方法文章

无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

1.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67902

⸱

2025年4月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Baylor University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

迫切需要能够模拟异质细胞间串扰的三维癌症模型来研究癌症转移。本研究展示了在有支架和无支架环境中构建异质多细胞间质-上皮模型的方法，可用于研究细胞侵袭行为及空间分布特征。

摘要

乳腺癌是美国女性癌症相关死亡的第二大原因。实体瘤类器官模型已被证明能够真实再现癌症进展的多个方面，例如增殖和侵袭。尽管患者来源类器官和患者来源异种移植类器官在病理生理学上具有相关性，但其扩增成本高昂、操作困难，且主要由肿瘤微环境（TME）中增殖能力最强的细胞类型组成。这些局限性阻碍了其在阐明疾病进展的细胞机制方面的应用，而这些机制依赖于存在于TME中并已知参与转移和治疗耐药的肿瘤相关间质细胞。

本文报道了上皮-间质多细胞三维培养的方法。这些方法的优势包括提供一种经济高效的体系，可在无支架环境中快速生成类器官样的三维培养物，并可用于在水凝胶支架内以单细胞分辨率追踪侵袭过程。具体而言，我们展示了如何将BT-474乳腺癌细胞与成纤维细胞（BJ-5ta）、类单核细胞（THP-1）和/或内皮细胞（EA.hy926）联合使用，以构建此类异源多细胞三维培养体系。此外，对不同细胞群体进行差异性荧光标记，可实现延时显微成像，从而明确三维培养物的组装过程及侵袭动态。

值得注意的是，在BT-474细胞的3D培养体系中加入任意两种基质细胞组合，均可显著降低3D结构的圆形度，表明形成了类器官样或次级球状体结构。在示踪染料实验中，成纤维细胞和内皮细胞共定位于外周的类器官样突起中，并在空间上与主要的BT-474球状体分离。最后，BT-474细胞的异质多细胞3D培养体系表现出增强的水凝胶侵袭能力。由于我们在非致瘤性和致瘤性乳腺上皮细胞的异质多细胞3D培养体系中均观察到此类突起结构，本研究提供了一种高效且可重复的方法，可在无支架环境中生成类器官样3D培养物，用于后续对与实体瘤进展相关的表型进行分析。

引言

目前公认癌症的发展依赖于两个主要因素：肿瘤细胞的遗传/表观遗传改变，以及肿瘤微环境（TME）中非肿瘤细胞之间的多种相互作用1。尽管细胞的遗传改变被认为是肿瘤起始所必需的，但仅这些改变本身并不足以驱动肿瘤的进展和转移2。肿瘤微环境（TME）的组分最初被认为只是沉默的旁观者，但现在已知其可通过与肿瘤细胞之间相互且动态的信号交流，主动促进癌症进展3。TME的组成因肿瘤来源的组织、肿瘤分期以及患者个体特征而异，但其标志性成分包括间质性的癌症相关成纤维细胞（CAFs）、细胞外基质（ECM）、血管内皮细胞，以及适应性与髓系免疫细胞1,4。

肿瘤微环境（TME）中的基质成纤维细胞（CAF）由具有不同来源和功能的成纤维细胞亚型组成5。这些CAF是TME的关键组分，因其在多个界面上与肿瘤细胞相互作用。CAF分泌细胞外基质（ECM）蛋白，改变基质的硬度，这种改变可能通过过度沉积胶原蛋白、蛋白聚糖和纤连蛋白而限制药物递送，也可能通过分泌降解ECM的基质金属蛋白酶（MMPs）促使肿瘤细胞从原发灶侵袭扩散6,7。此外，CAF通过分泌多种生长因子、细胞因子和血管生成因子（如表皮生长因子（EGF）、转化生长因子β（TGF-β）和血管内皮生长因子（VEGF）），分别促进肿瘤生长、迁移和血管生成1,6。与此同时，在缺氧的TME刺激下，内皮细胞也通过增加血管生成因子的分泌以及减少白细胞黏附分子的分泌，促进肿瘤血管生成并抑制免疫细胞功能1,8。

鉴于癌症进展表现出明显的复杂性，在基础癌症研究中纳入肿瘤微环境（TME）的间质成分已变得至关重要。然而，建立能够真实再现已知肿瘤病理生理特征的模型仍然是一个尚未满足的重大需求9,10。传统的二维（2D）细胞培养模型虽然易于操作、培养迅速且高度可重复，但仅包含快速增殖的癌细胞克隆，无法反映肿瘤中存在的细胞异质性10,11,12。类似地，转基因小鼠模型由于近交导致的遗传异质性较低、免疫系统存在显著差异以及组织学复杂性不足，也无法充分模拟人类肿瘤的生物学特性13,14。由于这些局限性，基于经典癌症模型开发的治疗手段往往难以转化为临床应用。

源自患者的癌症模型（如患者来源的异种移植瘤和患者来源的类器官）能够克服传统癌症模型的局限性，真实反映 原位 肿瘤分子特征、遗传背景和细胞结构10,11,15然而，此类患者来源的异种移植模型和类器官需要复杂的移植程序以及较长的培养时间16,17结合肿瘤获取与取样部位的差异以及冷冻保存效率低下，有必要开发能够在传统二维细胞培养与患者来源的癌症模型之间起到桥梁作用的模型。11,18在这方面，三维细胞培养模型可作为能够快速培养并捕获重要特征的模型 体内 肿瘤特征，如细胞间相互作用、细胞与细胞外基质（ECM）相互作用、缺氧、血管生成以及细胞外基质的产生19,20.

三维细胞培养模型可分为无支架和有支架模型系统。在无支架系统中，通过使用特定的低吸附细胞培养板或调控培养方法的物理参数，诱导细胞自发聚集形成球形结构。目前已有多种获得无支架三维球状体的成熟方法，包括通过离心形成细胞沉淀的简单培养法、悬滴培养法、磁悬浮技术以及动态生物反应器和微流控系统。20,21基于支架的3D细胞培养通过添加聚合物或水凝胶支架来模拟生理性的细胞外基质19,22此类模型具有巨大的潜力，可用于模拟 体内 细胞结构、拓扑结构、基质附着、迁移和药物反应。

除了通过支架操控来构建疾病状态下细胞外基质（ECM）组成的模型外，三维细胞培养还可用于模拟肿瘤微环境（TME）中的异质性细胞群体。由癌细胞与间质成纤维细胞或内皮细胞组成的三维细胞培养体系已被用于研究癌细胞与单个非肿瘤细胞系之间的相互作用23,24,25。开发可重复且成本效益高的方法，用于扩增多细胞系组成的此类三维细胞培养体系，将有助于研究人员阐明肿瘤进展机制。本文报道了用于培养上皮-间质多细胞三维体系的方法，以研究细胞增殖、侵袭及细胞状态可塑性。该方案描述了无需支架以及基于基底膜提取物支架的三维培养体系，其中乳腺癌细胞与多种间质细胞共培养，包括成纤维细胞（BJ-5ta）、内皮细胞（Ea.hy926）和类单核细胞（THP-1）。目前，乳腺癌是全球第二常见的癌症，也是美国女性中最常被诊断出的癌症26。乳腺癌致死的主要原因在于其转移性和治疗耐药性；被诊断为侵袭性HER2富集型和基底样亚型乳腺癌的患者，其总体生存率和无转移生存率显著降低27。我们所描述的三维细胞培养方案可能有助于开发成本低、速度快且可重复的培养方法，并可与福尔马林固定石蜡包埋组织保存技术及后续的空间生物学应用相结合。

方案

1. 细胞培养基

注意：所有培养基均需在生物安全柜内配制。

  1. 为准备BJ-5ta、BT474、EA.hy926和MDA-MB-468的细胞培养基，使用移液器向500 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。使用微量移液器加入0.1%庆大霉素。
  2. 为准备MCF10A的细胞培养基，使用移液器向500 mL DMEM/F12培养基中添加5%马血清和1%青霉素-链霉素。使用微量移液器加入0.1%庆大霉素、1 mL浓度为1 µg/mL的氢化可的松、500 µL浓度为10 µg/mL的胰岛素、50 µL浓度为100 ng/mL的霍乱毒素以及10 µL浓度为20 ng/mL的表皮生长因子。
  3. 为准备MCF10Ca1h的细胞培养基，使用移液器向500 mL DMEM/F12培养基中添加5%马血清和1%青霉素-链霉素。使用微量移液器加入0.1%庆大霉素。
  4. 为准备THP-1的细胞培养基，使用移液器向500 mL RPMI 1640培养基中添加10% FBS和1%青霉素-链霉素。使用微量移液器加入0.1%庆大霉素。
  5. 对于BJ-5ta、BT474、EA.hy926、MDA-MB-468、MCF10A和MCF10Ca1h细胞，每天使用明场显微镜观察细胞生长情况，并每2-3天更换一次培养基，直至细胞达到70-80%融合度。THP-1细胞每周更换一次培养基。
  6. 将BJ-5ta、BT474、EA.hy926、MDA-MB-468、MCF10A和MCF10Ca1h细胞培养于具有细胞培养处理表面的100 mm培养皿中，在含5% CO2的标准细胞培养箱中进行培养。
  7. 将THP-1细胞培养于T75细胞培养处理烧瓶中，在含5% CO2的标准细胞培养箱中进行培养。

2. 细胞收集

  1. 打开紫外灯，对生物安全柜内部进行15分钟的消毒。
  2. 打开生物安全柜的窗板，以稳定气流，并开启真空抽吸系统。
  3. 使用70%乙醇清洁生物安全柜内部表面及真空抽吸系统的管路。
  4. 在生物安全柜内配制新鲜的无血清细胞培养基：用移液器向500 mL高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加1%青霉素/链霉素，并用微量移液器加入0.1%庆大霉素。
  5. 将细胞培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶-EDTA（0.25%）放入珠浴中，预热至37 °C，以备实验开始时使用。
  6. 通过显微镜目视检查，确认细胞融合度达到70–80%。
  7. 使用真空抽吸装置吸除并弃去培养板中的培养基。用移液器加入2 mL PBS清洗残留培养基一次，再用真空抽吸装置吸除并弃去PBS。
    注意：THP-1细胞为悬浮培养；步骤2.7–2.9可省略。
  8. 使用微量移液器向细胞培养皿中加入1 mL胰蛋白酶， 并将培养板置于37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育5分钟。
  9. 使用微量移液器向培养板中加入1 mL大豆胰蛋白酶抑制剂（溶于1×PBS中），以终止胰蛋白酶活性。用P1000微量移液器反复吹打液体混合物，使细胞团块分散，并从培养板底部收集细胞悬液。将细胞悬液用微量移液器转移至15 mL锥形管中，在室温下以100 × g离心5分钟。使用真空抽吸装置弃去上清液。
  10. 继续进行细胞计数。

3. 工作染料溶液的配制及悬浮细胞染色

  1. 在打开细胞示踪分子荧光探针小瓶之前（参见材料表），将其置于设定为 37 °C 的珠浴中，静置 15 分钟，使其升至室温。
  2. 使用微量移液器，将冻干的细胞示踪蓝色染料（质量 = 5 mg，分子量 = 209.6 g/mol）溶于 2.385 mL DMSO 中，配制成终浓度为 10 mM 的溶液。
  3. 使用微量移液器，将冻干的细胞示踪橙色染料（质量 = 50 µg，分子量 = 550.4 g/mol）溶于 9.084 µL DMSO 中，配制成终浓度为 10 mM 的溶液。
  4. 使用微量移液器，将冻干的细胞示踪深红色染料（质量 = 15 µg，分子量 = 698.3 g/mol）溶于 20 µL DMSO 中，配制成终浓度为 1 mM 的溶液。
  5. 使用微量移液器，将 1 µL 蓝色染料加入 2 mL 无血清 DMEM 培养基中，稀释配制成工作浓度为 5 µM 的细胞示踪蓝色染料培养液。
  6. 使用微量移液器，将 1 µL 橙色染料加入 2 mL 无血清 DMEM 培养基中，稀释配制成工作浓度为 5 µM 的细胞示踪橙色染料培养液。
  7. 使用微量移液器，将 2 µL 深红色染料加入 2 mL 无血清 DMEM 培养基中，稀释配制成工作浓度为 1 µM 的细胞示踪深红色染料培养液。
  8. 使用微量移液器，分别将上皮细胞、BJ-5ta 成纤维细胞和 Ea.hy926 内皮细胞重悬于已配制的 2 mL 细胞示踪蓝色、橙色和深红色染料工作液中。
  9. 将离心管置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟。
  10. 孵育 30 分钟后，在室温下以 100 × g 离心 5 分钟。
  11. 使用真空抽吸装置吸除并弃去上清液，再用微量移液器将沉淀充分重悬于 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基中。
  12. 继续进行细胞计数。

4. 细胞计数

  1. 用微量移液器吸取10 µL细胞悬液，转移至微量离心管中。
  2. 加入10 µL台盼蓝溶液，充分吹打混匀。
  3. 用微量移液器将20 µL细胞-台盼蓝混合液转移至细胞计数板，插入自动细胞计数仪并进行细胞计数。
  4. 根据两次读数计算平均总活细胞数。

5. 计算

  1. 以 6.67 × 103 个细胞/mL 的浓度制备每种细胞类型的 working cell stocks，相当于 2,000 个细胞/300 µL。
    注意：总储存体积将取决于实验样本量。
  2. 对于单细胞培养类球体，确保每个独立样本包含 300 µL 上皮细胞 working stock，相当于 2,000 个上皮细胞。
  3. 对于共培养类球体（两种细胞类型），确保每个独立样本包含 150 µL 上皮细胞 working stock 和 150 µL 间质细胞 working stock。该样本将包含 1,000 个上皮细胞和 1,000 个间质细胞。
  4. 对于共培养类球体（三种细胞类型），确保每个独立样本包含 150 µL 上皮细胞 working stock、75 µL 间质细胞 #1 working stock 和 75 µL 间质细胞 #2 working stock。该样本将包含 1,000 个上皮细胞、500 个间质细胞 working stock #1 和 500 个间质细胞 working stock #2。

6. 涂布

  1. 用移液器吸取所需体积的样品，准备三个技术重复样及一个额外样品，放入微量离心管中。用移液器充分混匀后，将300 µL样品转移至U型底超低吸附96孔微孔板的一个孔中。
  2. 对每个额外的技术重复样重复上述步骤。
  3. 将96孔板置于37 °C培养箱中孵育。

7. 明场成像

  1. 使用显微镜每24小时观察一次类球体的生长情况和形态，持续至96小时。
  2. 使用相差显微镜对类球体进行成像。

8. 使用示踪染料染色类球体及类球体覆盖基底膜提取物的宽场成像方案设置

  1. 打开材料表中列出的成像设备和自动培养箱，并在成像软件的任务管理器中创建一个新的成像方案。在操作选项卡下，将自动培养箱温度设定值设置为37 °C，并在继续下一步之前，让培养箱充分平衡CO2%和温度。
    注意：如果使用其他荧光成像仪，需确保其具备适用于所用染料（蓝色、深红色和橙色）的适当滤光片。
  2. 将图像设置配置为以下参数：放大倍数：4X PL FL 相差，视野：3185 × 3185 µm，全WFOV。
  3. 通道参数设置如下：DAPI：377/447 nm，照明强度 = 10，积分时间 = 107 ms，增益 = 10；RFP：531/593 nm，照明强度 = 10，积分时间 = 137 ms，增益 = 10；CY5：628/685 nm，照明强度 = 10，积分时间 = 137 ms，增益 = 10。
  4. 对采用基底膜提取物溶液覆盖的类球体进行成像时，使用以下明场成像参数：照明强度 = 10，积分时间 = 5 ms，增益 = 17.1。
  5. 选择需要成像的孔位，点击选择孔位图标以确认参数设置。
  6. 进入数据缩减选项卡，调整细胞分析设置。
  7. 将阈值设为19,500，背景类型选择亮背景，并勾选填充掩膜中的孔洞。
  8. 在对象选择中，将最小对象尺寸设为100 µm，最大对象尺寸设为1,000 µm，并选择分析整幅图像。
    注意：本分析仅需生成主掩膜和对象计数。
  9. 保存所有设置更改，并打开成像仪应用程序。
  10. 打开抽屉，将实验用U型底微孔板放入培养箱中，然后通过成像软件关闭抽屉。
  11. 要运行成像方案，请点击操作信息选项卡，添加用户并选择相应的成像方案。
  12. 确保已选择正确的微孔板类型，并将成像时间设置为每板30分钟。
  13. 选择所需的成像时间间隔，标明微孔板是否带盖，并调整成像的开始时间和持续时间。
  14. 点击安排微孔板/容器以启动成像过程。

9. 基底膜提取物溶液覆盖（可选）

注意：基底膜提取物溶液可在铺板后24小时应用于球状体。

  1. 用冰填满冰桶，以保持基底膜提取液处于低温状态，不使用时将其储存在 4 °C。
  2. 使用多通道移液器吸取约 170 µL 培养基。
  3. 使用放大镜和小型光源板仔细观察微小的球状体。将96孔球状体培养板置于光源板上，并将放大镜置于上方进行观察。
  4. 将P200移液器调至30 µL，吸取基底膜提取液，制备三个微滴。
  5. 用微量移液器将每个微滴分别加至三个技术重复样本中的每个球状体上方。
  6. 确保96孔板放置平稳，并将移液器垂直置于球状体上方。释放液滴时避免接触孔底。
  7. 将培养板放入37 °C培养箱中孵育20分钟。
  8. 用微量移液器向每孔中再覆盖50 µL基底膜提取液。
  9. 使用移液器吸头将球状体重置到孔的中央位置。
  10. 在37 °C下继续孵育30分钟。
  11. 向每孔中加入100 µL细胞培养基。

10. 定量分析

  1. 下载并打开 ImageJ 软件。上传类球体图像。
  2. 通过点击 分析 | 设置测量值 并 选择面积 | 质心 来设置测量参数。使用套索工具勾勒类球体轮廓，并测量该对象。
  3. 记录三个生物学重复的数值，并计算平均面积和圆形度。
  4. 使用以下公式将面积从像素转换为平方米：
    ​面积 (m2) = ((550/504) × √ (像素中的面积)) 2
  5. 分析数据。
    1. 选择 输入重复值，按列堆叠。
    2. 将数据输入各列，并选择单培养类球体对照组和共培养处理组的类球体样本。
    3. 进行单因素方差分析（one-way ANOVA）列分析。
  6. 使用以下 ANOVA 参数：
    1. 不进行匹配或配对。
    2. 假设残差呈高斯分布。
    3. 假设标准差相等。
    4. 使用 Tukey 多重比较检验，将每列的均值与其他各列的均值进行比较。

11. 宽场免疫荧光图像处理

  1. 直接从成像软件中将图像保存为 PNG 或 Tiff 文件格式。
  2. 选择各个单独的通道或重叠通道，并保存为 PNG 文件。
  3. 如果图像以 Tiff 文件格式导出，可在成像软件或 ImageJ 中调整亮度和对比度。

结果

本研究中，我们建立了一种细胞培养系统，用于生成由上皮细胞和间质细胞组成的、具有类器官形态的异质多细胞三维球体。在单细胞培养条件下，通过接种2,000个上皮细胞建立球体。在两种细胞共培养条件下，通过接种1,000个上皮细胞和1,000个间质细胞建立球体。在三种细胞共培养条件下，通过接种1,000个上皮细胞以及两种不同的间质细胞（每种细胞各500个）建立球体。在球体形成之前，可使用荧光细胞示踪染料对细胞进行染色，以便监测细胞的空间分布。在球体初始形成24小时后，可进行后续实验操作，包括药理学干预、成像和样本采集。延时成像可用于评估球体行为和形态的变化，包括面积和圆形度（图1A）。接种后24小时，可将球体包埋于支架环境中，并利用延时成像评估球体侵袭性结构的出现（图1B）。所获得的异质多细胞球体样本具有多种应用，包括通过RNA测序、单细胞RNA测序、蛋白质组测序和循环免疫荧光等实验技术，在全基因组和单细胞水平上进行基因组学和蛋白质组学分析。

类球体形成过程：间质/上皮细胞混合、显微镜观察、分析、RNA测序。
图1：三维细胞培养过程及潜在应用的示意图。（A）将上皮细胞与非上皮间质细胞的混合细胞悬液加入三维超低吸附板中，以形成类球体。在96小时内，每隔24小时通过明场显微镜对类球体进行成像。可在诱导类球体形成之前，使用荧光细胞示踪染料对细胞系进行染色，用于后续宽场显微镜观察；或在类球体形成后进行药物干预。可对类球体的形态、面积、圆度和组织结构等参数进行分析。（B）使用（A）中的方案形成上皮细胞单独培养，以及上皮细胞与间质细胞共培养的类球体。在单细胞类型培养条件下，通过接种2,000个上皮细胞建立类球体；在两种细胞类型的共培养条件下，接种1,000个上皮细胞和1,000个间质细胞建立类球体；在三种细胞类型的共培养条件下，接种1,000个上皮细胞以及两种不同的间质细胞类型（每种500个细胞）建立类球体。24小时后，覆盖类似支架的基底膜提取物溶液，并在120小时内每隔24小时通过明场显微镜采集图像。（C）所建立的无支架和基于支架的异源多细胞三维培养体系可用于多种下游应用，如循环免疫荧光染色、单细胞RNA测序和单细胞蛋白质组学。请点击此处查看该图的放大版本。

MCF10A、MCF10Ca1h 和 BT-474 单一培养的球状体在接种后 96 小时内保持致密的球形表型。当与 EA.hy926 微血管内皮细胞、BJ-5ta 成纤维细胞和/或 THP-1 类单核细胞共培养时，球状体在边缘形成细胞突起，且在 96 小时时更为明显（图 2A-C）。重要的是，这些突起、出芽及球状体致密化现象代表了癌球状体与共培养的基质细胞在细胞组织结构上的变化，且与添加基底膜来源的水凝胶（如 Matrigel）后所表现出的三维侵袭性相关。出芽形态从实心到松散的细胞聚集体不等，类似于类器官形态。相比之下，MDA-MB-468 单一培养的球状体表现为体积较大、结构松散的细胞聚集体。然而，当 MDA-MB-468 细胞与 EA.hy926、BJ-5ta 和/或 THP-1 共培养时，则形成致密的球状体（图 2D）。

随时间变化的细胞培养生长情况；显微镜图像；MCF7、MCF10A、BF24、MDA-MB-468；科研分析。
图2：在无支架三维培养体系中，非上皮来源的间质细胞与上皮来源的肿瘤或非肿瘤细胞共培养时所形成的多种结构构型与形态特征。 单一培养或与间质细胞共培养条件下，（A）MCF10A、（B）MCF10Ca1h、（C）BT-474、（D）MDA-MB-468 细胞形成的类球体的代表性明场图像，培养时间长达96 h。每个类球体由接种2,000个细胞形成。单一培养条件下的类球体由2,000个上皮细胞构成；共培养条件下的类球体则由1,000个上皮细胞与两种不同的间质细胞各500个共同构成。在MCF10A、MCF10Ca1h和BT-474上皮细胞的共培养类球体中，接种后24 h开始出现芽状结构或聚集形成的类器官样结构。MDA-MB-468细胞的共培养类球体在接种后25 h出现细胞压缩现象。比例尺 = 100 µm。缩写：hpp = 接种后小时数。请点击此处查看本图的放大版本。

接种后72 h，MCF10A、MCF10Ca1h和BT-474细胞与EA.hy926和THP-1，或与BJ-5ta和THP-1共培养时，其类球体面积较单培养的上皮类球体显著增加。MCF10Ca1h在与EA.hy926和BJ-5ta共培养时，类球体面积也显著增大。MCF10A、MCF10Ca1h和BT-474与EA.hy926和THP-1，或与BJ-5ta和THP-1共培养时，类球体出现出芽结构，导致类球体圆形度显著降低。BT-474与EA.hy926和BJ-5ta共培养时也观察到类似效应（图3A，B）。相比之下，MDA-MB-468细胞与EA.hy926和BJ-5ta、EA.hy926和THP-1，或BJ-5ta和THP-1共培养时，其类球体面积较单培养的MDA-MB-468类球体显著减小，但对圆形度无显著影响（图3A，B）。

类球体面积与圆形度分析；不同组分的柱状图；统计学比较。
图3：单培养和异源多细胞间充质3D无支架培养在接种后72小时的面积与圆形度分析图。 (A) 平均面积（cm²）2）和（B) MCF10A、MCF10Ca1h、BT-474 和 MDA-MB-468 在单层培养和异源多细胞间质球体培养中接种后 72 小时的平均圆形度。所报告数据至少代表三次独立的生物学重复实验，以技术重复的平均值 ± 标准误（SEM）表示，除非另有说明。*、**、*** 或 **** 代表 p 数值 < 0.05、0.01、0.001 或 0.0001，除非另有说明。 请点击此处查看此图的放大版本。

在建立球体之前，将细胞示踪染料应用于BT-474致瘤性上皮细胞和间质细胞，结果表明，间质细胞（包括EA.hy926和BJ-5ta）在中心BT-474球体的周边形成了出芽结构（图4、补充视频S1、补充视频S2、补充视频S3和补充视频S4）。在接种后48小时，与成纤维细胞共培养的球体的单个宽场荧光图像显示，成纤维细胞球体与内皮细胞共定位，但不与BT-474球体共定位。在共培养条件下，也有少数内皮细胞与BT-474球体共定位。这表明，球体内间质细胞的排列方式与类器官样形态相关。

BT-474细胞与BJ-5ta及EA.hy926的荧光显微镜图像，显示细胞间相互作用。
图4：铺板后48小时，异源多细胞3D共培养中不同染色的间质细胞与BT-474细胞的宽场荧光静态图像。 BT-474类球体使用蓝色细胞追踪荧光染料染色。BJ-5ta成纤维细胞使用橙色细胞追踪染料染色，在图中以红色表示。Ea.hy926内皮细胞使用深红色细胞追踪染料染色，在图中以绿色表示。每个类球体由接种2,000个细胞形成。单培养条件下的类球体由2,000个上皮细胞形成。共培养条件（BT-474/BJ-5ta、BT-474/Ea.hy926）下的类球体由1,000个上皮细胞和1,000个间质细胞组成。双共培养条件（BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926）下的类球体由1,000个上皮细胞及每种间质细胞各500个组成。该图像代表至少三次生物学重复实验的结果。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看此图的高清版本。

为了评估我们的类器官球状模型的生物学相关性，在接种后24小时，将球状体覆盖于基底膜提取物溶液中。单培养的BT-474球状体在接种后120小时未表现出侵袭特性。然而，与BJ-5ta或EA.hy926共培养的BT-474球状体在球体边缘形成了结构，并侵入了支架基底膜提取物溶液环境。在接种后48至120小时内，与BJ-5ta和EA.hy926共同培养的BT-474球状体中，这些突起的数量和长度均显著增加（图5，补充视频S5，补充视频S6，补充视频S7 和 补充视频S8）。

使用类球体图像和增殖比较的柱状图进行细胞活力测定，显微镜结果。
图 5：BT-474 细胞在异源多细胞三维培养体系中，覆盖基底膜提取物溶液后第 5 天的明场静态图像。每个类球体由接种 2,000 个细胞形成。接种后 24 小时，在类球体上覆盖基底膜提取物溶液。单培养条件下的类球体由 2,000 个上皮细胞形成；共培养条件（BT-474/BJ-5ta 和 BT-474/Ea.hy926）下的类球体由 1,000 个上皮细胞和 1,000 个基质细胞组成；双共培养条件（BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926）下的类球体由 1,000 个上皮细胞及每种基质细胞各 500 个组成。（A）在共培养条件下，可观察到癌类球体嵌入基底膜提取物溶液后伸出的侵袭性结构。（B）接种后 48 小时（48 hpp）侵袭性突起数量的定量分析。（C）接种后 48 小时（48 hpp）侵袭性突起长度的定量分析。该图代表至少三次独立生物学重复实验的结果。比例尺 = 200 µm。缩写：hpp = hours post plating（接种后小时）。 请点击此处查看该图的高清版本。

补充视频 S1：用细胞示踪蓝色染料标记的 BT-474 单一培养类球体。 将 BT-474（2,000 个）细胞重悬于 U 型底超低吸附 96 孔微孔板中以形成类球体。在 48 小时内采集明场与宽场荧光图像的叠加图像。缩写：ULA = 超低吸附。请点击此处下载该视频。

补充视频 S2：BT-474 类球体与 BJ-5ta 成纤维细胞共培养。 将 BT-474 细胞（1,000 个）和 1,000 个 BJ-5ta 成纤维细胞重悬于超低吸附（ULA）培养板中以形成类球体。BT-474 细胞用细胞示踪蓝色染料孵育，BJ-5ta 成纤维细胞用细胞示踪橙色染料标记。在 48 小时内采集明场与宽场荧光（蓝色 = BT-474，红色 = BJ-5ta）图像的叠加图像。缩写：ULA = 超低吸附。 请点击此处下载该视频。

补充视频 S3：BT-474 类球体与 Ea.hy926 内皮细胞共培养。将 BT-474 细胞（1,000 个）与 1,000 个 Ea.hy926 内皮细胞重悬于超低吸附（ULA）培养板中以形成类球体。BT-474 细胞用细胞示踪蓝色染料孵育，Ea.hy926 内皮细胞则用细胞示踪深红色染料标记。在 48 小时内采集明场与宽场荧光图像的叠加图像（蓝色 = BT-474，绿色 = Ea.hy926）。缩写：ULA = ultralow attachment（超低吸附）。请点击此处下载该视频。

补充视频 S4：BT-474 类球体与 BJ-5ta 成纤维细胞及 Ea.hy926 内皮细胞共培养。 将 BT-474 细胞（1,000 个）、500 个 BJ-5ta 成纤维细胞和 500 个 Ea.hy926 内皮细胞重悬于超低吸附（ULA）板中，以形成类球体。BT-474 细胞用细胞追踪蓝色染料孵育；BJ-5ta 成纤维细胞和 Ea.hy926 内皮细胞分别用细胞追踪橙色染料和深红色染料孵育。在 48 小时内采集明场与宽场荧光图像的叠加图像（蓝色 = BT-474，红色 = BJ-5ta，绿色 = Ea.hy926）。缩写：ULA = 超低吸附。 请点击此处下载该视频。

补充视频 S5：基底膜提取物溶液中 BT-474 单一培养类球体。 将 BT-474 细胞（2,000 个）重悬于超低吸附培养板中以形成类球体，并在接种后 24 小时将类球体包埋于基底膜溶液中。连续 60 小时拍摄明场图像。缩写：ULA = 超低吸附。 请点击此处下载该视频。

补充视频 S6：在基底膜提取物溶液中与 BJ-5ta 成纤维细胞共培养的 BT-474 类球体。 将 BT-474 细胞（1,000 个）与 1,000 个 BJ-5ta 成纤维细胞在超低吸附板（ULA）中重悬，以形成类球体，并于接种后 24 小时将类球体包埋于基底膜提取物溶液中。连续 60 小时采集明场图像。缩写：ULA = 超低吸附。 请点击此处下载该视频。

补充视频 S7：在基底膜提取物溶液中与 Ea.hy926 内皮细胞共培养的 BT-474 球体。 将 BT-474 细胞（1,000 个）和 1,000 个 Ea.hy926 内皮细胞重悬于超低吸附培养板中以形成球体，并在接种后 24 小时将球体包埋于基底膜提取物溶液中。连续 60 小时采集明场图像。缩写：ULA = 超低吸附。 请点击此处下载该视频。

补充视频 S8：在基底膜提取物溶液中与 BJ-5ta 成纤维细胞和 Ea.hy926 内皮细胞共培养的 BT-474 类球体。 将 BT-474 细胞（1,000 个）、500 个 BJ-5ta 成纤维细胞和 500 个 Ea.hy926 内皮细胞重悬于超低吸附培养板中以形成类球体，并在接种后 24 小时将类球体包埋于基底膜提取物溶液中。连续 60 小时采集明场图像。请点击此处下载该视频。

讨论

我们的异源多细胞球体模型表明，在无支架的三维培养条件下，上皮-间质细胞相互作用可驱动间质细胞出芽；而在基于支架的三维培养条件下，则可形成侵袭性结构。我们在肿瘤发生性细胞系（MCF10Ca1h 和 BT-474）以及非肿瘤发生性上皮细胞系 MCF10A 中均观察到一致的出芽结构形成（图 2A-C）。有趣的是，尽管 MCF10A、MCF10Ca1h 和 BT-474 细胞系在单培养或与成纤维细胞及内皮细胞共培养时，在无支架环境中均能形成圆形且致密的出芽结构，但 MDA-MB-468 细胞系形成的球体致密性较低（图 2D）。这一结果出乎意料，因为 MDA-MB-468 细胞原本预期会像其他测试的上皮细胞系一样形成圆形球体。而 SUM-149 细胞系作为一种兼具上皮-间充质特性的原发性乳腺癌细胞系，其形成的球体致密性与 MCF10A、MCF10Ca1h 和 BT-474 相似（数据未显示）28。未来的研究应深入探究 MDA-MB-468 细胞系中导致球体致密性降低的信号通路，因为此类异常现象可能揭示细胞的潜在脆弱性，从而为开发新的治疗策略提供契机。

关于不同细胞系的组合，THP-1 类单核细胞在所有类球体共培养条件下均会诱导形成松散的聚集体结构。在 THP-1/Ea.hy926 细胞的共培养条件下，出芽结构的致密程度较 THP-1/BJ-5ta 细胞的共培养条件更低（图 2A-D）。因此，类球体的致密化程度受模型中基质细胞组成的影响29,30。

异源细胞组合接种不一致可能导致类球体发育不完全或类球体大小在技术重复之间出现差异。确保细胞接种的一致性至关重要，因为决定类球体表型和发育的细胞空间排列主要发生在前48小时31。在此关键时期，细胞比例起着重要作用，间质细胞的比例会影响类球体的面积和圆形度。

松散的球状聚集体依赖于细胞类型，在手动操作过程中容易解体。然而，在将球状体覆盖以类似支架的基底膜提取物溶液或收集完整的球状体样本时，手动操作仍是必要的。为缓解这一问题，建议通过移液器吸取收集球状体时放慢操作速度，并尽可能减少手动处理。在覆盖基底膜提取物溶液过程中，球状体容易在孔内发生位移，常沉降于孔的边缘。基底膜提取物溶液与培养基的比例对于维持三维系统的基质特性至关重要；然而，由于基底膜提取物溶液的黏度较高，无法完全包裹球状体，因此需要人工干预32。球状体位置偏离中心会给成像带来挑战，因为孔塑料边缘附近的光线折射可能影响图像清晰度。

本研究中使用的球状体由人类癌细胞系构成；此处描述的方法尚未应用于原代细胞系。我们的结果表明，特定的细胞间相互作用可驱动类器官样结构的形成，提示该方法可能适用于多种肿瘤细胞系。然而，尽管本模型试图模拟肿瘤微环境的复杂性，但不同细胞增殖速率的差异为长期研究带来了挑战33。增殖较快的细胞往往覆盖增殖较慢的细胞，使该模型在长时间实验中适用性降低。此外，不同细胞系对培养基类型的需求差异可能引入额外因素，从而影响球状体的表型。本研究中的大多数细胞系均在DMEM培养基中培养。使用不同培养基培养的细胞系可能需要测试多种培养基配比以优化培养条件；然而，这种影响主要在长期实验中显现30。

我们的模型相较于其他三维癌症模型具有多项优势。我们生成的球状体具有均匀且可重复的初始形态和大小，便于将处理结果与对照组进行比较。相比之下，某些使用悬浮于培养基或支架中的单个细胞的模型可能导致细胞空间分布不均，从而产生不一致性。该模型表明，不同细胞群体之间的相互作用可以得到有效研究。

传统上，类器官和球状体模型由单培养的癌细胞或癌细胞共培养组成，用于研究营养梯度、缺氧或细胞排列情况34。此外，该模型可在接种后24小时内于带支架的环境中进行研究，为探索由多种细胞间相互作用驱动的早期侵袭事件提供了机会。尽管其他三维癌症模型采用不同的支架基质成分来研究球状体形态和侵袭性的变化，但该模型通过允许在细胞群体动态和支架成分的双重背景下研究这些变化，对上述方法形成了有效补充35。

使用我们的方法生成的大多数类球体在人工操作后仍能保持其结构完整性，便于在后续应用中进行样本收集。在类球体形成之前，可预先引入CRISPR-Cas9、慢病毒shRNA转导和siRNA干扰等常规基因修饰。这些类球体中观察到的复杂行为提示基因表达发生了动态变化，可通过RNA-seq进一步研究。此外，还可采用CycIF、scRNA-seq、CosMx和Visium等先进技术，在空间分辨或单细胞水平上研究基因组学和蛋白质组学。该类球体模型有望模拟 体内 通过捕获间质细胞芽与治疗剂在到达癌细胞之前发生的相互作用，研究靶向肿瘤治疗药物的作用机制。这一点至关重要，因为它有助于确定间质细胞是否会影响药物的效力，从而可能保护癌细胞免受治疗作用的影响。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢贝勒大学发育癌基因实验室成员在准备本手稿期间提供的有益意见和反馈。本研究获得了贝勒大学生物系和艺术与科学学院以及美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH-NIGMS 2SC1GM121182，资助对象：J.A.K.）的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 聚丙烯离心管  Falcon 14-959-53A 
96孔、经处理、U型底微孔板 Thermo Scientific 12566432 
100 mm 细胞培养皿，经处理表面 Thermo Scientific 130182 
170 L CO2 培养箱 VWRVWR51014991(10810902)
200 微升自封式屏障移液吸头Fisher Scientific02-682-255
500 mL DMEM/Hams F-12，含 L-谷氨酰胺Corning10-090-CV
1000 微升自封式屏障移液吸头Molecular Biology Products Inc.2179HR
无动物源性重组人表皮生长因子（EGF）PeproTechAF-100-15
自动化重复移液器 E3xEppendorf4987000410
基底膜溶液Huntsman Cancer Institute https://healthcare.utah.edu/huntsmancancerinstitute/
珠浴Lab Armor 74300706
Biorender BiorenderBiorender.com 
生物安全层流柜 Thermo Scientific300590389
BioSpa 8 自动化培养箱 Agilent  23082120
细胞计数仪 InvitrogenAMQAF2000
细胞计数板载玻片Thermo ScientificC10283
CellTracker Deep Red Thermo Fisher Scientific C34565 
离心机 Thermo Scientific 13100675
霍乱毒素B亚基Sigma-AldrichC9903-1MG
Combitips advanced，无菌，5.0 mLFisher Scientific13-683-714
Cytation 10 读板成像仪Agilent 2105245
确定型胰蛋白酶抑制剂 Gibco R007100 含于1x PBS中的大豆胰蛋白酶抑制剂
供体马血清，500 mL，美国来源Corning35-030-CV
杜尔贝科改良伊格尔培养基 Corning 10-013-CV 
Excel 软件 Microsoft Office 365 https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
胎牛血清 Thermo Scientific 26140079 
胎牛血清，经鉴定合格，美国来源Thermo Scientific26140079
硫酸庆大霉素，液体Corning30-005-CR
GraphPad Prism
氢化可的松溶液，50 µM，经无菌过滤，BioXtraSigma-AldrichH6909-10ML
Image J 软件 Fiji https://imagej.net/ij/
人胰岛素溶液Sigma-AldrichI9278-5ML
放大镜 Fisher Scientific 01-182-392 
微量离心管 Costar 3621 
显微镜OlympusCKX53SF
小型光源箱 Fisher Scientific 361044708 
Molecular Probes CellTracker Blue CMAC 染料 Fisher Scientific C2110 
Molecular Probes CellTracker Orange CMRA 染料 Fisher Scientific C34551 
青霉素-链霉素溶液CytivaSV30010
青霉素-链霉素溶液 Cytiva SV30010 
相差显微镜 Echo RVSF1000
磷酸盐缓冲液 Fisher Scientific SH3025601 
移液控制器Corning4099
移液器 100 – 1,000 µLEppendorf3123000063
移液器 20 – 200 µLEppendorf3123000055
Prism GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/features
RPMI 1640 培养基，含 L-谷氨酰胺和 25 mM HEPESCorning10-041-CV
血清移液管，10 mLThermo Scientific170356N
血清移液管，25 mLThermo Scientific170357N
血清移液管，5 mLThermo Scientific170355N
台盼蓝溶液，0.4% Corning 25900CI 
胰蛋白酶-EDTA，0.25% Corning 25053CI 

参考文献

  1. de Visser, K. E., Joyce, J. A. The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth. Cancer Cell. 41 (3), 374-403 (2023).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Curr Biol. 30 (16), R921-R925 (2020).
  4. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochem Soc Trans. 45 (1), 229-236 (2017).
  7. Iozzo, R. V., Sanderson, R. D. Proteoglycans in cancer biology, tumour microenvironment and angiogenesis. J Cell Mol Med. 15 (5), 1013-1031 (2011).
  8. Amersfoort, J., Eelen, G. Immunomodulation by endothelial cells - partnering up with the immune system. Nat Rev Immunol. 22 (9), 576-588 (2022).
  9. Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nat Commun. 8 (1), 15422(2017).
  10. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  11. Wang, E., Xiang, K., Zhang, Y., Wang, X. -F. Patient-derived organoids (PDOs) and PDO-derived xenografts (PDOXs): New opportunities in establishing faithful pre-clinical cancer models. J Natl Cancer Cent. 2 (4), 263-276 (2022).
  12. Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
  13. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  14. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  15. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 160(2023).
  16. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nat Genet. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  17. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  18. Ivanics, T., et al. Patient-derived xenograft cryopreservation and reanimation outcomes are dependent on cryoprotectant type. Lab Invest. 98 (7), 947-956 (2018).
  19. Biju, T. S., Priya, V. V., Francis, A. P. Role of three-dimensional cell culture in therapeutics and diagnostics: an updated review. Drug Deliv and Transl Res. 13 (9), 2239-2253 (2023).
  20. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  21. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  22. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. J Biomed Sci. 31 (1), 7(2024).
  23. Yakavets, I., et al. Advanced co-culture 3D breast cancer model for investigation of fibrosis induced by external stimuli: optimization study. Sci Rep. 10 (1), 21273(2020).
  24. Mohammadrezaei, D., et al. Predicting and elucidating the post-printing behavior of 3D printed cancer cells in hydrogel structures by integrating in-vitro and in-silico experiments. Sci Rep. 13 (1), 1211(2023).
  25. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLOS ONE. 12 (7), e0182039(2017).
  26. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  27. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  28. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  29. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. Int J Mol Sci. 20 (7), 1629(2019).
  30. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 20 (5), 279-293 (2020).
  31. Beerkens, A. P. M., et al. Characterizing OXPHOS inhibitor-mediated alleviation of hypoxia using high-throughput live cell-imaging. Cancer Metab. 12 (1), 13(2024).
  32. Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress. Cir Res. 117 (12), 995-1000 (2015).
  33. Huang, Z., Yu, P., Tang, J. Characterization of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell spheroid model. Onco Targets Ther. 13, 5395-5405 (2020).
  34. Nam, S., Khawar, I. A., Park, J. K., Chang, S., Kuh, H. -J. Cellular context-dependent interaction between cancer and stellate cells in hetero-type multicellular spheroids of pancreatic tumor. Biochem Biophys Res Commun. 515 (1), 183-189 (2019).
  35. Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).

重印与许可

标签

三维细胞培养无支架类器官基质细胞共培养乳腺癌模型肿瘤微环境球体形成细胞侵袭实验荧光细胞标记基底膜提取物上皮-间质相互作用
无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。