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猪腰椎脊髓导管植入手术技术：在终末实验设置中实现对蛛网膜下腔的持续通路

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DOI：

10.3791/67907

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2025年2月28日

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1Department of Neurosurgery, Aalborg University Hospital, 2Department of Infectious Diseases, Aalborg University Hospital, 3Department of Radiology, Aalborg University Hospital

本文内容

摘要

我们介绍一种在3月龄丹麦长白猪L4-L5水平插入腰椎导管的技术，作为终末期研究方案的一部分，可用于从蛛网膜下腔进行持续输注或脑脊液取样。

摘要

由于猪与人类中枢神经系统（CNS）在解剖结构和生理特性上具有相似性，猪正越来越多地被用作药理学中枢神经系统研究的大动物模型。然而，由于大型猪种的脊柱棘突呈斜向排列且椎板间隙有限，采用传统的腰椎穿刺技术获取脑脊液（CSF）具有较大挑战性。因此，本文详细描述了一种在猪L4/L5节段通过开放性外科手术置入腰椎导管以实现连续脑脊液采集的方法。在将猪体位固定并确定解剖标志后，作背部正中线手术切口以暴露棘突。通过推进套管针，将脊髓导管插入椎管内的蛛网膜下腔，同时保持脊柱骨性结构完整。该方法可实现对猪蛛网膜下腔的持续灌注或取样，且出血量和脑脊液渗漏极少。该操作简便、耗时短，在不同实验条件下均具有良好的可重复性，因而在多种临床前研究中具有重要应用潜力，包括药代动力学研究、外科手术培训以及脊髓损伤模型等。

引言

在由于伦理或实际限制而无法使用人类受试者研究疾病或测试外科手术方法时，动物模型至关重要。尽管啮齿类动物因成本较低而被广泛使用，但其与人类存在显著差异，限制了其转化应用价值1。相比之下，猪具有多种优势，包括在解剖结构和生理特征上与人类更为相似，尤其是在中枢神经系统（CNS）研究方面1,2。犬类模型历史上曾被用作CNS研究的实验模型，但近年来由于伦理方面的考虑，犬类的使用受到限制3。此外，猪的器官大小与人类相近，使其在手术研究和操作培训中更具应用价值4。猪的中枢神经系统和脊柱在脑与脊髓的结构及功能方面与人类高度相似1,5,6。重要的是，猪的脊柱和椎管尺寸适合开展多种临床前研究7,8，包括外科手术操作培训9,10、药物渗透性研究11,12,13以及脊髓损伤研究14。

在猪模型中获取脑脊液（CSF）对于许多实验设置至关重要。虽然腰椎穿刺可用于单次脑脊液采样或鞘内给药，但重复进行腰椎穿刺并不现实，且存在椎管内血肿、神经损伤以及脑脊液血液污染等潜在风险。在临床患者中，脊髓微导管常用于动脉瘤性蛛网膜下腔出血时的持续腰椎脑脊液引流，鉴于其尺寸相似，理论上也适用于猪的持续脑脊液采集。然而，猪的物种特异性解剖结构差异为脑脊液获取带来了独特挑战。例如，椎板重叠、韧带骨化以及丰富的硬膜外脂肪组织使得传统的经皮腰椎穿刺技术可靠性降低15。在哥廷根小型猪中，已采用一种微创经皮方法，可实现多次脑脊液采样16。该方法依赖手动定位腰椎椎间隙，且导管置入过程在未直视引导器的情况下完成。然而，由于较大体型猪只的椎体尺寸、棘突形态以及硬膜外脂肪组织量存在解剖变异，该技术在大型猪模型中应用受限，经皮导管置入更为困难15。因此，在大型猪模型中，可能需要采用更为侵入性的手术方式暴露脊柱，以确保导管置入的可靠性。

本文的目的是描述在L4/L5水平将脊髓导管插入猪蛛网膜下腔的手术操作步骤。该手术包括对受试动物进行体位安置，依据解剖学标志规划手术切口，并在置管前暴露脊柱的后部骨性结构。

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方案

实验动物的饲养符合丹麦动物实验监察局的批准要求（许可证号：2020-15-0201-00401），并遵守当地法规。受试对象信息：家猪，雌性，约40 kg，3月龄。

1. 受试对象饲养与术前禁食

  1. 在手术前至少14天，将受试动物分组饲养于符合标准的饲养栏内，保持12小时光照/12小时黑暗的循环环境，以确保其充分适应环境并减少应激反应17。
  2. 确保受试动物在计划实施麻醉前已禁食12小时，以降低反流风险。若受试动物的饮食包含苜蓿或其他类型的干草，则必须在手术前2-3天将其从饮食中去除，因为此类饲料可能进一步延缓胃排空时间18。

2. 麻醉与监测

  1. 使用 Zoletil（氯胺酮 6.25 mg/mL、唑拉西泮 6.25 mg/mL、替来他明 6.25 mg/mL、布托啡诺 1.25 mg/mL 和赛拉嗪 6.25 mg/mL 的混合物）按每 10 kg 体重 2 mL 的剂量进行肌肉注射，使受试动物麻醉。
  2. 将受试者仰卧于加热毯上，以支持体温调节。
  3. 使用6.5号导管对受试者进行插管19，并根据呼气末潮气二氧化碳浓度，以8-10 mL/kg的潮气量、16-22次/分钟的呼吸频率，用未加湿的空气进行机械通气2 浓度 < 6.0 kPa
    注意：CO2 读数证实导管位于气管内的正确位置。
  4. 通过吸入3%-4%的七氟烷蒸气维持麻醉18.
  5. 双侧小心涂抹眼膏，以防止麻醉期间眼睛干涩。
  6. 每10分钟检查一次肌肉松弛程度和瞳孔反射，以确保麻醉深度足够th 分钟18.
  7. 经尿道将带有温度计的膀胱导管插入受试者膀胱内19 监测体温，并使用合适的导尿袋收集尿液。
  8. 通过经皮穿刺，在合适的浅表耳缘静脉插入外周静脉导管，并用于持续输注生理盐水（NaCl，0.9%）、给药，以及在研究结束时实施安乐死。
  9. 通过经皮穿刺在右侧股动脉插入股动脉导管（6 Fr 导管）。利用此通路进行连续有创血压监测。
  10. 在整个操作过程中，每5分钟监测一次受试者的生命体征。
    注意：生命体征包括脉搏、连续有创动脉血压、膀胱内温度和呼气末二氧化碳2 浓度

3. 动物体位

  1. 将受试者俯卧位置于手术台中央，确保其脊柱保持平直，以避免出现脊柱侧弯。
  2. 在脊柱腰段下方放置沙袋，以增大椎板之间的角度。
  3. 使用修剪器剃除手术区域的毛发。
  4. 以离心方式在手术区域涂抹碘溶液，重复此过程直至整个手术区域均被覆盖。
  5. 将受试者体位略微调整为直立倾斜位。

4. 外科手术器械的准备

  1. 准备材料表中列出的手术器械。

5. 确定关键解剖学标志

  1. 在受试者腰椎两侧确定髂嵴位置，并沿其轮廓向内侧移动，直至识别出骶骨（图1）。
  2. 在骶骨颅侧端与L6棘突之间的中线上确定椎间隙。
  3. 识别L6、L5和L4的棘突（图1，图2）。

6. 暴露棘突

  1. 使用24号手术刀沿L4-L6棘突做正中切口，切开皮肤和皮下组织。
  2. 使用单极电凝器对浅表静脉和小动脉的少量出血进行电灼止血。
  3. 用手术棉片擦去血液，检查是否有活动性出血；必要时使用单极电凝器进行电灼止血。
    注意：即使为轻微出血也应彻底止血，以避免形成血肿。
  4. 插入手术牵开器并扩大切口。
  5. 辨认位于棘突背侧的棘上韧带。
  6. 沿棘突侧方使用单极电凝器逐步扩大切口，直至暴露出约1 cm长的棘突（图3）。
    注意：若操作者为右利手，建议沿受试者右侧棘突侧方进行操作，以便后续顺利插入导引器。
  7. 辨认L4/L5之间的棘间韧带（图3）。
  8. 检查是否有活动性出血，并根据需要使用单极电凝器进行电灼止血。

7. 蛛网膜下腔的通路

  1. 通过手动触诊确定棘突椎板之间的L4/L5椎间隙。
  2. 将导引器放置到位，其斜面和管腔朝向头侧，倾斜对准L4/L5椎板间间隙（图2，图4，图5）。
  3. 确保导引器保持30°水平角和45°头侧倾斜角（图5）。
    注意：应指向L4/L5椎板间间隙。
  4. 逐渐推进导引器，直至感受到轻微阻力；此阻力代表黄韧带。
    注意：若感觉为钝性阻力，表明导引器已抵住棘突。此时应将导引器回撤1 cm，并以稍不同的角度再次推进。
  5. 施加稳定但极为谨慎的压力，以毫米为单位逐步推进导引器，穿过黄韧带，直至感受到突然的阻力消失。
    注意：若受试动物腰背部肌肉或后肢出现运动反射，这是由于神经根直接受到接触所致，而非麻醉不足。
  6. 每次推进导引器后，均应取出穿刺针芯，检查是否有可见的脑脊液流出。
  7. 在导引器穿透黄韧带并继而穿透硬脑膜后，通过观察是否有脑脊液从导引器流出，以视觉确认其是否正确置于椎管内。
    注意：脑脊液的自发流出可能较慢。可通过向导引器内注入无菌生理盐水并观察是否出现搏动来加快确认过程。
  8. 在准备导管时，将针芯重新插入导引器中，以避免脑脊液过度流失。

8. 将导管插入蛛网膜下腔

  1. 将导丝插入导管中。
  2. 从套管针中取出穿刺针芯。
  3. 将带有导丝的导管插入套管针内，直至感到轻微阻力。
  4. 从套管针远端测量5 cm，并用手术标记笔做一标记。
  5. 推进导管进入蛛网膜下腔时施加轻柔但稳固的压力，直至此前标记的位置到达套管针处。
    注意：由于脊髓反射，即使动物已充分麻醉，仍可能出现抽搐或移动。
  6. 小心撤出套管针，同时保持导管位置不变。
    注意：一旦导管在皮肤上方可见，应立即牢固握住导管，以防套管针拔出时导管移位。
  7. 在保持皮肤水平处牢固握住导管的同时，取出导丝（图6）。
  8. 将一支2 mL一次性塑料注射器连接到导管上。
  9. 通过从导管抽吸脑脊液（CSF）以确认导管位于椎管内。
  10. 若注射器中未见脑脊液，可轻微回撤导管数毫米，以恢复通畅。
  11. 使用胶带将脊髓导管固定于手术拉钩和皮肤上，防止移位。

9. 脂多糖给药

  1. 向中心静脉导管内注入 400 μg 大肠杆菌（E. coli）脂多糖（LPS）（血清型：143）。
  2. 启动计时器。

10. 脑脊液采样

  1. 在接下来的24小时内，每小时采集一次脑脊液样本，用于检测总白细胞计数、脑脊液白蛋白和脑脊液IgG。每次采集的脑脊液样本量不得超过0.5 mL。

11. 安乐死

  1. 通过外周静脉导管注射戊巴比妥（50 mg/kg）进行冲击剂量给药。
  2. 观察呼吸机上的脉搏、血压及呼气末 CO2 浓度曲线是否呈直线，以确认心脏停搏。

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结果

将猪置于俯卧位可优化对腰椎的手术入路。使用支撑性沙袋可增加相邻腰椎棘突之间的角度，从而改善对椎管的入路。

本研究旨在探讨脑室内接种E. coli脂多糖后脑脊液（CSF）腔内的炎症反应。共对10头猪进行了该操作，随后的脑脊液分析显示，脑脊液总白细胞平均值从0小时的30 × 106/L（范围为17–39）上升至12小时的19,720 × 106/L（11,353–30,546）；脑脊液白蛋白水平从0小时的0.05 g/L（0.03–0.07）上升至12小时的0.15 g/L（0.14–0.17），从而证实了脑部炎症的发生，并表明所有脊髓导管均通过本研究所述技术被正确置入（图7）。在本研究中，关键解剖标志——特别是髂嵴、骶骨以及L4、L5和L6的棘突——被用于切口前精确定位椎体中线（图1）。切开皮肤及皮下组织后，暴露L4、L5和L6的棘上韧带及棘突，以确认解剖中线（图...

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讨论

在猪体内进行腰椎导管插入以实现脑脊液（CSF）连续采样的示范操作包含多个关键步骤。首先，必须暴露正确的椎体水平，以确保导管置入成功所需的理想条件。与人类相比，猪的脊髓向尾端延伸更长，可达S2-S3水平15，而人类的脊髓圆锥通常终止于L1-L2水平20。因此，在猪体内通过腰椎途径获取脑脊液更具挑战性，尤其是在较高的腰椎节段，因为脊髓在这些区域占据了更多的鞘内空间。根据我们的经验，L4/L5或L5/L6节段是较为适合导管插入的部位，因为在这些节段，脊髓所占椎管的比例相对较小21。

本文介绍的手术方法与较微创的技术形成对比，例如 Bergadano 等人开发的微创脑脊液（CSF）采集模型，该模型在哥廷根小型猪中采用经皮腰椎穿刺术16。在该技术中，通过手动触诊确定腰椎的椎间隙，并以45°的水平倾角进行穿刺针导入。导引器是否正确置于硬膜外腔，依赖于导管插入过程中阻力消失感的判断。尽管微创技术具有组织损伤...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨向丹麦奥尔堡大学医院生物医学实验室工作人员分享的经验表示诚挚的感谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可调节手术台 N/AN/A
Bair Hugger 加热器3M B5005241003
Bair Hugger 加热毯3MB5005241003
6.5 号气管插管DVMedDVM-107860带套囊气管插管 
Euthasol Vet Dechra Veterinary Products A/S380019用于安乐死的苯巴比妥，400 mg/mL 
12F 导尿管 Becton, Dickinson and CompanyD175812E内置热敏传感器的导尿管 
外周静脉导管Avantor BDAM38134418G 规格
静脉鞘管 Coris AvantiAvanti Cordis 股动脉鞘管 6F
单极电刀 ForceTriad 系统Medtronic
2 mL 塑料注射器 Becton, Dickinson and Company300928
Primus 呼吸机 Dräger 内置蒸发器的呼吸机，用于辅助七氟烷麻醉 
自持式拉钩World Precision Instruments501722Weitlander 自持式拉钩，14 cm 钝头 
硅胶腰椎导管（含导入器）IntegraNL8508330
无菌生理盐水 Fresnius Kabi8055411000 mL 
无菌手术棉签
24 号手术刀片Swann Morton5.03396E+12Swann Morton 无菌一次性 24 号手术刀
Zoletil Vet Virbac用于诱导麻醉的药物混合物

参考文献

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