协调关系。这些特征共同构成了将观测到的细胞群体数量映射到潜在动力学速率的规则体系。

尽管药物特异性参数化对MEDUSA推断结果的准确性至关重要，但理论上该分析方法仍可在缺乏药物特异性信息的情况下使用。例如，药物剂量、检测时长、生长速率以及细胞死亡水平通常无需特殊设备或专业知识即可量化，而生长与死亡之间协调性的量化可能对某些实验室而言较为困难。在此类情况下，用户可能更倾向于在不明确表征该特征的情况下运行MEDUSA。实际操作中，这相当于编码一系列合理的协调性取值，从而产生一系列不同的模型以及由MEDUSA推断出的不同生长与死亡速率。对于大多数基因而言，仍有可能...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢李氏实验室所有过去和现在的成员，他们为本实验室在评估药物反应方面的观点做出了贡献。本研究工作得到了美国国立卫生研究院的资助（对MJL的资助项目编号为U01CA265709、R21CA294000和R35GM152194，对MEH的资助项目编号为F31CA268847），以及Jayne Koskinas Ted Giovanis基金会对MJL的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm Fisherbrand TC 培养皿Fisher ScientificFB012924用于细胞培养及优化细胞群体规模
150 mm Fisherbrand TC 培养皿Fisher ScientificFB012925用于细胞培养及优化细胞群体规模
DESeq2R 软件包v1.44.0用于计算倍数变化
DMEMCorning10017CV用于接种细胞和药物处理
DMSOFisher ScientificMT-25950CQC用于接种细胞和药物处理
Fisherbrand 96 孔细胞培养处理U型底微孔板Fisher ScientificFB012932用于接种细胞和药物处理（针板）
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96 孔细胞培养处理平底微孔板Greiner655090用于接种细胞和药物处理
MATLABMathworks R2024a用于执行 FLICK、GRADE 和 MEDUSA 分析
微孔板荧光读板仪TecanSpark用于死细胞检测
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020用于死细胞检测
TKOV3 CRISPR 文库Addgene125517用于开展 CRISPR 筛选
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-AP用于细胞通透化处理
台盼蓝 CorningMT25900CI用于检测活细胞/死细胞比例

参考文献

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