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向斑马鱼幼鱼施用挥发性麻醉剂以进行行为观察

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DOI：

10.3791/67896

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2025年6月6日

 ,  , 
1Perelman School of Medicine, Department of Anesthesiology and Critical Care, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本方案介绍了一种简便的方法，用于为幼年斑马鱼创建密闭的气密环境，以便在行为学实验中施加挥发性麻醉剂。

摘要

本研究描述了一种在行为学实验期间向斑马鱼幼体施用挥发性麻醉剂（如异氟烷和七氟烷）的独特方法。尽管斑马鱼作为脊椎动物模型具有多种优势——包括复杂的行为、可进行遗传操作、胚胎透明以及发育迅速——但其在挥发性麻醉剂研究中的应用仍受到限制。挥发性麻醉剂的给药通常需要复杂或笨重的装置，而这些装置可能难以广泛获取，从而阻碍了在水生模型生物中对挥发性麻醉剂进行药理学研究。本方法介绍了一种使用粘性硅胶片在玻璃96孔板上形成气密密封的简便技术。通过评估自发运动对方法进行了验证，结果显示在90分钟内，密封孔与开放孔之间无显著差异。此外，通过高效液相色谱法（HPLC）测定表明，麻醉剂浓度在时间过程中保持稳定。代表性结果包括七氟烷半数有效浓度（EC50）的实验测定值。本研究提供了一种简单且易于实施的方法，适用于使用挥发性麻醉剂的药理学实验，并可轻松扩展用于研究其他挥发性药物及实验终点。

引言

非水生动物模型（如蠕虫、果蝇、啮齿类、兔类、灵长类等）历来被最广泛用于麻醉药理学的研究。在这些物种中，吸入性挥发性麻醉药的给药方式远比静脉麻醉药（通过静脉或腹腔途径给药）更简便1。除了静脉给药本身存在的技术难度外，使用挥发性麻醉剂比静脉麻醉剂更容易达到稳定的麻醉状态2。

通过周围水环境扩散的方式，可将静脉麻醉药给予水生幼体物种3,4，因此该方法更类似于对非水生物种使用挥发性麻醉药的方式。多年来，非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪一直是研究麻醉药的首选模型，因其给药简便，只需将麻醉药直接加入人工池水中即可实现稳定的药代动力学状态5,6。然而，由于研究此类模型中挥发性麻醉药需要使用气密装置，而这些装置通常为定制，操作较为繁琐，因此针对该模型的挥发性麻醉药研究相对较少7,8。

近年来，斑马鱼因其与静脉麻醉药给药同样简便的优势，以及其行为复杂且已有商用观测设备可供观察等其他优点，已成为研究静脉麻醉药的首选模型9。许多近期研究利用此类商用观测设备，采用96孔板和24孔板体系，对斑马鱼幼鱼的行为进行定量分析，以筛选包括麻醉剂在内的神经活性化合物4,10,11,12,13,14,15。由于斑马鱼幼体具有可评估多种行为反应、个体小、适合高通量筛选以及神经环路特征明确等优势，特别适用于药理学研究9,16,17。然而，目前在斑马鱼模型中研究麻醉剂的一个显著局限在于挥发性麻醉剂给药相对困难，导致针对挥发性与静脉麻醉剂之间比较的研究实例极为有限4,15,18。若能在单一动物模型中便捷地研究并比较这两类麻醉剂，将为跨类别麻醉药理学研究提供一项重要工具。

传统上，对水生物种静脉麻醉剂的研究需要专门的、通常是定制的设备，这些设备使用起来可能较为困难，或在实验期间无法充分保持气密性，从而导致麻醉剂流失。本文所述方法提供了一种简便易行的替代方案，可在玻璃容器中实现气密密封，适用于使用商用观察装置观察斑马鱼幼体行为（参见材料表）。

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方案

所有斑马鱼实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案进行。成年斑马鱼饲养于宾夕法尼亚大学的水生动物设施中，并由大学实验动物资源中心（ULAR）负责监管。本研究所用的图宾根长鳍野生型斑马鱼均在本实验室内部繁殖，饲养条件为标准培育环境，光照周期为13小时光照/11小时黑暗，直至受精后5天（dpf）。实验采用生物学重复，每批胚胎来自不同的交配对，以确保足够的生物学多样性。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.

1. 粘性硅胶片的制备

注意：该材料（硅胶片加粘合剂）的类似产品可从商业渠道获得，但通常价格更高且不易获取。

  1. 将0.5 mm硅胶片平铺在清洁、平坦的表面上。
  2. 检查硅胶片是否有褶皱，并尽可能避开使用有褶皱的区域。
    注意：带有褶皱的硅胶片可能无法与双面胶带充分粘合，导致孔壁密封不严和/或斑马鱼观察效果不佳。
  3. 用70%酒精清洁硅胶片，以去除任何油渍或碎屑，并使其自然晾干。
  4. 使用涂布工具（如画笔）在硅胶片表面均匀涂抹一层薄而均匀的粘合底涂剂。由于粘合促进剂干燥迅速（1–5秒内固化），为避免过度涂抹，建议分小区域操作。
    注意：若不使用此粘合促进剂，双面胶带将无法与硅胶片充分粘附。
  5. 涂抹粘合促进剂后，将双面胶带对准硅胶片贴合，确保纸基背衬朝上。
  6. 使用滚轮逐步将胶带压合到硅胶片上，以平整表面并排除气泡（初次贴合后，将硅胶面朝上操作有助于观察和去除气泡）。
  7. 将涂有粘合促进剂的硅胶组件置于平坦表面，静置24小时使其完全固化。
  8. 将粘合硅胶切割成至少10 mm宽的条状（7.5 mm孔径加上每侧的重叠部分）。
    注意：当仅使用孔板中每隔一行的孔时，条带宽度的较大变化不会对相邻行的孔产生负面影响，这不仅可能使操作更简便，而且对于实现孔周完整密封可能是必要的。
    1. 确保条带长度足以覆盖至少一整行孔的位置。
      注意：若使用非96孔板（如24孔或48孔板），可相应调整或裁剪条带尺寸以适配特定孔板的规格，确保无论孔板大小均能实现充分覆盖。

2. 溶液的配制

注意：所有挥发性麻醉剂的储备液和检测用溶液均需在实验前 freshly 配制，以避免挥发性化合物浓度降低。

  1. 对于每种溶液（储备液或工作液），向高效液相色谱瓶或闪烁瓶中加入一定体积的非挥发性溶剂（如E3胚胎水、DMSO等），使得与挥发性麻醉剂的最终稀释液混合后，总体积足以充分填充容器，留下最小的顶空空间（参见 图1A).
  2. 使用哈密顿气密注射器加入挥发性麻醉剂，并迅速密封小瓶。
    注意：带有隔垫瓶盖的小瓶中的储备溶液可用于方便后续稀释 通过 使用气密性注射器转移溶液。
  3. 然后，根据需要混合小瓶中的溶液（涡旋、超声处理），并在准备斑马鱼培养板时暂时存放。

3. 行为学实验的设置

注意：本实验方案的这一步骤可能需要多次练习。建议在熟练掌握该技术之前，先使用不含珍贵材料的溶液或不使用鱼类进行操作。

  1. 将一条斑马鱼幼鱼（5 dpf）转移至玻璃96孔板的每隔一行。
    注意：每隔一行留空，可在步骤 3.4 密封孔板时降低因液体溅出导致相邻孔之间污染的风险。
  2. 小心地从每个孔中移除E3溶液。可以逐行进行，或者如果操作迅速，也可对整块板同时进行。
    注意：应尽量减少幼虫离开溶液的时间，以降低潜在的应激反应。可根据不同的实验需求采用其他替代方案，例如在加入含药物溶液前仅部分移除原有溶液，以进一步减少应激。本实验方案应根据具体实验需要进行调整，包括给予动物足够的平衡时间以抵消可能产生的应激、确保溶液混合的充分性，以及含药溶液中药物浓度的准确性。 在加入工作液之前，并非所有的E3都被去除。
  3. 接下来，使用移液管向该行的每个孔中加入实验溶液。注意避免产生气泡。每个孔需加满溶液（溢出）图1B).
  4. 使用步骤1中制备的粘性硅胶条，迅速将条带向下按压（图1C这有助于防止气泡产生，并避免鱼类溢出到相邻的孔中。
  5. 用力按压板的顶部，以确保每个孔都密封。
  6. 重复步骤 2 至 5，直至溶液完成更换，并密封培养板中每隔一行的孔图1D).
  7. 轻轻将培养板翻转，检查是否存在气泡。
    注意：气泡的存在会阻碍对斑马鱼运动的观察。
  8. 将培养皿放入行为观察装置中（硅胶粘合面朝下），并进行行为学实验（详见结果部分）。

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结果

与传统敞口培养皿观察方法的比较
为了评估粘合密封是否对自发运动产生影响，我们对敞口与密封培养皿中的对照组进行了比较。如图2A所示，在本文所述实验常用的约30分钟标准持续时间内，这两组之间的运动未观察到具有统计学意义的差异。考虑到其他实验范式可能需要更长的实验暴露时间，我们进行了长达2小时的时间过程实验，结果显示在2小时时间点之前运动均无统计学差异（见图2B）。更长的实验时间可能导致运动差异进一步增大。先前的研究已量化了缺氧对游泳行为的不利影响19，最终可能损害实验结果的可靠性。因此，我们推测与敞口培养皿对照组相比，缺氧和/或CO2的积累最有可能导致自发运动（SM）的这种偏离。遗憾的是，防止挥发性麻醉剂从封闭培养皿中逸出的气密性密封，同时也阻碍了其他气体向封闭溶液中的扩散或逸出。这意味着随着斑马鱼代谢过程中CO2的产生和氧气的消耗，其扩散均受到限制。这是该方法在实验持续时间方面的一个重要限...

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讨论

本文介绍了一种向斑马鱼幼鱼便捷施用挥发性麻醉剂（如七氟烷）的方法，该方法曾用于量化野生型斑马鱼中挥发性麻醉剂的效力。尽管该技术在概念上较为简单，但仍需经过练习，以确保在短时间内快速制备出密封良好且无气泡的孔列，从而最大限度地减少挥发性试剂的损失。由于该方法适用于挥发性化合物，因此不仅需要谨慎地将硅胶粘合剂应用于孔板，还必须仔细配制实验溶液，以优化挥发性化合物浓度的准确性。

气泡的滞留会阻碍准确的观察和追踪。除了熟练掌握封板操作外，仔细填充并检查每孔至关重要，因为在封板前存在的任何气泡在封板过程中都很难被去除。适度过量填充各孔也有助于防止空气滞留在孔内。然而，过度填充过多可能导致斑马鱼意外转移到相邻孔中。若发生此情况，应尝试减少过量填充量。尽量减少过多的过量填充不仅有助于防止斑马鱼意外转移至邻孔，还可能提高密封胶在大量多余液体存在情况下的密封效果。尽管所选用的密封胶部分优势在于其能够黏附于湿润表面，但起始时使用清洁且干燥的板子可确保无其他物质干扰黏附过程，从而提升实验体系的整体完整性。如果在加胶前孔内无气泡、已优化过量填充量及硅胶密封条的涂布技术后，气泡仍持续存在，则可能是由于使用的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由麻醉教育与研究基金会（FAER）资助。图1 使用 BioRender.com 创建。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔玻璃微孔板Zinsser North America3600500"这些玻璃微孔板由特殊高纯度、耐高温的硼硅酸盐玻璃制成，表面经过酸蚀抛光处理。板体为标准 SBS 微孔板尺寸（85 x 127 mm）的矩形结构。这些玻璃反应微孔板主要设计用于化学应用，可耐受高达 530°C 的温度，可进行高压灭菌。它们由均质玻璃片加工而成，具有均匀的几何形状和结构，确保各孔之间温度一致性良好（典型差异在 0.2°C 以内）。"
2.0 mL 透明大开口、9 mm 螺纹瓶 Chemglass Life SciencesCV-1150-1232"这些瓶具有比常规大 40% 的开口，专为配合机械臂自动进样器使用而设计。它们还采用了独特的阶梯式瓶设计，可将有限体积的内插管精确地定位于瓶口颈部。"
3M 双面胶带 9490LEAbbVie Inc24WG90"3M 双面胶带 9490LE 配合 3M 层压胶粘剂 300LSE，可在大多数表面实现高强度粘接，包括许多低表面能塑料，如聚丙烯和粉末涂层漆面。丙烯酸类胶粘剂还能在通常用于机械部件的轻度油污表面上实现优异的粘附性能。3M 双面胶带 9490LE 还在一侧采用了 3M 层压胶粘剂 300MP，可实现对多种泡沫和织物材料的优异粘接强度（6 英寸 x 5 码）"
DanioVision 观察室NoldusDVOC-0041"DanioVision 是一个完整的系统，专为在多孔板中对斑马鱼幼体进行高通量测试而设计。系统包括观察室和著名的 EthoVision XT 视频追踪软件。"
DanioVision 温度控制单元NoldusDVTCU-0011"DanioVision 温度控制单元是一种流通式系统：水以设定的温度均匀地流经微孔板下方，使整个微孔板的温度保持一致。"
Ethovision XT16 软件NoldusNSE-EV-BASE"EthoVision XT 是应用最广泛的视频追踪软件，可追踪和分析任何动物的行为、运动和活动，由 Noldus 注册商标"
异氟烷Piramal Critical CareNDC # 66794-017-10吸入用液体，为一种不可燃、不爆炸的吸入性麻醉剂，含 100 mL 异氟烷。储存于受控室温 20º 至 25º C
3M Scotch-Weld 快干胶底涂剂 AC79 透明3M"62-3916-0860-1（产品 ID）C2103N（批号）""3M Scotch-Weld 快干胶底涂剂 AC79 专为难粘接的低表面能弹性体（如 EPDM、硅橡胶及其他橡胶）设计。表面处理和施用简便，底涂剂干燥迅速，有助于加快作业进度。"
0.5 mm 厚硅胶片多家供应商N/A半透明硅胶片从多家供应商处采购
Speedball Pop-in 硬质橡胶辊筒（带塑料框架），4 英寸"Speedball793728"Speedball Pop-In 硬质辊筒的滚轮可快速拆卸，便于清洁。塑料一体式框架，配备可拆卸的 4 英寸宽滚轮。采用纯天然橡胶制成，表面经研磨处理。该硬质橡胶辊筒宽 4 英寸，配有坚固的塑料框架，适用于胶水涂布"
SureSTART 9 mm 螺口盖，适用于高通量应用二级性能，类型：AVCS 黑色聚丙烯螺口盖，白色硅胶/红色 PTFE 隔垫 1.0 mmThermo Scientific6ASC9ST1B"Thermo Scientific SureSTART 9 mm 螺口盖适用于瓶口为 9 mm 的螺纹瓶。二级性能盖经过制造和测试，确保在常规 GC-MS 和 LC-MS 分析中具有低渗出性、耐用性和结果的可重复性。可选择带有不同硬度通用硅胶/PTFE 隔垫的聚丙烯盖，以减少自动进样针的问题。我们的 AVCS 盖采用先进的瓶口密封系统技术，确保在封瓶时实现最佳密封压缩效果。"
Ultane 七氟烷AbbVie IncNDC # 0074-4456-04吸入用挥发性液体，包装于琥珀色瓶中，每瓶含 250 mL 七氟烷。储存于受控室温 15º 至 30º C
Wheaton 液体闪烁计数瓶，瓶盖与瓶体连接，玻璃材质，金属箔/纸浆，24-400，20 mL DWK Life Sciences98656120 mL 闪烁计数瓶由 I 型硼硅酸盐玻璃管、PET 或 HDPE 材料制成。提供带盖型号。

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