线粒体膜电位的测定 在体实验 使用基因编码的电压指示剂

摘要

本方案描述了靶向线粒体的基因编码电压指示剂（GEVIs）的应用。与传统的线粒体膜电位染料相比，这些GEVIs能够实现特异性、活体（in vivo）和实时的线粒体膜电位监测，具有显著优势。

摘要

线粒体膜电位（MMP，ΔΨ_m）对线粒体功能至关重要，包括ATP合成、离子转运、活性氧（ROS）生成以及细胞核编码蛋白的导入。目前测量ΔΨ_m的方法通常使用亲脂性阳离子染料，如罗丹明800和四甲基罗丹明甲酯（TMRM），但这些方法存在特异性低的局限性，且不适用于体内应用。为克服这些局限，我们开发了一种利用基因编码电压指示剂（GEVIs）的新方法。基因编码电压指示剂（GEVIs）能够响应膜电位变化产生荧光信号，在监测质膜和神经元电位方面已展现出显著潜力。然而，其在线粒体膜上的应用尚未被探索。在此，我们开发了基于蛋白质的线粒体靶向GEVIs，可在活体动物的细胞和运动皮层中检测ΔΨm的波动。线粒体电位指示剂（MPI）提供了一种非侵入性方法，用于实时研究ΔΨ_m动态变化，从而为在正常和病理条件下探究线粒体功能提供了新途径。

引言

线粒体是真核细胞中至关重要的细胞器，主要通过三磷酸腺苷（ATP）的生成为细胞提供能量，同时还执行多种其他关键功能，如代谢物合成、钙离子缓冲、产热以及调控细胞存活¹。这些功能在脑和心脏等高代谢组织中尤为重要，有助于维持细胞稳态。线粒体膜电位（MMP, Ψ_m）在这些过程中居于核心地位，包括驱动通过氧化磷酸化合成ATP、促进代谢物和离子跨线粒体膜的转运，以及参与活性氧（ROS）的生成^2,3。MMP还影响线粒体的形态与动态变化⁴，包括线粒体自噬（线粒体的选择性降解）⁵和细胞凋亡（程序性细胞死亡）⁶。维持适当的Ψ_m对细胞功能至关重要；其失调与多种病理状态相关，包括神经退行性疾病、心力衰竭和癌症。目前测量Ψ_m的方法主要依赖于脂溶性阳离子染料，如TMRM（四甲基罗丹明甲酯）、TMRE（四甲基罗丹明乙酯）、罗丹明123、藏红O、罗丹明800、DiOC6、JC-1等⁷。然而，这些荧光分子存在若干局限性。这些染料缺乏细胞特异性，易受淬灭影响，部分还具有毒性。此外，它们会随时间发生扩散，当线粒体ΔΨ丧失时，染料会泄漏出去，导致无法指示去极化线粒体的膜电位。进一步地，基于罗丹明的染料（如TMRM和TMRE）对温度敏感⁸，因此在测量涉及细胞产热生理活动过程中的线粒体膜电位时，必须仔细考虑温度对染料荧光的影响。

基因编码的电压指示剂（GEVIs），是一类能够通过荧光信号检测膜电位变化的蛋白质^9,10已成为在多种细胞环境中监测膜电位的有力工具¹¹尽管基因编码电压指示剂（GEVIs）已被广泛应用于质膜的研究，但在将其改造用于检测细胞内膜电位（特别是线粒体膜电位）方面进展甚微。本实验方案旨在通过使用靶向线粒体的基因编码电压指示剂来填补这一空白，以实现对线粒体膜电位的监测 体外 和 体内通过向现有的基因编码电压指示剂（GEVIs）添加线粒体信号序列，可将合适的GEVI靶向定位至线粒体¹²这些线粒体电位指示剂（MPI）将为线粒体生理学提供新的见解，并在探索多种疾病状态下线粒体功能方面具有重要意义 体内，加深了我们对线粒体动力学在正常和病理细胞过程中作用的理解。

方案

所有动物护理和实验均按照郑州大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。使用前对所有外科器械进行灭菌。遵循无菌技术以防止感染。在获取全部数据后，采用过量吸入性麻醉剂使动物安乐死，随后进行断头处死。

1. 体外 应用

1. 质粒构建
   1. 从 Addgene 获取加速型动作电位传感器 1（ASAP1）和 ASAP3 基因，或根据序列进行合成。（ASAP1，NCBI 登录号：AHV90412.1，Addgene 编号：52519；ASAP3，Addgene 编号：132331）。
   2. 使用 表 1 中列出的引物进行质粒构建。
   3. 为在细胞中表达，使用 EGFPN1 载体进行构建。
      1. 首先，合成 cox8 基因序列（NP_004065，氨基酸 1-29），在其两侧添加四个串联重复序列（4cox8），并以 NheI 和 XhoI 限制性酶切位点作为侧翼。用 NheI 和 XhoI 分别对合成的 4cox8 片段和 EGFPN1 载体进行双酶切，随后连接，生成 4cox8-EGFP 载体。
      2. 接着，使用引物 1 和引物 2 对 ASAP1 序列进行 PCR 扩增。用 SalI 和 NotI 对 ASAP1 片段和 4cox8-EGFP 载体进行双酶切，随后连接，生成最终的 MPI-1 载体（MPI 代表线粒体电位指示剂）。
         注：CMV-MPI-1 的载体图谱见 图 1。详细序列可通过 NCBI 获取（登录号：PQ678920）。
   4. 为在神经元中实现特异性表达，使用引物 3 和引物 4 从 AAV-hSyn-EGFP 质粒（NCBI 登录号：MH458079，Addgene 编号：50465）中扩增 hSyn 启动子序列。
      1. 用 AseI 和 NheI 分别对 hSyn 序列和 4cox8-EGFP 载体进行双酶切，随后连接，生成 hSyn-4cox8-EGFP 载体。接着，使用引物 1 和引物 2 对 ASAP3 序列进行 PCR 扩增。
      2. 用 SalI 和 NotI 分别对 hSyn-4cox8-EGFP 载体和 ASAP3 序列进行双酶切，随后连接，生成 hSyn-MPI-2 载体。
         注：PCR 反应条件将根据所用特定酶和引物的熔解温度（Tm）而有所不同。典型的 PCR 反应包括：95 °C 预变性 30 秒，随后进行 25-35 个循环（每个循环包括 95 °C 变性 10 秒、55 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒/kb），最后在 72 °C 延伸 5 分钟以确保产物完全合成，然后在 4 °C 保存。退火温度应比引物的 Tm 值低约 5 °C。请参考试剂生产商的说明书以确定最佳 PCR 参数。ASAP1 和 ASAP3 的引物相同。
2. 活细胞成像
   1. 通过向培养基中添加 10% 胎牛血清和 100 mg/L 青霉素/链霉素，配制 DMEM 培养基。
   2. 配制 Ca²⁺ 磷酸钙转染试剂：2.5 mol/L CaCl₂，2x HEBS（274 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1.4 mmol/L Na₂HPO₄，15 mmol/L D-葡萄糖，42 mmol/L HEPES，pH 7.07）。
   3. 配制 Tyrode's 缓冲液用于成像过程中维持细胞（145 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L 葡萄糖，pH 7.4）。
   4. 将 Hela 细胞接种于 35 mm 培养皿中，加入 DMEM 培养基，在 37 °C、5% CO₂/95% 空气的培养箱中培养。每皿加入 2-3 片盖玻片，使细胞在其上生长。
   5. 采用磷酸钙沉淀法对 Hela 细胞进行转染。
      1. 开始转染时，先将旧培养基更换为 2 mL 无血清 DMEM。35 分钟后，在微量离心管中将 10 µg DNA、4 µL CaCl₂ 和 ddH₂O 混合至终体积 40 µL，制备 DNA/Ca²⁺ 溶液。
      2. 在剧烈搅拌下，将 40 µL 2x HEBS 溶液逐滴加入 DNA/Ca²⁺ 溶液中。用移液器向混合物中吹入空气，促进磷酸钙沉淀形成。
      3. 25 分钟后，将 80 µL 沉淀液加入含细胞的培养皿中，并放回培养箱继续培养 1-2 小时。随后，吸除无血清 DMEM，并用 15% 甘油（溶于 PBS）冲洗细胞 2 分钟。
      4. 吸除甘油后，加入 2 mL 含 10% FBS 的 DMEM，继续培养 16-24 小时。
   6. 将带有细胞的盖玻片放入 35 mm 培养皿中，加入 2 mL Tyrode's 缓冲液，并通过向培养皿中加入 20 µmol/L 罗丹明 800 染料（溶于 ddH₂O）至终浓度 50 nmol/L 对细胞进行染色。
   7. 准备荧光显微镜，设置合适的滤光片和光源，使用 488 nm 光源激发蛋白，收集 490-540 nm 的发射光；使用 633 nm 光源激发罗丹明 800 染料，收集 650-720 nm 的发射光。
   8. 配制 500 µM（储备液）的羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）溶液，并在成像过程中加入细胞，使其终浓度为 5 µM。
      注：2x HEBS 溶液的 pH 值对转染效率至关重要，应使用固体氢氧化钠精确调节至 7.07，pH 值不得低于 7.01 或高于 7.12。

图1：CMV-MPI-1 载体图谱。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 体内 应用

1. 质粒构建
   1. 对于 体内 表达时，使用 AAV 病毒进行转导。获取用于 AAV 包装的表达载体（Addgene ID：46954 或 26968），该载体包含 AAV 病毒包装所需的反向末端重复序列（ITR）。
   2. 使用引物5和7对hSyn-MPI-2载体（来自步骤1.1.4）进行PCR扩增 表1.
   3. 使用相同的模板以及引物6和8进行第二次PCR扩增 表1.
   4. 使用第一轮和第二轮 PCR（步骤 2.1.2 和 2.1.3）的产物作为模板，以引物 5 和引物 8 进行最终的 PCR 扩增 表1，生成最终的 hSyn-MPI-2 序列。
   5. 用 MluI 和 EcoRI 酶切 hSyn-MPI-2 序列和 pAAV 骨架，随后进行连接，以生成最终的 pAAV-hSyn-MPI-2 构建体。pAAV-hSyn-MPI-2 的载体图谱如图所示 图2详细序列可从NCBI获取（登录号：PQ678919）。
      注意：hSyn-MPI-2 载体包含一个源自原始 EGFPN1 骨架的内部 EcoRI 位点，该位点通过重叠 PCR 策略使用修饰引物（步骤 2.1.2–2.1.4）予以去除。
2. 病毒制备与转导
   1. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中，使用含10% FBS的DMEM培养基，在100 mm培养皿中培养HEK293t细胞。₂/95% 空气条件下培养至 70% 汇合度。
   2. 使用磷酸钙沉淀法将AAV基因质粒、衣壳质粒（pAAV-DJ 或 pAAV9）和辅助质粒（pHelper）共转染至 HEK293t 细胞中。各质粒的DNA用量如下：基因质粒：10 µg，pHelper：11 µg，衣壳质粒：9 µg。转染试剂用量：CaCl₂ 12 µL。₂120 µL 的 2x HEBS。
   3. 将转染的细胞孵育72小时，以使病毒得以产生。
   4. 孵育结束后，以400 × g离心收集细胞 g用 PBS 洗涤细胞 2 次，然后将细胞重悬于 400 µL PBS 中。
   5. 采用冻融法（37 °C 和 -80 °C）对细胞悬液进行四次冻融循环以收获病毒。将裂解物在 13,500 × g 在 4 °C 条件下离心，弃去沉淀。上清液中含有 AAV 病毒。
   6. 采用实时 PCR 法测定所制备病毒的滴度。腺相关病毒（AAV）滴度测定的详细实验方案可参见 https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology/。
   7. 分装并置于 -80 °C 保存制备好的 AAV 病毒。
3. 立体定向病毒注射
   1. 用3%戊巴比妥钠按30 mg/kg剂量通过腹腔注射麻醉一只体重为24–26 g的成年C57/BL雄性小鼠。麻醉后，将小鼠固定于立体定位仪上，以在整个操作过程中保持稳定体位。
   2. 涂抹兽用眼科软膏，以保护眼睛免受光损伤并保持眼睛湿润。
   3. 使用脱毛膏去除小鼠头部的毛发，暴露头皮。
   4. 使用手术剪切开头皮，暴露颅骨。用3%过氧化氢处理颅骨，以消毒并显示关键解剖标志，如前囟点（bregma）和后囟点（lambda）。
   5. 调整小鼠头部的位置，确保颅骨处于水平状态。
   6. 使用可编程微电极拉制仪将玻璃毛细管拉制成所需形状和尺寸，以实现精确注射。用石蜡油填充玻璃微电极。
   7. 将微量移液器定位至目标位点。本方案中的目标区域为右侧M2区，坐标如下：AP（前后向），+1.94 mm；ML（内外向），+0.75 mm；DV（背腹向），-1.5 mm。
   8. 使用电钻在目标位置的颅骨上钻一个小孔。
   9. 吸取500 nL病毒，滴度为1.5 × 10¹¹ 通过微量移液器尖端每毫升基因组拷贝数（GC/mL）。使用注射泵以100 nL/min的流速向目标位点注入500 nL病毒。
   10. 注射后，将移液管留在原位约5分钟，以使物质充分扩散，然后小心地撤出。
   11. 将光学纤维（直径200 µm，数值孔径0.37，长度2 mm）植入注射部位。
   12. 使用牙科水泥将光纤固定到位。
   13. 用5-0尼龙线（美容针Δ1/2 4x12）缝合小鼠头皮，并将其放回饲养笼中。
   14. 将小鼠的饲养笼放置在加热垫上，以维持其体温，直至完全从麻醉中恢复。
   15. 动物开始活动后，关闭加热垫。将小鼠在室温下再适应2小时，然后转移至饲养设施。
   16. 实验小鼠在22 °C环境下，置于12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄食和饮水，持续2-3周，以允许病毒表达。
4. 光纤光度法
   1. 将植入小鼠体内的光纤连接至光导电缆。
   2. 将光纤的另一端连接至用于采集成像数据的检测器。
   3. 成像时，使用光源在488 nm波长下激发蛋白质，设置检测器收集490 nm至540 nm波长范围内的发射光。
   4. 调节激发光强度，以在不损伤脑组织的前提下优化信号。
   5. 调整荧光信号的增益，以确保检测器捕获到清晰且强烈的信号。
   6. 为避免荧光快速淬灭而影响成像质量，可根据需要优化调整光源强度和荧光信号增益。
   7. 进行小鼠行为学测试。
   8. 在行为测试期间持续监测成像过程。
5. 数据分析
   1. 使用 Python 和 GNUplot 创建实验试验的热图，以直观展示数据。源代码在 补充文件 1.

图 2：AAV-hSyn-MPI-2 的载体图谱。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

构建CMV-MPI-1质粒后，使用线粒体标记物Rhodamine 800对Hela细胞进行染色，检测其靶向线粒体的能力。共定位实验显示，MPI-1的荧光信号与Rhodamine 800的信号之间存在高度重叠，表明MPI-1成功定位于线粒体中（图3）。

图 3：MPI-1 在 Hela 细胞中与线粒体的共定位。 将 CMV-MPI-1 转染至 Hela 细胞，并使用对线粒体膜电位敏感的染料罗丹明 800（rhodamine 800）进...

讨论

在静息状态下，线粒体膜电位维持在 -120 至 -180 mV 之间，并随代谢状态的变化而波动。目前，线粒体膜电位的测量可通过电生理学方法和荧光染料方法实现。线粒体膜片钳技术需要分离线粒体并破坏细胞结构¹³，该方法可能导致测量结果偏离生理条件。荧光探针法是测量线粒体膜电位的常用方法。然而，这些荧光分子无法特异性地标记特定细胞，易发生淬灭，且部分染料具有毒性。此外，由于存在缺乏细胞特异性以及在较长时间尺度（约 30 分钟）内达到平衡等固有局限性，这些染料不适用于活体（in vivo）应用。

本方案提供了一种监测线粒体膜电位（MMP）的新方法，尤其适用于活体监测。in vivo。该方法的关键在于寻找一种合适的基因编码电压指示剂（GEVI），通过将其N端与线粒体靶向信号融合，实现其在线粒体上的靶向定位。先前研究表明，某些GEVI（如Arclight和SomArchon）无法在线粒体中正确定位¹²。然而，动作电位加速传感器（accelerated sensor...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BamHI	Thermo	FD0054
氯化钙	Sigma	C4901
CCCP	Sigma	C2759
离心机	eppendorf	5430R
细胞培养离心机	eppendorf	5810R
CO2 细胞培养箱	ESCO	170L IR Sensor
盖玻片	Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co.KG	92100100030
牙科粘接树脂水泥	Sun medical company, LTD.	Super-Bond C&B Kit
D-葡萄糖	Sigma	G7021
DNA连接试剂盒 Ver. 2.1	Takara	6022
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	11965092
电动钻	RWD Instruments	78001
胎牛血清	Gibco	A5670701
光纤套管	RWD Instruments	R-FOC-L200C-39NA
光纤光度检测仪	Thinker	QAXK_FPS-TC-MC-LED
荧光显微镜	Olympus	IX83
玻璃移液管（用于注射）	Drummond Scientific company	3.5" Drummond # 3-000-203-G/X
HEK293t	ATCC	Cat# CRL-3216
HeLa细胞	ATCC	Cat# CCL-2
HEPES	Sigma	H3375
注射泵	Drummond Scientific company	3-000-207
异氟烷	RWD Instruments	R510-22
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	LSM980
MluI	Thermo	FD0564
NheI	Thermo	FD0974
光纤	RWD Instruments	R-FC-L-N3-200-L1
石蜡油	Sangon	B500301
PCR扩增仪	analytik jena	Biometra Tone 96G
戊巴比妥钠	Sinopharm Chemical Reagent Co.LTD	57-33-0
氯化钾	Sigma	P5405
PrimeSTAR HS DNA聚合酶	Takara	R010A
程序化微电极拉制仪	Sutter Instruments	P2000
快速自固化丙烯酸树脂	Yamahachi	V-PINK
实时荧光定量PCR扩增仪	analytik jena	qTOWER³ auto
罗丹明800	Sigma	83701
SalI	Thermo	FD0644
氯化钠	Sigma	S9888
磷酸氢二钠	Sigma	S9763
立体定位仪	RWD Instruments	E06354
兽用眼科软膏	Puralube	NA
XhoI	Thermo	FD0694