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方法文章

测量葡萄糖类似物6-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-6-脱氧葡萄糖在完整小鼠神经视网膜中的摄取 关键词：葡萄糖摄取, 6-NBDG, 神经视网膜, 小鼠, 荧光成像, 代谢活性, 视网膜组织, 活体检测

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DOI：

10.3791/67921

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2025年3月14日

 ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

视网膜中的多种细胞类型，包括内皮细胞、神经元和胶质细胞，均表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs），以介导葡萄糖进入细胞。使用 离体 小鼠神经视网膜与荧光葡萄糖类似物6-NBDG，我们描述了一种相对快速且经济的方法，用于测量整个小鼠视网膜的葡萄糖摄取。

摘要

视网膜是一种高代谢活性的组织，包含多种细胞类型，需要葡萄糖及其衍生物以生成ATP形式的能量。视网膜细胞（包括内皮细胞、神经元、光感受器和胶质细胞）表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs；例如GLUT1-4），以介导葡萄糖的摄取用于能量生成。其中GLUT1是视网膜中表达最丰富的葡萄糖转运蛋白。本方案使研究人员能够测定小鼠神经视网膜中的葡萄糖摄取能力 离体 使用荧光葡萄糖类似物 6-(N(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基-6-脱氧葡萄糖（6-NBDG）。视网膜分离后，可通过酶标仪进行荧光终点检测，快速测定整个视网膜中6-NBDG的总量。为保证实验一致性，建议将结果归一化至总蛋白水平。尽管6-NBDG对GLUT1具有高度特异性，但在GLUT1抑制剂BAY-876存在的情况下仍可检测到该类似物的摄取。因此，该检测方法提供了一种相对快速且经济的葡萄糖摄取测量手段。 离体 在小鼠全神经视网膜中，该过程部分由GLUT1介导。

引言

葡萄糖是神经视网膜的一种必需代谢物，用于支持高通量的糖酵解和线粒体呼吸，以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生能量1。由于葡萄糖是首选的能量底物，许多视网膜细胞表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs），以促进从血管系统及周围组织中摄取葡萄糖2。GLUTs是一类内在膜糖蛋白家族，负责将葡萄糖转运至哺乳动物细胞内3。葡萄糖转运蛋白-1（GLUT1）是视网膜中的主要葡萄糖转运蛋白，在整个视网膜各层均有表达4，并在构成血-视网膜屏障（BRB）的毛细血管内皮细胞中表达5。有趣的是，在包括阿尔茨海默病在内的中枢神经系统（CNS）神经退行性疾病中，人类患者在出现脑萎缩和神经元功能障碍之前，即已观察到GLUT1蛋白水平下降以及葡萄糖摄取减少6,7。在眼高压大鼠模型中，毛细血管中的GLUT1水平也有所降低8。在人类视网膜色素变性动物模型中，葡萄糖向视网膜外层转运减少与感光细胞丢失相关，也可能在青光眼等视网膜神经退行性病变中发挥一定作用。因此，深入了解神经视网膜中葡萄糖的转运机制，对于阐明其在视网膜神经退行性病变中的作用至关重要。

在此，我们介绍一种新颖、经济且简便的生化方法，用于检测6-NBDG的摄取 离体 小鼠神经视网膜，即不包括视网膜色素上皮和脉络膜。与2-NBDG等其他荧光类似物相比，6-NBDG由一个葡萄糖基团组成，其碳6位上的羟基被荧光硝基苯并氧基重氮氨基基团取代，从而阻止己糖激酶的磷酸化作用及进一步的代谢降解9尽管6-NBDG对GLUT1具有高特异性，其结合亲和力比葡萄糖高300倍9，我们在存在GLUT1抑制剂的情况下检测该类似物的摄取情况10因此，该检测方法提供了一种相对快速且经济的葡萄糖摄取测量手段。 离体 在整只小鼠视网膜中，部分由GLUT1介导。

实时测量组织中的葡萄糖摄取具有挑战性，通常需要放射性同位素标记或高分辨率成像方法。在此，我们采用一种荧光生化检测法，快速测定多个视网膜样本中6-NBDG的摄取情况 离体 条件。该方案可提供有关视网膜总葡萄糖摄取的信息，但无法提供有关视网膜特定细胞中6-NBDG摄取水平的信息。

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方案

本文所述所有方法均已获得范德比尔特大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 检测前准备

注意：由于该实验方案对时间敏感，必须在检测当天、开始检测前立即进行准备工作。

  1. 实验前的一般准备工作
    注意：6-NBDG 对光敏感，应避光保存。所有含 6-NBDG 的溶液均需用铝箔包裹。
    1. 将 5 mM 的 6-NBDG 溶于 50% DMSO/1×PBS 中配制成储备液，于 -20 °C 可稳定保存 6 个月。制备该储备液后，分装为每管 500 µL，以备后续实验使用。
    2. 将一管 50 mL 的无葡萄糖 Neurobasal-A 培养基置于冰上。
    3. 确保水浴锅温度设定为 37 °C。
    4. 为每只视网膜准备 4 个 1.5 mL 微量离心管并做好标记：1）葡萄糖饥饿管；2）6-NBDG 孵育管；3）超声处理管；4）用于 Pierce 检测的样品收集管（例如，若共有 4 只视网膜，则共需 16 个微量离心管）。管路设置的汇总请见 图 1。
    5. 从置于冰上的 50 mL 锥形管中取出 200 µL Neurobasal-A 培养基，加入已预先标记的超声处理管中，并将这些管置于冰上，以用于步骤 2.5.4。
    6. 打开酶标仪电源。
    7. 在酶标仪软件中设置实验参数，选择荧光终点检测模式，设定如下参数：激发波长 483 nm，发射波长 550 nm，截止波长 530 nm（此参数为 6-NBDG 预先确定的检测条件）。
  2. 实验前试剂准备：6-NBDG
    1. 将步骤 1.1.1 中配制的 5 mM 储备液用 Neurobasal-A 培养基稀释，配制成终浓度为 500 µM 的 6-NBDG 工作液。
      注意：请务必用铝箔包裹所有含 6-NBDG 的溶液。根据整个实验所需量配制适量的 500 µM 6-NBDG 工作液（每只视网膜需要 200 µL 工作液；另需额外体积以补偿误差及步骤 2.4 中标准曲线溶液的配制需求）。
    2. 用移液器将 200 µL 的 6-NBDG 工作液加入步骤 1.1.4 中已预先标记的 6-NBDG 孵育管中。

2. 进行6-NBDG摄取实验

注意：参见图2以获取逐步概述。

  1. 视网膜组织解剖
    1. 使用吸入式异氟烷麻醉剂（2% 异氟烷溶于 5% 二氧化碳/95% 氧气）使小鼠镇静。
      注意：通过夹捏小鼠后肢足垫来确认其是否充分麻醉。若麻醉充分，则不应出现抽动反应（足底回缩反射）。若存在反射动作，请返回步骤 2.1.1。
    2. 通过颈椎脱位处死小鼠，随后断头并迅速摘除眼球。将摘除的眼球置于盛有 5–10 mL 冰冷 Neurobasal-A 培养基（不含葡萄糖）的培养皿中，并置于冰上。
      注意：以下为神经视网膜解剖的基本指南（不包括视网膜色素上皮和脉络膜）；如需更详细的指导，请参考已发表的实验方案11，并查阅其中的“mouse retinal dissection”部分""。
    3. 将培养皿置于冰上的解剖显微镜下。
    4. 将无尘纸折叠成小方块，并用 Neurobasal A 培养基润湿。
    5. 使用剪去末端的塑料转移移液管，将一只眼球转移至湿润的无尘纸上。
      注意：无尘纸可增加摩擦力，防止眼球在解剖过程中滑动。
    6. 取 26 G 针头，在角膜侧方、前界线前方刺穿角膜。
    7. 使用 Vannas 剪刀从穿刺点沿前界线剪开，以去除角膜。
    8. 去除角膜后，用一对镊子夹住巩膜位于前界线与视神经乳头之间的中点位置。用另一只手的镊子夹住晶状体，并迅速一次性将其完整取出。
      注意：若缓慢移除晶状体，视网膜将附着于晶状体上，导致后续解剖困难。
    9. 将眼杯转移至盛有冰冷 Neurobasal A 培养基的培养皿中，并置于冰上。
    10. 双手持镊子，小心夹住锯齿缘处的眼杯。
      1. 为将视网膜杯从巩膜分离，使用镊子夹紧巩膜，注意避免夹到视网膜组织。
      2. 小心地将镊子在巩膜与视网膜组织之间沿眼球全周滑动，直至整个视网膜从前界线完全释放。
    11. 使用 Vannas 剪刀在前界线处的巩膜上做一小切口。
    12. 用镊子夹住切口边缘，将巩膜组织向视神经乳头方向剥离。用非优势手的镊子夹住巩膜，用优势手持闭合镊子轻柔引导视网膜远离巩膜。
    13. 用剪刀剪断视神经乳头，使视网膜完全脱离巩膜及残留的视神经。
    14. 使用剪切过的转移移液管将视网膜转移至预先准备好的 1.5 mL 微量离心管中，用于步骤 1.1.4 中的葡萄糖饥饿处理，每管含 200 µL Neurobasal-A 培养基（不含葡萄糖），每管放置一片视网膜。
  2. 葡萄糖饥饿处理步骤
    1. 将步骤 2.1.14 中的离心管放入 37 °C 水浴中，在 37 °C 下孵育 20 分钟。
  3. 6-NBDG 孵育
    1. 将每片视网膜转移至步骤 1.1.4 中预先标记好的新离心管中，用于 6-NBDG 孵育，每管含 200 µL 步骤 1.2.2 中配制的 500 µM 6-NBDG Neurobasal-A 培养基。
      注意：应使用剪切扩大尖端的转移移液管转移视网膜，以尽量减少损伤。 此外，若操作者技术熟练，也可使用镊子进行转移，前提是确保不会损伤视网膜。
    2. 将离心管转移至 37 °C 水浴中，在 37 °C 下孵育 60 分钟。
  4. 6-NBDG 标准品的配制（浓度范围 0 µM–40 µM）
    ​注意：在 60 分钟 6-NBDG 孵育期间（步骤 2.3.2）配制标准品。标准品可在室温下配制。所有溶液需避光保存。
    1. 标记 8 个 1.5 mL 微量离心管，编号 #1–#8，用于配制 8 个标准品（见图 3）。
    2. 对于标准品 #1（40 µM 6-NBDG），取步骤 1.2.1 配制的 500 µM 6-NBDG 储备液 32 µL，加入对应离心管中。
    3. 向该微量离心管中加入 368 µL Neurobasal-A 培养基，并通过反复吹打充分混匀。
    4. 对标准品 #2–#8 进行如下系列稀释：
      1. 向 #2–#8 管中各加入 200 µL Neurobasal-A 培养基。
      2. 从标准品 #1 管中吸取 200 µL 溶液，加入 #2 管中，然后通过反复吹打充分混匀。
      3. 从标准品 #2 管中吸取 200 µL 溶液，加入 #3 管中，然后通过反复吹打充分混匀。
      4. 从标准品 #3 管中吸取 200 µL 溶液，加入 #4 管中，然后通过反复吹打充分混匀。
      5. 从标准品 #4 管中吸取 200 µL 溶液，加入 #5 管中，然后通过反复吹打充分混匀。
      6. 从标准品 #5 管中吸取 200 µL 溶液，加入 #6 管中，然后通过反复吹打充分混匀。
      7. 从标准品 #6 管中吸取 200 µL 溶液，加入 #7 管中，然后通过反复吹打充分混匀。
      8. 向 #8 管中不再添加任何溶液（即仅含步骤 2.4.4.1 中加入的 200 µL Neurobasal-A 培养基）。
  5. 洗涤、超声处理及离心以收集样品
    1. 60 分钟 6-NBDG 孵育结束后，将所有离心管从 37 °C 水浴中取出。
    2. 尽可能快速且小心地用 500 µL 冰冷 Neurobasal-A 培养基洗涤每片视网膜。
      1. 洗涤时，用移液器吸除 6-NBDG 溶液，注意避免接触或扰动视网膜组织。
        注意：也可选择使用镊子将视网膜从 6-NBDG 孵育管转移至另一含有 500 µL Neurobasal-A 培养基的新管中。此方法下仅需再进行 3 次洗涤。若操作者确信使用镊子不会损伤视网膜，可采用此方法。
      2. 随后，将废液弃入适当的废液容器中。立即向同一离心管中加入 500 µL 冷 Neurobasal-A 培养基以替换已移除的溶液。每次洗涤之间将离心管放回冰上。
    3. 重复上述洗涤步骤 3 次，共完成 4 次洗涤。
    4. 使用剪切边缘的转移移液管或镊子，小心地将视网膜转移至含有 Neurobasal A 培养基并置于冰上的超声处理管中（见步骤 1.1.4）。
    5. 使用小型解剖剪刀将视网膜剪成小块。
      注意：每次剪切不同视网膜后，务必用乙醇清洗工具，以防样品间交叉污染。
    6. 对每片视网膜进行 5–10 秒的超声处理（振幅设为 10），处理后立即放回冰上。
      注意：每次处理不同样品之间，必须用 100% 乙醇清洗超声探头，随后用超纯 H2O 冲洗。此时，可选择将离心机预冷至 4 °C，或在 4 °C 冷室内的离心机中进行后续操作。
    7. 在 4 °C 下以 21130 x g 离心 15 分钟；若离心机最大转速低于 21130 x g，则使用其最大转速。
      注意：在步骤 2.5.7 的 15 分钟离心过程中，将步骤 2.4 配制的标准品 #1–#8 各取 100 µL 加入黑色、透明底 96 孔板中。
  6. 在酶标仪上读取样品
    1. 15 分钟离心结束后，吸取 100 µL 上清液，转移至 96 孔板中。
    2. 将 96 孔板插入酶标仪。
      注意：96 孔板中应包含每份样品和每份标准品各 100 µL。
    3. 在酶标仪软件中选择荧光终点检测模式，并设置为步骤 1.1.7 中选定的参数。
    4. 运行检测程序并保存结果。
    5. 将 96 孔板中的样品用移液器转移至步骤 1.1.4 中预先标记的离心管中，用于 Pierce 蛋白定量检测。
      ​注意：此时样品可立即进行蛋白检测（见下文），或储存于 -80 °C 待用。
  7. Pierce 蛋白定量检测（用于蛋白归一化）
    ​注意：为提高准确性，Pierce 检测应对标准品和样品均进行双复孔检测。
    1. 使用 Pierce 预稀释蛋白标准品，将每种标准品各取 10 µL，双复孔加入透明底 96 孔板中。
    2. 将步骤 2.6.5 中的各样品各取 10 µL，双复孔加入 96 孔板中。
    3. 向所有含标准品或样品的孔中加入 150 µL Pierce 试剂。盖上 96 孔板，置于板式摇床上以中等速度振荡 1 分钟以混匀。
    4. 在室温（RT）下孵育 5 分钟。
    5. 将 96 孔板插入酶标仪，选择吸光度终点检测模式，并将波长设定为 660 nm。
    6. 测定标准品和样品的吸光度并保存结果。通过绘制标准曲线计算各样品中的总微克蛋白含量。
  8. 计算视网膜 6-NBDG 摄取量
    注意：由于视网膜大小不均，6-NBDG 检测结果需根据总蛋白含量进行归一化处理。
    1. 利用步骤 2.6 获得的荧光强度值，结合预设标准品的荧光读数绘制 6-NBDG 荧光标准曲线，并定量各样品中 6-NBDG 的浓度（µM）。
    2. 将样品检测结果归一化至对应的蛋白含量，计算 [6-NBDG] µM/µg 蛋白。

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结果

图4 显示了野生型小鼠视网膜在不同孵育时间下与6-NBDG共孵育后的代表性葡萄糖荧光检测结果。孵育30分钟后，6-NBDG水平平均为336 ± 27.91 AU；孵育60分钟后，6-NBDG水平上升至平均616.3 ± 8.38 AU。继续孵育30分钟则导致6-NBDG水平下降（506.4 ± 5.3 AU）。在60分钟时，实验结果的变异性最小，因此被选定为视网膜与6-NBDG共孵育的最佳时间点。需要注意的是，此处单位为任意单位，且这些结果未根据总蛋白量进行归一化处理。

图5 显示了野生型小鼠视网膜在孵育6-NBDG和GLUT1抑制剂BAY-876（终浓度为100 µM）后测得的葡萄糖荧光信号。6-NBDG摄取量减少了24%，表明在小鼠神经视网膜中存在GLUT1非依赖性的6-NBDG摄取机制。

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讨论

总之，本方法可使基础科学研究人员测量荧光葡萄糖类似物6-NBDG的摄取情况 离体 小鼠神经视网膜。葡萄糖是神经视网膜必需的代谢物，其摄取可支持高水平的糖酵解和线粒体呼吸，以产生三磷酸腺苷（ATP）形式的能量。1由于葡萄糖是首选的能量底物，许多视网膜细胞表达葡萄糖转运蛋白（GLUTs），以促进从血管系统及周围组织中摄取葡萄糖。2该方案使研究人员能够快速且低成本地评估视网膜疾病小鼠模型中的葡萄糖摄取。此外，该方法也可轻松拓展应用于大鼠视网膜或其他感兴趣的组织。

该实验方案有几个关键方面需注意，以确保实验成功。该检测对时间敏感，因此必须在实验前预先准备好所有试剂和试管，以保证后续步骤顺利进行。需要注意的是，在与6-NBDG孵育90分钟后，荧光信号会下降（图4），这可能提示视网膜健康状况下降。因此，必须严格遵守孵育时间。此外，新鲜视网膜的分离是本实验的第一步限速环节；若分离过程缓慢或操作不当，可能导致结果出现偏差，因...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由授予 Lauren K. Wareham 的无限制部门资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
# 5 镊子KatenaK5-6550用于视网膜解剖
1.5 mL 微量离心管Thermo Fisher Scientific05-408-129
26 G x 5/8" 针头sol-M112658解剖过程中用于穿刺角膜
5 mL 管MTC bioc2540
50 mL 管Avantor by VWR89039-656
6-NBDGInvitrogenN23106荧光葡萄糖类似物
96 孔黑色板，透明底Thermo Fisher Scientific265301
麻醉用活性炭过滤罐ReFreshEZ-258用于麻醉装置
BAY-876Millipore SigmaSML1774用于抑制 GLUT1
4 °C 离心机EppendorfEPP-5424
压缩气体（5% 二氧化碳，95% 氧气）AirgasUN3156用于麻醉装置
弯头镊子Roboz 外科器械RS-5137用于视网膜解剖
DDH2OElga LabWaterElga PureLab Ultra在乙醇之后用于样品间超声仪的清洗
解剖显微镜OlympusszX12用于视网膜解剖
200 证明乙醇Decon 实验室2701用于样品间超声仪的清洗
泡沫浮式试管架Thermo Fisher Scientific36-099-2328用于水浴孵育步骤中的试管
普通剪刀Roboz 外科器械RS-680用于视网膜解剖
异氟烷 250 mL 瓶Piramal 危重症护理NDC  6679401725麻醉剂
异氟烷设备Vetequip（由 VWR 销售）89012-492用于安乐死前麻醉
Kim 擦拭纸VWR82003-820
微孔板读板仪Molecular DevicesSpectraMax M2 微孔板读板仪用于读取样品
Neurobasal-A 培养基Gibco12349-015
鼻罩（低轮廓麻醉面罩）Kent ScientificSOMNO-0801用于输送麻醉剂
解剖显微镜物镜OlympusDF plapo 1x pf用于视网膜解剖
培养皿VWR25384-088用于视网膜解剖过程中
Pierce 检测试剂Thermo Fisher Scientific1861426
P20 移液器吸头Olympus Plastics26-404
P200、P1000、P10 XL 移液器吸头VWR76322-150, 76322-154, 76322-132
Pipetteman 移液器 P200、P1000、P20、P10VWRF144055M, F144056M, F144058M, F144059M
安装 SoftMax Pro 软件的计算机Molecular DevicesSoftMax Pro 7 软件用于读取样品的软件
超声破碎仪Thermo Fisher ScientificFB50110用于样品（视网膜）超声处理
移液管Fisherbrand13-711-9AM用于将视网膜从一个管转移到另一个管
Vannas 弹簧剪刀KatenaK4-5000用于视网膜解剖
设定为 37 °C 的水浴锅N/AN/A用于孵育

参考文献

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