用于药物发现的 Clostridioides difficile 生物膜检测方法

Alec J. Solis; Paola Zucchi; Jesús A. Romo

doi:10.3791/67913

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方法文章

用于药物发现的 Clostridioides difficile 生物膜检测方法

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DOI：

10.3791/67913

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2025年7月8日

Alec J. Solis^*¹ , Paola Zucchi^*¹ , Jesús A. Romo¹

¹Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细菌病原体Clostridioides difficile的生物膜及其在疾病中的作用尚未被充分理解。最近的研究发现其可能与感染复发有关，凸显了其重要性。本文描述了一种生物膜检测方法的改进，该方法结合代谢读数，可用于针对生物膜的药物发现。

摘要

Clostridioides difficile 是一种胃肠道细菌病原体，能够在菌群失调的环境中增殖、分泌毒素并损伤肠上皮。部分 C. difficile 感染（CDI）患者在接受抗生素治疗后会出现治疗失败（15%–30%），或在接受粪便微生物群移植（FMT）后治疗失败（<10%）。因此，开发其他治疗干预手段至关重要。C. difficile 生物膜在感染复发中的作用尚不明确。然而，其他生物体中的生物膜已被证实与慢性和反复性疾病相关，提示其在复发性 CDI 中也可能发挥类似作用。我们假设 C. difficile 的生物膜是一个有价值的治疗靶点。本方案的目标是改进一种生物膜形成检测方法，用于筛选对已形成 C. difficile 生物膜具有活性的可再定位化合物。该方案优化了一种稳定且可重复的生物膜形成检测方法，将其与代谢活性检测相结合，并应用于药物发现。本方案详细描述了生物膜形成检测、生物量和代谢活性的检测读数、药物敏感性测试、可再定位化合物库的药物筛选以及代表性实验结果。

引言

Clostridioides difficile 是一种可形成芽孢的厌氧细菌病原体，能够通过产生毒素对人类胃肠道（GI）造成严重损害。C. difficile 每年导致近50万例感染病例，其中约3万人死亡（美国疾病控制与预防中心，2015年）。C. difficile 感染（CDI）的治疗给本已紧张的医疗系统带来了显著的经济负担（约48亿美元）¹^,²^,³。高风险人群主要包括免疫功能低下者、接受过抗生素治疗者以及老年人，这些人群在美国及全球范围内均持续显著增长⁴^,⁵^,⁶^,⁷。

C. difficile 高度依赖宿主胃肠道微生物群的状态，因此抗生素治疗是艰难梭菌感染（CDI）的关键易感因素。临床上已发现耐药性 C. difficile 分离株，这进一步加大了治疗难度⁸^,

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方案

1. 生物膜实验的细胞准备

警告：Clostridioides difficile 是一种人类病原体，需要在 BSL-2 条件下进行操作。

注意：本研究中使用的孢子由塔夫茨大学医学院的 Carol Kumamoto 博士提供。C. difficile 孢子储备液的制备方法如前所述⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵。随后将孢子分装为每份 10 µL 体积至 PCR 管中，用于平板划线。实验所需的所有培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）均应在使用前 24 小时于厌氧舱内进行预还原处理。此过程通过在厌氧舱内将装有培养基或 PBS 的瓶盖略微松开来实现。

在厌氧培养箱中预先还原添加了0.1% (w/v) 牛磺胆酸钠和0.1% (w/v) L-半胱氨酸的脑心浸液琼脂平板（BHIS），建议过夜或至少3小时，以确保充分还原。将厌氧培养箱的温度设定为37 °C。
将含有10 µL芽孢的PCR管在70 °C加热20分钟。此步骤可在水浴锅或梯度PCR仪中进行。
将芽孢转移至厌氧培养箱中，轻轻吹吸5–6次混匀，取10 µL滴加于预还原的BHIS平板上....

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结果

上述方案的目的是调整并验证96孔板生物膜形成模型，将其作为药物筛选平台，用于鉴定对C. difficile已形成生物膜具有活性的可再利用化合物。研究测定了不同细胞密度（10⁴、10⁵、10⁶和10⁷ 个细胞/mL）对生物膜形成的影响，并通过结晶紫染色法对生物膜形成量进行定量分析，方法如前所述⁴⁸。研究结果表明，C. difficile 630 Δerm（实验室适应菌株）在所有起始细胞密度下的生物膜形成能力相似。因此，本研究选用1 × 10⁷ 个细胞/mL的细胞密度。

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讨论

C. difficile 生物膜的形成及其在疾病中的作用目前尚不明确。近期研究提示，生物膜可能在疾病复发中发挥作用²⁸^,³⁴。生物膜的形成是一种重要的毒力因子²²^,²³^,²⁴^,²⁵，在细菌感染（如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa引起的感染）中，生物膜是导致感染反复发作和慢性表现的关键因素²⁶^,²⁷，提示这一机制在艰难梭菌感染（CDI）中也可能存在。因此，靶向C. difficile生物膜可能成为防治C.......

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

J.A.R. 设计了研究方案和实验流程，并撰写了稿件。A.S. 和 P.Z. 进行了实验，并协助优化了实验流程。本研究得到了德克萨斯大学圣安东尼奥分校（UTSA）为 J.A.R. 提供的启动资金支持，A.S. 得到了 UTSA MARC 项目（T34GM145507）的支持。作者感谢瑞士疟疾药物风险投资联盟（Medicines for Malaria Venture, MMV）提供了全球健康优先化合物库（Global Health Priority Box library）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
乙酸 SAF-CT ACS 500ML	菲舍尔科技	A38S500
细菌培养用琼脂 GR 1KG	菲舍尔科技	AC443570010
BioTek Synergy H1 酶标仪	菲舍尔科技	BTH1MG
酵母提取物瓶装 500G	菲舍尔科技	DF0127179
脑心浸出液肉汤	菲舍尔科技	CM1135R
结晶紫 USP 级 100G	VWR	97061-850	用于生物膜染色以进行生物量检测
CytoOne 96孔细胞培养板，平底，透明，单独包装带盖，每箱50片	USA Scientific	CC7682-7596
D-(+)-葡萄糖，无水	菲舍尔科技	50712744
分子生物学用二甲基亚砜（DMSO）	Millipore Sigma	D8418-250ML
非达霉素 250MG	菲舍尔科技	AC468312500
L-半胱氨酸 ≥98% 1KG	菲舍尔科技	AAA104350B	用于艰难梭菌培养基
甲醇 99.8% ACROSEAL 1LT	菲舍尔科技	AC364390010
甲硝唑，99% 5GR	菲舍尔科技	AC210340050
磷酸盐缓冲液（PBS）10X	菲舍尔科技	BP3991
PrestoBlue 细胞活力检测试剂	菲舍尔科技	A13262
SILVERSEAL 不透明密封膜 100/箱	菲舍尔科技	7000379	用于药物母板和子板储存前的密封
牛磺胆酸钠 100MG	VWR	100291-598
万古霉素	菲舍尔科技	BP29581

参考文献

Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015)....

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