单层及三维条件下人肾小管上皮细胞原代培养体系的建立

摘要

本文介绍了从肾皮质获取人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养物的实验方案，用于在细胞外基质上建立单层和三维培养体系（3D-HRTEC）。

摘要

人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养物来源于阿根廷布宜诺斯艾利斯市佩德罗·德·埃利萨尔德儿科综合医院小儿肾脏病科因临床指征接受肾切除术的儿科患者所切除的肾脏组织。在肉眼观察下，将外观正常的肾皮质从肾髓质中分离，并切割成小块。皮质组织块随后在添加了0.1% I型胶原酶的Hank's溶液中进行消化，并通过孔径为70 µm的滤网过滤，以分离肾小管与肾小球。肾小管再经胶原酶二次消化以获得上皮细胞。最后终止酶消化过程，并将上皮细胞接种于含补充成分的RPMI 1640培养基中，在37 °C、5% CO₂条件下培养至细胞融合。HRTEC细胞可在96孔板、置于24孔板中的玻璃盖玻片或胶原蛋白包被的细胞培养插件上以单层形式培养。此外，将HRTEC细胞接种于基底膜（BM）基质上可获得三维人肾小管上皮细胞（3D-HRTEC）培养模型。在此过程中可观察细胞聚集及管状结构的形成。多年来，我们一直使用HRTEC原代培养模型研究志贺毒素在儿童肾脏中引起的细胞毒性作用，该毒性可导致溶血性尿毒综合征（HUS）相关的病理生理改变。HRTEC和3D-HRTEC培养模型均可用于评估不同毒素、合成药物、生物因子、激素等对人肾近端小管上皮的特异性影响。

引言

在本研究团队中，采用单层培养和三维培养（3D-HRTEC）条件建立的人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养模型，用于研究儿童肾脏中志贺毒素2型（Stx2）在感染产志贺毒素大肠杆菌后所引发的细胞毒性作用 大肠杆菌 (STEC)

Stx1 和 Stx2（Stxs）是产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的主要毒力因子，可导致腹泻后溶血性尿毒综合征（HUS）¹。HUS 是一种全身性并发症，约影响 5–10% 的 STEC 感染儿童，表现为溶血性贫血、血小板减少和儿童急性肾损伤（AKI），需进行支持性治疗²。在阿根廷，STEC-HUS 是一种地方性疾病，5 岁以下儿童的年发病率为每 10 万人中 6.52 例（全球最高），是急性肾损伤的主要病因之一³。尽管病死率低于 4%³，但约 50% 的患者会出现肾脏后遗症，是我国儿童肾移植的第二大常见原因^4,5。

在志贺毒素2（Stx2）被细胞内化并发挥其细胞毒性作用之前，会特异性地结合于靶器官细胞表面表达的糖脂类 globotriaosylceramide（Gb3）受体

方案

儿童佩德罗·德·埃利萨尔德综合医院伦理委员会批准了使用人类肾组织建立原代细胞培养物用于科研目的。已从儿童的直系亲属或监护人处获得书面知情同意，授权将肾脏样本用于科研。

注意：人肾小管上皮细胞（HRTEC）的原代培养物来源于在阿根廷布宜诺斯艾利斯的佩德罗·德·埃利萨尔德儿科综合医院接受肾切除术的儿科患者，手术指征为泌尿系统疾病矫正或肿瘤切除。

1. 人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养的建立

注意：皮质肾组织碎片取自在医院接受肾切除术的儿科患者所移除的肾脏。人肾小管上皮细胞（HRTEC）的原代培养按照先前描述的方法进行¹¹。

该方案在以下步骤中进行描述：

1. 将肾组织碎片置于无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）或汉克斯平衡盐溶液（Hanks）中冷藏，直至在实验室进行处理。
2. 用镊子剥离肾包膜，分离肾皮质与髓质，并将其切成约1 mm大小的小块。
3. 进行消化时，将肾组织碎片放入不含Ca²⁺和Mg²⁺的无菌Hanks溶液中，加入0.1% I型胶原酶。
   1. 在37 °C条件下振荡孵育肾组织碎片30分钟。
   ....

结果

汇合的HRTEC原代培养细胞在光学显微镜下显示出相似的形态（图1）。如我们先前发表的研究所述，通过免疫荧光使用针对水通道蛋白1（AQP1）和血小板内皮细胞黏附分子CD31（PECAM CD31）的抗体对细胞进行表征^9,12,13。免疫荧光结果显示，超过90%的HRTEC对AQP1呈阳性反应，表明其来源于人肾近端小管。此外，所有细胞均不表达内皮细胞标志物抗体PECAM CD31⁹。

如图2所示，HRTEC可形成管状结构（成管作用），其形态与人类肾脏中的原始肾小管具有相似性。在基底膜基质上接种后约4-10小时，HRTEC发生迁移并形成多细胞索状结构；接种后1天左右，出现细胞聚集体，并逐渐发育为管状结构。培养3-8天后，这些三维管状结构持.......

讨论

原代培养应在肾切除术当天进行。为确保细胞的形态发生稳定性，HRTEC 原代培养物可在第1至第5代次之间使用。第五代以后，细胞开始出现形态改变，呈现成纤维细胞样外观或空泡增多，并可能进入静止状态。

如果使用较大的肾组织片段，消化后细胞裂解所释放的DNA可能会干扰洗涤过程。此时，建议使用更大体积的消化液和洗涤液。此外，还可向消化液中添加0.04%的DNase IV⁶。

之前通过水通道蛋白1（AQP1）的免疫荧光染色对人肾小管上皮细胞（HRTEC）原代培养物进行了表征，结果显示超过90%的细胞AQP1呈阳性，表明HRTEC原代培养物具有肾近端小管来源¹³。此外，所有细胞均未被内皮细胞抗体PECAM CD31染色⁹。AQP1定位于人肾近端小管上皮细胞的顶膜和基底外侧膜。

使用已建立的细胞系可能替代原代培养；然而，已建立的细胞系可能会改变许.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ⅰ型胶原酶	Sigma Merck, St Louis, MO, USA	637958
内皮细胞生长补充剂	Sigma Merck, St Louis, MO, USA	E2759
Matrigel 基底膜基质	BD Biosciences, USA; Sigma Merck, St Louis, MO, USA	356234
70 μm 孔径筛网滤器	BD Bioscience, MA, USA	css010070
含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基	Sigma Merck, St Louis, MO, USA	R8758-500ml
不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hanks’ 平衡盐溶液	Gibco Invitrogen, NY, USA	14175046
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma Merck, St Louis, MO, USA	T4049