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方法文章

使用可诱导FRET生物传感器检测线粒体相关内质网膜紧密性

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DOI：

10.3791/67914

⸱

2026年8月7日

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

本文内容

摘要

我们描述了一种用于测量靶向内质网（CFP标记）或线粒体（YFP标记）的可诱导FRET生物传感器的FRET值的方法。 体外 用于评估影响Aβ生成的线粒体相关内质网膜（MAMs）的紧密程度，该方法可用于筛选具有调节MAM功能潜力的合成或天然化合物，作为阿尔茨海默病（AD）治疗药物的初步筛选工具。

摘要

多项研究已表明，内质网-线粒体接触（即线粒体相关膜，MAMs）的数量、长度以及间隙宽度（厚度）会影响其生物学功能。我们之前的研究显示，在阿尔茨海默病（AD）的三维（3D）神经模型中，稳定间隙宽度约为7 nm的紧密型MAMs会导致淀粉样蛋白β（Aβ）水平升高，而间隙宽度约为40 nm的松散型MAMs则可减少Aβ的产生。为了研究不同间隙宽度MAMs的作用，研究人员开发了靶向内质网和线粒体的FRET（Förster共振能量转移）生物传感器——分别为ER-CFP（青色荧光蛋白）和Mito-YFP（黄色荧光蛋白），用于量化紧密型MAMs（<10 nm间隙宽度），并与松散型或非MAMs进行对比。当供体荧光基团（CFP）与受体荧光基团（YFP）之间的距离在10 nm以内时，即可发生FRET，因此该系统适用于评估MAM的接近程度。本实验方案详细阐述了利用光谱比率FRET法来测定紧密型MAM形成的程度。

引言

线粒体相关内质网接触点（MERCs）可通过生物化学方法分离为线粒体相关内质网膜（MAMs），其与包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病相关1。近期提出的"MAM假说"认为，MAMs在β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成过程中发挥核心作用，从而启动AD的致病级联反应。该级联反应包括神经原纤维缠结（NFTs）的形成、钙稳态失调以及神经炎症2。MAMs由富含胆固醇、类似脂筏的微结构域组成，位于内质网和线粒体外膜（OMM），并通过特定的连接蛋白相互连接，这些连接蛋白赋予MAMs结构和功能上的多样性3。内质网与线粒体接触点的稳定化影响多种细胞过程，包括内质网钙信号传导和细胞凋亡4,5。据估计，5%–20%的线粒体与内质网形成物理接触以构成MAMs6。多项研究表明，MAM位点处内质网与线粒体之间的数量、长度以及间隙宽度（厚度）是决定其功能作用的重要因素。冷冻电子显微镜及对小鼠肝脏的活体分析显示，肝细胞的代谢状态可调节MAMs的厚度（范围为14 nm至20 nm）和长度（范围为145 nm至270 nm）7。

MAMs 还逐渐成为多种疾病（包括癌症和代谢性疾病）的潜在治疗靶点。MAM 的厚度或间隙宽度可调控细胞存活。研究人员设计了两种组成型 MAM 稳定剂 MAM 1X 和 MAM 9X，分别用于稳定紧密型 MAM（间隙宽度为 6 nm ± 1 nm）和松散型 MAM（间隙宽度为 24 nm ± 3 nm）。在一种新型的阿尔茨海默病 3D 神经元培养模型中，研究发现稳定紧密型 MAM 会显著增加 Aβ 的生成，而稳定松散型 MAM 则无此效应。8因此，将紧密型线粒体-内质网接触（MAM）转化为松散型MAM可能有助于减轻淀粉样蛋白病理。由于MAM稳定性的结构和功能复杂性，以及缺乏对MAM稳定程度的精确定量分析，使得以MAM为靶点进行药物研发具有挑战性。一种基于活细胞成像和显微分轨技术（kymography）的新方法用于分析与内质网结合的线粒体在轴突中的运动速度，结果表明，线粒体的轴突运动速度可作为定量评估MAM稳定性的指标，因为与游离线粒体相比，与内质网形成更紧密接触的线粒体其轴突运动速度显著降低。8,9. 在表达 hAPP 的 Neuro 2A（N2A）细胞中使用可诱导的 MAM 稳定剂APP) 细胞8我们发现，以剂量依赖的方式缩小MAM间隙宽度会增加Aβ的生成8可诱导的MAM稳定剂是表达质粒，编码融合了雷帕霉素可诱导的FK506雷帕霉素结合（FRB）或12-kDa FK506结合蛋白（FKBP）结构域的生物传感器，其中生物传感器分别带有靶向内质网的CFP（青色荧光蛋白）表位标签和靶向线粒体的YFP（黄色荧光蛋白）表位标签。这些生物传感器分别命名为ER-CFP和Mito-YFP。CFP是一种供体荧光素，当其与受体荧光素YFP之间的距离适当时，可将能量转移至YFP >10 nm。细胞（N2A）APP) 表达可诱导生物传感器的细胞在雷帕霉素处理后Aβ生成增加8，表明增加紧密的线粒体相关内质网膜（MAM）会促进Aβ的生成。这些方法将有助于筛选能够调节MAM的小分子化合物，并确定其有效浓度，以实现对最佳水平紧密MAM的稳定，从而逆转致病性（"Aβ 增加"）到治疗性（"降低 Aβ"在不完全破坏对细胞存活至关重要的内质网与线粒体接触的情况下，分离MAMs。

实验模型
本研究使用了稳定表达APP751的Neuro2A（N2A）细胞（N2AAPP）。与未处理的N2A细胞相比，这些细胞可在条件培养基（CM）中释放可检测水平的Aβ。N2AAPP细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酸以及200 µg/mL G418的DMEM培养基中，具体方法如前所述10。

表达质粒
通过将哺乳动物A-激酶锚定蛋白1 [AKAP1(34-63)] 的YFP（黄色荧光蛋白）标记的线粒体靶向序列与磷脂酰肌醇-3-磷酸酶 Sac1磷酸酶 [Sac1(521-587)] 的CFP（青色荧光蛋白）标记的内质网靶向序列融合，并插入编码EGRGSLLTCGDVEENPGP肽序列的自剪切Tav2A序列，构建出一种表达质粒，命名为pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8。该Tav2A融合表达质粒两侧还分别含有编码FK506雷帕霉素结合（FRB）结构域[EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] 或12-kDa FK506结合蛋白（FKBP）结构域（MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ）的核苷酸序列。构建的融合质粒FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP，本文简称为MAM-Tav2A，可实现FRB-YFP-AKAP1(34-63)与Sac1(521-587)-CFP-FKBP的等摩尔表达，用于比率型FRET分析。其中，Sac1(521-587)-CFP-FKBP（记为ER-CFP）为供体荧光蛋白，而Mito-YFP-FRB（记为Mito-YFP）为受体荧光蛋白，当两者间距约为10 nm时可产生FRET8。因此，基于FRET的生物传感器可检测紧密连接的线粒体相关内质网膜（MAM）结构（间隙宽度为6–10 nm）。引入FRB和FKBP结构域后，可通过剂量依赖性地添加雷帕霉素诱导MAM间隙宽度缩小，并通过FRET信号增强的程度进行定量测定8。

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方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 转染

  1. 用 MAM-Tav2A 表达质粒转染 N2AAPP 细胞（14–18 小时）。
    1. 实验开始前，将 1 × 106 N2AAPP细胞接种于含玻璃盖玻片的 6 孔板中，每孔一孔，用生长培养基培养 12–16 小时。
    2. 使用 Lipofectamine 转染试剂，按照生产商说明书，转染 1–3 μg MAM-Tav2A 质粒（补充文件 1）。
    3. 转染后 12–16 小时，进行药物处理。
      注意：始终设置仅表达供体（ER-CFP）或受体（Mito-YFP）的表达质粒转染细胞，作为 FRET 背景对照。

2. 药物处理

  1. 用雷帕霉素（Rapa）或雷帕类似物（Log）处理表达 MAM-Tav2A 的 N2AAPP 细胞（3–6 小时）。
    1. 处理前，配制 Rapa 和 Log 的储存液（10 mM）。
    2. 更换含 0 nM、100 nM 或 250 nM Rapa 或 Log 的新鲜培养基。
    3. 处理 3 小时后，加入 3.3% 多聚甲醛（PFA）固定细胞。
    4. 在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭剂，制备用于荧光共聚焦显微镜观察的样品。
    5. 将盖玻片覆盖在液滴上，并用镊子轻轻按压。
      注意：玻璃盖玻片易碎，操作需谨慎。可选用玻璃底培养皿作为替代方案，但其主要缺点是无法使用抗荧光淬灭剂，这会导致荧光团淬灭，使成像困难。切勿使用含 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗荧光淬灭剂，因其蓝色荧光会干扰 CFP 与 YFP 之间的荧光共振能量转移（FRET）。

3. 荧光共振能量转移（FRET）的共聚焦显微镜检测

  1. 将载玻片置于倒置显微镜下，调节显微镜焦距，直至细胞可见。
  2. 使用440 nm激光激发荧光团，并通过468–503 nm发射波长采集供体CFP（FKBP-CFP-ER）的图像，或通过525–565 nm发射波长采集受体YFP（FRB-YFP-Mito）的图像。
  3. 使用内置荧光滤光片调节信号强度，直至背景信号消失（应接近纯黑色）。
    注意：采用共聚焦显微镜结合NIS Element AR软件采集荧光图像，放大倍数为60倍，分辨率为512像素。
  4. 将图像保存为.nds文件。
  5. 进行光谱比率FRET分析。

4. 比值型FRET分析（6 - 12 小时）

注意：使用共聚焦显微镜检测供体ER-CFP（468-503 nm）和受体Mito-YFP（525-565 nm）的荧光发射。采用ImageJ软件在扣除背景后量化平均像素荧光强度。计算YFP与CFP发射强度的比值，并将其作为光谱FRET分析的读数。

  1. 打开 Image J (Fiji)。
  2. 将 .nds 文件直接拖入 Image J，或点击 文件 -> 打开，然后选择图像。
  3. 在接下来的界面中，勾选拆分通道选项。
  4. 点击 C = 0 面板。
  5. 点击 分析 -> 测量。
    注意：记录下平均值，用于后续计算。
  6. 点击 处理 -> 数学 -> 减去。
  7. 输入平均值。
  8. 对 C = 1 面板重复第 4 步操作。
  9. 点击自由手绘选择工具。
  10. 圈选感兴趣的细胞，然后按 Ctrl+T 将其记录到 ROI 中。
  11. 在 ROI 窗口底部点击显示全部，以查看已选择的内容。
  12. 选中所有已选细胞，点击测量，并将这些数值记录到 Excel 表格中。
  13. 点击 C = 1 面板，然后点击显示全部。
  14. 选中所有细胞，再次点击测量，并将这些数值记录到 Excel 表格的另一列中。
  15. 在 Excel 中创建一个函数，将供体信号值除以受体信号值（C0/C1），即为 FRET 比值。

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结果

对表达 MAM-Tav2A 的 FACS 富集 N2AAPP 细胞进行的比率型 FRET 分析显示，经雷帕霉素处理后，Aβ40 水平呈剂量依赖性升高8。雷帕霉素通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路发挥作用，进而下调小胶质细胞中髓系细胞表达触发受体 2（TREM2）的表达，导致阿尔茨海默病 5XFAD 小鼠模型中 Aβ 斑块清除减少11。雷帕霉素类似物 AP21967，通常称为雷帕霉素类似物（rapalog，Log），对 mTOR 的亲和力较低，因此对细胞相对无毒。然而，由于在 FRB 结构域中引入了补偿性空腔形成突变（K2095P），该类似物仍能以与雷帕霉素相同的亲和力结合 FRB 结构域12。

Rapa 和 Log 处理增加了 FRET 比值（

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讨论

线粒体相关内质网膜（MAMs）的调控是一个新兴的研究领域，可能对癌症、代谢性疾病和神经退行性疾病等多种疾病具有重要意义13。许多药物，包括动力蛋白拮抗剂LDC-3/Dynarrestin、降糖药二甲双胍以及抗癌剂莱菔硫烷，均可破坏MAMs结构，目前正处于癌症和代谢性疾病的临床前及临床试验阶段。这些药物通过调节MAM锚定蛋白（如PTPIP51、VAPB、VDAC1、PACS2、MFN2、VDAC1和IP3R3）之间的相互作用，来调控内质网与线粒体之间的接触或MAM接触宽度14,15,16,17,18,19,20。σ-1受体（S1R）...

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致谢

我们衷心感谢马萨诸塞州总医院（MGH）教授 Rudolph E. Tanzi 博士对本文手稿提出的深刻见解。感谢 MGH 助理教授 Masato Maesako 博士分享其在荧光寿命成像检测（FLIM assays）方面的专业知识。感谢费城托马斯杰斐逊大学教授 Gyorgy Hajnoczky 博士慷慨提供编码 ER-CFP 或 Mito-YFP 的表达质粒。本研究由 Cure Alzheimer's Fund 基金会资助，受资助者为 RB。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BSA弗舍科学公司501781532
共聚焦显微镜 奥林巴斯 FV3000RS（日本东京）N/A
含GlutaMAX补充剂的DMEM培养基吉布科/赛默飞世尔科技公司10564011
EDTA  生命技术公司41116134
Falcon 6孔板 VWR国际公司41122107
GAPDH多克隆抗体赛默飞世尔科技公司PA1-988
明胶 VWR国际公司9000-70-8
遗传霉素（G418硫酸盐）吉布科/赛默飞世尔科技公司10131035
GFP单克隆抗体英潍捷基公司MA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9，版本9.5.0N/A
肝素西格玛-奥德里奇公司 H0200000
ImageJ软件 ImageJ 1.53aN/A
倒置共聚焦显微镜 尼康（C2 Eclipse Ti2）N/A
Lipofectamine2000英潍捷基公司11668027
MS Excel  微软Excel，版本2302N/A
NaCl  弗舍科学公司7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris凝胶  英潍捷基公司NP0321BOX
青霉素/链霉素/两性霉素B 隆扎公司 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCl，pH 7.6  波士顿生物制品公司42000000
Triton X-100  西格玛-奥德里奇公司T8787
胰蛋白酶-EDTA吉布科/赛默飞世尔科技公司25200056
Tween 20弗舍科学公司501657287

参考文献

  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

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