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方法文章

用于药物发现的 Clostridioides difficile 生物膜检测方法

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DOI：

10.3791/67913

⸱

2025年7月8日

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细菌病原体Clostridioides difficile的生物膜及其在疾病中的作用尚未被充分理解。最近的研究发现其可能与感染复发有关，凸显了其重要性。本文描述了一种生物膜检测方法的改进，该方法结合代谢读数，可用于针对生物膜的药物发现。

摘要

Clostridioides difficile 是一种胃肠道细菌病原体，能够在菌群失调的环境中增殖、分泌毒素并损伤肠上皮。部分 C. difficile 感染（CDI）患者在接受抗生素治疗后会出现治疗失败（15%–30%），或在接受粪便微生物群移植（FMT）后治疗失败（<10%）。因此，开发其他治疗干预手段至关重要。C. difficile 生物膜在感染复发中的作用尚不明确。然而，其他生物体中的生物膜已被证实与慢性和反复性疾病相关，提示其在复发性 CDI 中也可能发挥类似作用。我们假设 C. difficile 的生物膜是一个有价值的治疗靶点。本方案的目标是改进一种生物膜形成检测方法，用于筛选对已形成 C. difficile 生物膜具有活性的可再定位化合物。该方案优化了一种稳定且可重复的生物膜形成检测方法，将其与代谢活性检测相结合，并应用于药物发现。本方案详细描述了生物膜形成检测、生物量和代谢活性的检测读数、药物敏感性测试、可再定位化合物库的药物筛选以及代表性实验结果。

引言

Clostridioides difficile 是一种可形成芽孢的厌氧细菌病原体，能够通过产生毒素对人类胃肠道（GI）造成严重损害。C. difficile 每年导致近50万例感染病例，其中约3万人死亡（美国疾病控制与预防中心，2015年）。C. difficile 感染（CDI）的治疗给本已紧张的医疗系统带来了显著的经济负担（约48亿美元）1,2,3。高风险人群主要包括免疫功能低下者、接受过抗生素治疗者以及老年人，这些人群在美国及全球范围内均持续显著增长4,5,6,7。

C. difficile 高度依赖宿主胃肠道微生物群的状态，因此抗生素治疗是艰难梭菌感染（CDI）的关键易感因素。临床上已发现耐药性 C. difficile 分离株，这进一步加大了治疗难度8,9,10。此外，接受抗生素治疗的 CDI 患者中，有 15% 至 30% 无法在初次治疗中成功治愈5,11,12,13,14,15,16。一旦患者经历一次复发，后续复发的概率将上升至 45%–64%（即“复发递增效应”），并伴随进一步治疗失败的风险增加16,17。重要的是，大多数 CDI 复发病例是由最初引发感染的同一菌株所致18,19，这表明即使在治疗成功后，C. difficile 仍可能持续定植于宿主体内。尽管已有研究显示芽孢可在胃肠道中长期存在，并在离体（ex vivo）和小鼠模型中导致复发20，但 C. difficile 生物膜及其在疾病发生和复发中的作用仍研究不足。生物膜是由微生物形成的群落，其外覆有自身产生的胞外基质，这种结构特性使其对环境压力（如抗生素治疗和免疫应答）具有极强的耐受性21。 此外，生物膜的形成是一种重要的毒力因子22,23,24,25，在由 Staphylococcus aureus 和 Pseudomonas aeruginosa 等细菌引起的感染中，生物膜在复发和慢性病程中起关键作用26,27。最近研究表明，C. difficile 生物膜可能是复发性感染的储存库28,29,30，因此成为预防和/或治疗 CDI 复发的高价值干预靶点。

目前用于研究 C. difficile 生物膜的模型包括菌落生物膜模型31,32、微型发酵罐33、恒化器肠道模型34,35，以及使用烧瓶或孔板的液体培养系统36,37。这些模型均已在不同发育阶段和不同环境条件下提供了关于 C. difficile 生物膜的关键信息。然而，其中一些模型（如微型发酵罐、恒化器肠道模型、菌落生物膜）并不适用于药物发现研究。迄今为止，大多数药物发现相关研究主要集中在 C. difficile 的浮游生活方式上38,39,40,41。因此，本文所述方案旨在对现有的96孔板生物膜模型进行改进、标准化和验证，以建立一个可用于筛选化合物库的平台，识别能够杀灭已形成（24小时龄）C. difficile 生物膜的可再利用分子。该方案的验证通过比较实验室适应菌株（630 Δerm）与一种流行性临床分离株（UK1菌株，于2006年在英国斯托克-曼德维尔医院暴发期间分离获得42）之间的生物膜形成能力来进行。采用经典的结晶紫染色法测定生物膜生物量，并结合代谢活性检测法评估生物膜的存活率，从而定量分析生物膜的形成情况。研究发现两种菌株在生物膜形成能力方面存在显著差异，提示其潜在的临床意义。此外，该检测方法还被用于测定已形成生物膜对抗生素的敏感性谱型。最后，作为概念验证，我们筛选了疟疾药物风险投资组织（Medicines for Malaria Venture, MMV）提供的全球健康优先化合物库（Global Health Priority box）——该非营利组织致力于发现针对疟疾等被忽视疾病的新疗法——以识别对已形成的 C. difficile 生物膜具有活性的化合物。本文所述方案对一种经典的生物膜检测方法进行了改进和验证，使其可作为靶向成熟生物膜的药物筛选平台。

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方案

1. 生物膜实验的细胞准备

警告：Clostridioides difficile 是一种人类病原体，需要在 BSL-2 条件下进行操作。

注意：本研究中使用的孢子由塔夫茨大学医学院的 Carol Kumamoto 博士提供。C. difficile 孢子储备液的制备方法如前所述43,44,45。随后将孢子分装为每份 10 µL 体积至 PCR 管中，用于平板划线。实验所需的所有培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）均应在使用前 24 小时于厌氧舱内进行预还原处理。此过程通过在厌氧舱内将装有培养基或 PBS 的瓶盖略微松开来实现。

  1. 在厌氧培养箱中预先还原添加了0.1% (w/v) 牛磺胆酸钠和0.1% (w/v) L-半胱氨酸的脑心浸液琼脂平板（BHIS），建议过夜或至少3小时，以确保充分还原。将厌氧培养箱的温度设定为37 °C。
  2. 将含有10 µL芽孢的PCR管在70 °C加热20分钟。此步骤可在水浴锅或梯度PCR仪中进行。
  3. 将芽孢转移至厌氧培养箱中，轻轻吹吸5–6次混匀，取10 µL滴加于预还原的BHIS平板上。按先前所述方法进行四区划线46，并在37 °C（厌氧培养箱温度）下培养过夜。
  4. 培养24小时后应可见单个菌落。挑选一个单菌落，使用一次性接种环转移至含有10 mL BHIS液体培养基的试管中，于37 °C培养过夜（14–18小时）。
  5. 通过在厌氧培养箱内对过夜培养物进行连续稀释，测定细胞密度。
    1. 对过夜培养物进行10倍系列稀释。本方案中所用各菌株在103稀释度下可获得适宜计数的样品。但对于生长特性不同的临床分离株，可能需要对此步骤进行标准化调整。
    2. 将稀释后的样品管移出厌氧培养箱，取每种样品10 µL加入血细胞计数板，在明场显微镜下按照血细胞计数板制造商提供的说明进行计数。
    3. 根据计数结果，依照制造商提供的方法计算细胞浓度。

2. 生物膜形成

注意：虽然本方案可适用于不同规格的孔板，但已针对96孔板平台进行了优化。如果改变孔的大小，需要根据孔的表面积调整细胞浓度。

  1. 根据过夜培养物的细胞浓度，将细胞浓度调整为 1 × 107 个细胞/mL，悬浮于 BHIS 培养基中（添加 10% (w/v) L-半胱氨酸和 0.1 M 葡萄糖）。
    注意：先前研究表明，添加 0.1 M 葡萄糖可增强 C. difficile 630 Δerm 菌株的生物膜形成能力47。在本方案中，1 × 107 个细胞/mL 的起始浓度是经测试多个不同起始浓度后选定的（图 1）。即使不添加葡萄糖，仍可实现较强的生物膜形成。
  2. 将 100 µL 细胞悬液加入 96 孔微孔板（平底、组织培养处理）的各孔中，保留对照孔（仅细胞）和空白孔（仅培养基）列。在厌氧培养箱中 37 °C 培养 24 小时。
    1. 若出现培养基蒸发问题，可将生物膜板远离任何加热装置放置。或者，将生物膜板置于额外的容器中，或用可透气的 96 孔板膜覆盖。
  3. 从空白孔开始，轻柔地吸除所有孔中的培养基。此步骤可去除未黏附的细胞，仅留下生物膜。该步骤至关重要，因为仅关注存在于生物膜内的细胞。
  4. 用预还原的 PBS 轻柔洗涤生物膜两次，每次 200 µL。进行洗涤时，将 96 孔板略微倾斜，将移液器吸头贴住孔壁插入，缓慢滑至孔底但避免刮擦孔底，然后缓慢吸出液体。若孔底残留 PBS，需重复洗涤一次。此阶段可去除未黏附细胞，属正常现象。在将微孔板移出厌氧培养箱前，务必彻底去除 PBS。
  5. 此时，可将生物膜用于以下实验：生物量测定（见步骤 3）；代谢活性测定（见步骤 4）；药物敏感性及药物筛选实验（见步骤 5）。
    注意：本方案已验证适用于实验室适应性 630 Δerm 菌株和流行性 UK1 菌株。不同临床分离株或菌株可能表现出较弱的生物膜形成能力。为尽量减少生物膜破坏，可改为用 PBS 洗涤一次（而非两次），并将洗涤体积减少至 100 µL。

3. 使用结晶紫染色法测定生物膜生物量

注意：结晶紫染色基于先前描述的方案48。

  1. 在厌氧工作站中清洗生物膜后（参见步骤 2.4），取出培养板并转移至化学通风橱中。
  2. 为固定生物膜，向每孔中轻柔加入 150 µL 甲醇，盖上盖子孵育 10 分钟。
  3. 去除甲醇，并在打开盖子的情况下让各孔完全干燥，此过程需时 30 至 45 分钟。
  4. 向所有孔中加入 100 µL 0.3% 结晶紫溶液，染色 10 分钟。去除结晶紫时应小心操作，避免孔边缘和孔壁被染色，以免影响检测结果。
  5. 在打开盖子的情况下让培养板干燥，此过程需时 30 至 45 分钟。
  6. 用 200 µL 蒸馏水洗涤各孔 3 次，并让培养板完全干燥。此过程需时 30 至 45 分钟。
  7. 干燥后，使用明场显微镜对生物膜进行成像（图 2A）。虽然此步骤为可选，但可更全面地观察生物膜中的细胞。
    1. 将 96 孔板置于配备板适配器的倒置明场显微镜上，为每种测试菌株选择具有代表性的孔。
    2. 以所需放大倍数对每个孔进行成像。本方案中展示的图像采用 40 倍放大倍数拍摄。
  8. 获取所需图像后，将培养板重新转移至化学通风橱中进行脱色处理。
  9. 为脱除生物膜染色，向每孔加入 150 µL 33% 乙酸溶液，并在中等速度摇床上振荡 10 分钟。
  10. 从每孔中取出 90 µL 溶液转移至新的 96 孔平底板中，使用酶标仪在 595 nm 波长处读取吸光度（图 2B）。

4. 使用代谢染料 PrestoBlue 测定生物膜活性

  1. 按照检测试剂盒的说明书进行代谢活性的测定，并进行关键性修改：在制备生物膜样品前，先将酶标仪预热至 37 °C。建议使用具备荧光检测功能的酶标仪。
    注意：也可选择在 OD600 处读取代谢活性；然而，我们发现该方法在本实验体系中灵敏度不足。建议使用者参考试剂盒说明书，并根据需要进行标准化优化。
  2. 如上文所述（见步骤 2.4），在厌氧工作站内用 PBS 清洗生物膜后，将培养板从工作站中取出。
  3. 同时，从工作站中取出 9 mL 预还原 BHIS 培养基（添加 10% (w/v) L-半胱氨酸和 0.1 M 葡萄糖）。
  4. 迅速将 1 mL PrestoBlue 试剂加入 9 mL 预还原 BHIS 培养基中并涡旋混匀。切勿对试剂进行预还原处理，以免影响试剂的颜色（见讨论部分）。
  5. 向每孔中加入 100 µL BHIS-PrestoBlue 混合液。将培养板放入酶标仪中，设置如下参数：温度 37 °C，检测模式为动力学检测；总检测时间为 30 min；读数间隔为每 2 min 一次；荧光强度设定依据所用酶标仪型号而定。本方案中所述检测使用激发/发射波长分别为 560 nm / 590 nm。
  6. 检测完成后，弃去培养板。
  7. 获得荧光值后，使用空白孔（仅含培养基）对所有样品孔的背景信号进行校正。随后，将各化合物处理组的生物膜孔荧光值除以未处理对照组（100% 生物膜）孔的荧光值，以计算相对代谢活性。

5. 向生物膜中添加药物

注意：以下所述的实验方案可根据药物敏感性检测和固定浓度药物筛选进行调整。对于下述两种方法，均推荐使用 PrestoBlue 检测法。

  1. 不同抗生素最小抑菌浓度（MIC）的测定
    ​注意：生物膜处理周期为48小时，增加了污染的可能性。必须优先处理空白孔，并严格遵守无菌操作规程。本方案中MIC测定的起始抗生素浓度参考了文献中报道的其他艰难梭菌（C. difficile）菌株的MIC值以及剂量反应试验结果。该方法在处理临床分离株时，有助于确定合适的起始抗生素浓度。
    1. 在厌氧舱内，按照上述方法（见步骤2.4）用PBS清洗成熟的（培养24小时）生物膜。
    2. 向除对照组（仅含细胞）和空白组（仅含培养基）列以外的每孔中加入200 µL预还原的BHIS培养基（添加10% (w/v) L-半胱氨酸和0.1 M葡萄糖），其中含有两倍梯度稀释的待测抗生素。
    3. 继续孵育24小时。本研究中使用万古霉素（起始浓度200 µg/mL）、甲硝唑（起始浓度16 µg/mL）和非达霉素（起始浓度4 µg/mL）来验证该检测方法。MIC值 见表1。
    4. 为防止培养板干燥，应避免将其放置在厌氧舱的加热装置附近，或使用透气膜覆盖。
      注意：也可在培养板外周孔中加入300 µL预还原的PBS或培养基形成液封。
    5. 药物孵育24小时后，移除培养基，并用PBS轻柔清洗生物膜一次。随后采用结晶紫染色法或PrestoBlue法处理生物膜。
  2. 药物文库筛选
    1. 在厌氧舱内，按照上述方法（见步骤2.4）用PBS清洗成熟的（培养24小时）生物膜。
    2. 向除对照组（不含抗生素的培养基中的细胞）和空白组（不含抗生素的培养基）列以外的每孔中加入200 µL含有固定浓度药物文库化合物的培养基。继续孵育24小时。为防止培养板干燥，应避免将其放置在厌氧舱的加热装置附近。
    3. 药物孵育24小时后，移除培养基，并用PBS轻柔清洗生物膜一次。随后采用结晶紫染色法或代谢活性检测法处理生物膜。

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结果

上述方案的目的是调整并验证96孔板生物膜形成模型，将其作为药物筛选平台，用于鉴定对C. difficile已形成生物膜具有活性的可再利用化合物。研究测定了不同细胞密度（104、105、106和107 个细胞/mL）对生物膜形成的影响，并通过结晶紫染色法对生物膜形成量进行定量分析，方法如前所述48。研究结果表明，C. difficile 630 Δerm（实验室适应菌株）在所有起始细胞密度下的生物膜形成能力相似。因此，本研究选用1 × 107 个细胞/mL的细胞密度。

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讨论

C. difficile 生物膜的形成及其在疾病中的作用目前尚不明确。近期研究提示，生物膜可能在疾病复发中发挥作用28,34。生物膜的形成是一种重要的毒力因子22,23,24,25，在细菌感染（如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa引起的感染）中，生物膜是导致感染反复发作和慢性表现的关键因素26,27，提示这一机制在艰难梭菌感染（CDI）中也可能存在。因此，靶向C. difficile生物膜可能成为防治C...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

J.A.R. 设计了研究方案和实验流程，并撰写了稿件。A.S. 和 P.Z. 进行了实验，并协助优化了实验流程。本研究得到了德克萨斯大学圣安东尼奥分校（UTSA）为 J.A.R. 提供的启动资金支持，A.S. 得到了 UTSA MARC 项目（T34GM145507）的支持。作者感谢瑞士疟疾药物风险投资联盟（Medicines for Malaria Venture, MMV）提供了全球健康优先化合物库（Global Health Priority Box library）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸 SAF-CT ACS 500ML菲舍尔科技A38S500
细菌培养用琼脂 GR 1KG菲舍尔科技AC443570010
BioTek Synergy H1 酶标仪菲舍尔科技BTH1MG
酵母提取物 瓶装 500G菲舍尔科技DF0127179
脑心浸出液肉汤菲舍尔科技CM1135R
结晶紫 USP 级 100GVWR97061-850用于生物膜染色以进行生物量检测
CytoOne 96孔细胞培养板，平底，透明，单独包装带盖，每箱50片USA ScientificCC7682-7596
D-(+)-葡萄糖，无水菲舍尔科技50712744
分子生物学用二甲基亚砜（DMSO）Millipore SigmaD8418-250ML
非达霉素 250MG菲舍尔科技AC468312500
L-半胱氨酸 ≥98% 1KG菲舍尔科技AAA104350B用于艰难梭菌培养基
甲醇 99.8% ACROSEAL 1LT菲舍尔科技AC364390010
甲硝唑，99% 5GR菲舍尔科技AC210340050
磷酸盐缓冲液（PBS）10X菲舍尔科技BP3991
PrestoBlue 细胞活力检测试剂菲舍尔科技A13262
SILVERSEAL 不透明密封膜 100/箱菲舍尔科技7000379用于药物母板和子板储存前的密封
牛磺胆酸钠 100MG VWR100291-598
万古霉素菲舍尔科技BP29581

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