测量葡萄糖类似物6-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-6-脱氧葡萄糖在完整小鼠神经视网膜中的摄取 关键词：葡萄糖摄取, 6-NBDG, 神经视网膜, 小鼠, 荧光成像, 代谢活性, 视网膜组织, 活体检测

摘要

视网膜中的多种细胞类型，包括内皮细胞、神经元和胶质细胞，均表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs），以介导葡萄糖进入细胞。使用 离体 小鼠神经视网膜与荧光葡萄糖类似物6-NBDG，我们描述了一种相对快速且经济的方法，用于测量整个小鼠视网膜的葡萄糖摄取。

摘要

视网膜是一种高代谢活性的组织，包含多种细胞类型，需要葡萄糖及其衍生物以生成ATP形式的能量。视网膜细胞（包括内皮细胞、神经元、光感受器和胶质细胞）表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs；例如GLUT1-4），以介导葡萄糖的摄取用于能量生成。其中GLUT1是视网膜中表达最丰富的葡萄糖转运蛋白。本方案使研究人员能够测定小鼠神经视网膜中的葡萄糖摄取能力 离体 使用荧光葡萄糖类似物 6-(N(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基-6-脱氧葡萄糖（6-NBDG）。视网膜分离后，可通过酶标仪进行荧光终点检测，快速测定整个视网膜中6-NBDG的总量。为保证实验一致性，建议将结果归一化至总蛋白水平。尽管6-NBDG对GLUT1具有高度特异性，但在GLUT1抑制剂BAY-876存在的情况下仍可检测到该类似物的摄取。因此，该检测方法提供了一种相对快速且经济的葡萄糖摄取测量手段。 离体 在小鼠全神经视网膜中，该过程部分由GLUT1介导。

引言

葡萄糖是神经视网膜的一种必需代谢物，用于支持高通量的糖酵解和线粒体呼吸，以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生能量¹。由于葡萄糖是首选的能量底物，许多视网膜细胞表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs），以促进从血管系统及周围组织中摄取葡萄糖²。GLUTs是一类内在膜糖蛋白家族，负责将葡萄糖转运至哺乳动物细胞内³。葡萄糖转运蛋白-1（GLUT1）是视网膜中的主要葡萄糖转运蛋白，在整个视网膜各层均有表达⁴，并在构成血-视网膜屏障（BRB）的毛细血管内皮细胞中表达⁵。有趣的是，在包括阿尔茨海默病在内的中枢神经系统（CNS）神经退行性疾病中，人类患者在出现脑萎缩和神经元功能障碍之前，即已观察到GLUT1蛋白水平下降以及葡萄糖摄取减少^6,7。在眼高压大鼠模型中，毛细血管中的GLUT1水平也有所降低⁸。在人类视网膜色素变性动物模型中，葡萄糖向视网膜外层转运减少与感光细胞丢失相关，也可能在青光眼等视网膜神经退行性病变中发挥一定作用。因此，深入了解神经视网膜中葡萄糖的转运机制，对于阐明其在视网膜神经退行性病变中的作用至关重要。

方案

本文所述所有方法均已获得范德比尔特大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 检测前准备

注意：由于该实验方案对时间敏感，必须在检测当天、开始检测前立即进行准备工作。

1. 实验前的一般准备工作
   注意：6-NBDG 对光敏感，应避光保存。所有含 6-NBDG 的溶液均需用铝箔包裹。
   1. 将 5 mM 的 6-NBDG 溶于 50% DMSO/1×PBS 中配制成储备液，于 -20 °C 可稳定保存 6 个月。制备该储备液后，分装为每管 500 µL，以备后续实验使用。
   2. 将一管 50 mL 的无葡萄糖 Neurobasal-A 培养基置于冰上。
   3. 确保水浴锅温度设定为 37 °C。
   4. 为每只视网膜准备 4 个 1.5 mL 微量离心管并做好标记：1）葡萄糖饥饿管；2）6-NBDG 孵育管；3）超声处理管；4）用于 Pierce 检测的样品收集管（例如，若共有 4 只视网膜，则共需 16 个微量离心管）。管路设置的汇总请见 图 1。
   5. 从置于冰上的 50 mL 锥形管中取出 200 µL Neurobasal-A 培养基，加入已预先标记的超声处理管中，并将这些管置于冰上，以用于步....

结果

图4 显示了野生型小鼠视网膜在不同孵育时间下与6-NBDG共孵育后的代表性葡萄糖荧光检测结果。孵育30分钟后，6-NBDG水平平均为336 ± 27.91 AU；孵育60分钟后，6-NBDG水平上升至平均616.3 ± 8.38 AU。继续孵育30分钟则导致6-NBDG水平下降（506.4 ± 5.3 AU）。在60分钟时，实验结果的变异性最小，因此被选定为视网膜与6-NBDG共孵育的最佳时间点。需要注意的是，此处单位为任意单位，且这些结果未根据总蛋白量进行归一化处理。

图5 显示了野生型小鼠视网膜在孵育6-NBDG和GLUT1抑制剂BAY-876（终浓度为100 µM）后测得的葡萄糖荧光信号。6-NBDG摄取量减少了24%，表明在小鼠神经视网膜中存在GLUT1非依赖性的6-NBDG摄取机制。

讨论

总之，本方法可使基础科学研究人员测量荧光葡萄糖类似物6-NBDG的摄取情况 离体 小鼠神经视网膜。葡萄糖是神经视网膜必需的代谢物，其摄取可支持高水平的糖酵解和线粒体呼吸，以产生三磷酸腺苷（ATP）形式的能量。¹由于葡萄糖是首选的能量底物，许多视网膜细胞表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs），以促进从血管系统及周围组织中摄取葡萄糖。²该方案使研究人员能够快速且低成本地评估视网膜疾病小鼠模型中的葡萄糖摄取。此外，该方法也可轻松拓展应用于大鼠视网膜或其他感兴趣的组织。

该实验方案有几个关键方面需注意，以确保实验成功。该检测对时间敏感，因此必须在实验前预先准备好所有试剂和试管，以保证后续步骤顺利进行。需要注意的是，在与6-NBDG孵育90分钟后，荧光信号会下降（图4），这可能提示视网膜健康状况下降。因此，必须严格遵守孵育时间。此外，新鲜视网膜的分离是本实验的第一步限速环节；若分离过程缓慢或操作不当，可能导致结果出现偏差，因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
# 5 镊子	Katena	K5-6550	用于视网膜解剖
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
26 G x 5/8" 针头	sol-M	112658	解剖过程中用于穿刺角膜
5 mL 管	MTC bio	c2540
50 mL 管	Avantor by VWR	89039-656
6-NBDG	Invitrogen	N23106	荧光葡萄糖类似物
96 孔黑色板，透明底	Thermo Fisher Scientific	265301
麻醉用活性炭过滤罐	ReFresh	EZ-258	用于麻醉装置
BAY-876	Millipore Sigma	SML1774	用于抑制 GLUT1
4 °C 离心机	Eppendorf	EPP-5424
压缩气体（5% 二氧化碳，95% 氧气）	Airgas	UN3156	用于麻醉装置
弯头镊子	Roboz 外科器械	RS-5137	用于视网膜解剖
DDH2O	Elga LabWater	Elga PureLab Ultra	在乙醇之后用于样品间超声仪的清洗
解剖显微镜	Olympus	szX12	用于视网膜解剖
200 证明乙醇	Decon 实验室	2701	用于样品间超声仪的清洗
泡沫浮式试管架	Thermo Fisher Scientific	36-099-2328	用于水浴孵育步骤中的试管
普通剪刀	Roboz 外科器械	RS-680	用于视网膜解剖
异氟烷 250 mL 瓶	Piramal 危重症护理	NDC  6679401725	麻醉剂
异氟烷设备	Vetequip（由 VWR 销售）	89012-492	用于安乐死前麻醉
Kim 擦拭纸	VWR	82003-820
微孔板读板仪	Molecular Devices	SpectraMax M2 微孔板读板仪	用于读取样品
Neurobasal-A 培养基	Gibco	12349-015
鼻罩（低轮廓麻醉面罩）	Kent Scientific	SOMNO-0801	用于输送麻醉剂
解剖显微镜物镜	Olympus	DF plapo 1x pf	用于视网膜解剖
培养皿	VWR	25384-088	用于视网膜解剖过程中
Pierce 检测试剂	Thermo Fisher Scientific	1861426
P20 移液器吸头	Olympus Plastics	26-404
P200、P1000、P10 XL 移液器吸头	VWR	76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman 移液器 P200、P1000、P20、P10	VWR	F144055M, F144056M, F144058M, F144059M
安装 SoftMax Pro 软件的计算机	Molecular Devices	SoftMax Pro 7 软件	用于读取样品的软件
超声破碎仪	Thermo Fisher Scientific	FB50110	用于样品（视网膜）超声处理
移液管	Fisherbrand	13-711-9AM	用于将视网膜从一个管转移到另一个管
Vannas 弹簧剪刀	Katena	K4-5000	用于视网膜解剖
设定为 37 °C 的水浴锅	N/A	N/A	用于孵育