本文介绍了一种全面的PmbExM实验方案，这是一种专门设计用于 奇异变形杆菌 生物膜。PmbExM 利用逐步的酶处理方法对生物膜样品进行处理，实现各向同性的 4.3 倍扩增，从而能够对这些固着微生物群落中细胞及亚细胞结构的空间组织进行超分辨率分析。
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本文内容
摘要
摘要
使用传统光学显微镜从微生物样品中获取详细的可视化信息和定量数据时，其分辨率受到衍射极限的限制。为提高分辨率，一种解决方案是扩展显微技术（Expansion Microscopy, ExM），这是一种创新且经济高效的超分辨率技术，通过物理方式将样品放大至原始尺寸的约四倍。要实现成功的扩增，关键在于均质化生物材料的机械特性。生物膜是由细菌群落附着于表面并包埋于自身产生的胞外基质中所形成的结构，因此需要对ExM实验流程进行调整，以适应其独特的结构组分。本文介绍了奇异变形杆菌生物膜扩展显微技术（Proteus mirabilis biofilm ExM, PmbExM），这是一种专门用于对培养48小时的P. mirabilis生物膜进行超分辨率成像的ExM变体。该方案聚焦于通过一系列酶解反应，在接近理论最优条件下靶向降解样品的关键结构组分。PmbExM联合使用多种酶，包括用于多糖水解的α-淀粉酶、纤维素酶和裂解酶类糖苷水解酶；用于肽聚糖水解的溶菌素（mutanolysin）；以及用于蛋白质水解的蛋白酶K。这些酶解步骤独立于凝胶化过程，因此可根据不同生物膜模型的具体均质化需求进行调整。这种可调节性使其在多种细菌种类和不同生长条件下具有广泛的应用潜力。尽管ExM已被应用于多种生物膜，但总体扩增因子普遍未达理想水平。相比之下，PmbExM实现了标准丙烯酰胺-丙烯酸酯ExM水凝胶的理论最大扩增倍数，且未出现明显的形态或拓扑结构畸变。本研究旨在提供一种易于实施的超分辨率成像方案，用于可视化分析P. mirabilis生物膜的结构架构、组装过程以及细胞内外特征。
引言
荧光显微镜是研究生物膜结构、组成和功能的常用工具1然而，光学显微镜在解析生物膜的结构、细胞及亚细胞特征时，受限于衍射极限。扩展显微镜技术（ExM）是一种创新、简便且易于使用的超分辨率成像技术，在突破衍射极限以揭示生物膜结构方面具有巨大潜力。2,3ExM 通过各向同性地将生物样本膨胀至原始尺寸的约四倍来提高分辨率。该方法包括以下步骤： 原位 在整个样本中聚合可膨胀离子水凝胶，并在谨慎操作时保持分子靶标的相对空间排列4,5.
为了使膨胀显微技术（ExM）正常工作，均一化生物材料的机械性能是一个关键步骤6。标准的ExM变体最初基于哺乳动物细胞培养物和组织开发，仅通过蛋白酶K的蛋白水解消化4,5，或使用去污剂结合高压灭菌进行温和的蛋白质变性7，即可有效实现均一化，获得各向同性的4倍膨胀。然而，在细菌和细菌生物膜的情况下，肽聚糖细胞壁以及胞外多糖（EPS）基质成分（如结构多糖）会....
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方案
PmbExM 整体流程概述如下 图1请参阅 补充文件 1 以查找本研究中使用的所有已命名溶液（即单体溶液、蛋白酶K消化液等）的组成成分。同样，请参考 补充文件2，补充文件3，以及 补充文件 4 为简化数据处理与分析流程，使缺乏图像处理经验的研究人员也能顺利操作。该实验方案可在2.5至3周内顺利完成：第一周用于盖玻片的清洗与灭菌、生物膜培养及样品固定；第二周进行样品染色及PmbExM实验操作；第三周用于样品封片与图像采集。此外，建议预留1周时间准备所需的材料与溶液。本研究中所用试剂、材料、设备及软件的详细信息列于下文 材料表.
图1：PmbE....
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结果
PmbExM 将P. mirabilis 生物膜扩大了 4.3 倍，并保持了其形态和拓扑结构
图 3A–D 展示了 P. mirabilis 生物膜细胞的物理放大效果以及该技术带来的分辨率提升。此外，这种放大效果不仅出现在细胞呈单层样排列的较薄生物膜区域，也出现在由 2 层甚至 3 层细菌密集排列构成的较厚区域（图 3G、H）。定量形态学分析显示，PmbExM 将细菌的最大宽度从 0.7 µm ± 0.07 µm 增加至 3.0 µm ± 0.22 µm（均值 ± 标准差）（图 3E），相当于约 4.3 倍的扩增因子（EF）。此外，扩增前后图像的共定位分析显示，分割出的细菌区域具有高度重叠（
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讨论
PmbExM 的关键步骤
与任何 ExM 变体一样，该方案中最关键的步骤之一是均一化样品的机械性能。在 PmbExM 中，此目标通过一系列酶促处理实现。消化不足可能导致扩增因子（EF）偏低，并可能破坏生物膜的形态和/或拓扑结构，从而导致分辨率不理想和结果不可靠。相反，过度剧烈的消化（尤其是蛋白水解处理）则可能导致显著的荧光信号损失，并破坏生物膜的形态与结构。鉴于生物膜在结构和组成上的复杂性，PmbExM 特别设计为在接近最优条件下（基于已发表文献12,13,14,15）使用消化酶，以确保有效的均一化。该方法通过精确控制蛋白酶 K 浓度、温度和孵育时间等参数，在保持荧光信号的同时，有效保护生物膜的形态完整性。
方法的改进与故障排除
PmbE.......
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披露
作者声明本工作中不存在与之相关的经济或个人利益冲突。
致谢
作者感谢 Juan Eduardo Rodríguez 博士和 Ulrich Kubitschek 教授（波恩大学）为 SCIAN-Lab 扩展技术的实施所做出的贡献。本研究由以下项目资助：ANID 项目 ICM P09-015-F（SH、DC、KP、JJW）、FONDECYT 1211988（SH、DC、KP）、FONDECYT 3220832（JJW）、FONDEQUIP EQM210020（DC、KP、JJW、JT、NCH、PS、SH）；Núcleo SELFO NCN2024_068（SH、KP、JJW）， CORFO 16CTTS- 66,390，MINEDUC 拨款 RED 21994（SH），BASAL FB210005（SH），DAAD 57519605（SH、NC）， Centro CTI230006（SH）， FONDEF ID 23I10337（SH），以及区域双边合作项目 Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661（SH、NCH、PS、MJG）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-淀粉酶来源于 芽孢杆菌属 sp. | Sigma-Aldrich | 10070 | 多糖消化 |
| 0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸水溶液 | Sigma-Aldrich | P8920 | 用于成像的样品固定 |
| 12 mm 玻璃盖玻片 | Chemglass生命科学 | CLS-1760 | 凝胶化室组件 |
| 16位 C13440-20CU 相机 | 滨松光子学 | 暂无内容 | 用于图像采集的CMOS数码相机 |
| 24 mm x 50 mm 玻璃盖玻片 | Chemglass生命科学 | CLS-1764 | 样品操作/处理 |
| 3D打印成像室 | 自主研发设计 | - | 成像室选项 |
| 4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（4-hydroxy-TEMPO） | Sigma-Aldrich | 176141 | 凝胶溶液组分 |
| 带黑色侧壁的6孔玻璃底培养板 | CelVis | P06-1.5H-N | 成像室选项 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 818755 | 酶缓冲液组分 |
| 丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | A4058 | 单体溶液组分 |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich | A3678 | 凝胶溶液组分 |
| Axiovert 200 显微镜 | Zeiss | 暂无内容 | 共聚焦显微镜 |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C8106 | 酶缓冲液组分 |
| C-Apochromat 63倍 1.2 数值孔径水浸物镜 | Zeiss | 暂无内容 | 显微镜物镜 |
| 来自的纤维素酶 黑曲霉 | Sigma-Aldrich | 22178 | 多糖消化 |
| Chamlide CMB 35 mm 培养皿磁力成像腔室 | 活细胞检测仪器 | 暂无内容 | 成像室选项 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 472301 | MA-NHS 锚定试剂储备液 |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S3264 | 酶缓冲液组分 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 清洁与灭菌 |
| 乙二胺四乙酸 | 默克 | 324503 | 酶缓冲液组分 |
| Falcon 聚苯乙烯 24 孔板 | 康宁 | 351147 | 通用实验操作平台 |
| FIJI 软件 | 美国国立卫生研究院 | - | 图像处理软件 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G7893 | 酶缓冲液组分 |
| 盐酸胍 | 赛默飞世尔科技 | 24115 | 酶缓冲液组分 |
| Huygens 软件 | 科学体积成像 | - | 用于图像复原的反卷积软件 |
| 盐酸 | Supelco | 1.00317 | 缓冲液配制 |
| Kimwipes 纸巾 | Fisher Scientific | 06-666 | 去除多余水分 |
| 实验室镊子 | 电子显微镜科学公司 | M5E | 通用样品操作/处理 |
| Luria Bertani 肉汤 | Invitrogen | 12795-027 | 生物膜生长培养基 |
| 来自溶壁酶 Arthrobacter luteus | Sigma-Aldrich | L4025 | 多糖消化 |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | D5652 | 酶缓冲液组分 |
| 甲基丙烯酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯 | Sigma-Aldrich | 730300 | 锚定试剂 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 32213 | 样品脱水 &和储存 |
| MicrobeJ | - | - | 图像处理软件插件 |
| 显微镜载玻片 | Chemglass生命科学 | CG-8221 | 凝胶化室组件 |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S9638 | 酶缓冲液组分 |
| 溶菌酶 Streptomyces globisporus | Sigma-Aldrich | M990 | 肽聚糖消化 |
| N, N, N', N'-四甲基乙二胺 | Sigma-Aldrich | T7024 | 凝胶溶液组分 |
| N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | M1533 | 单体溶液组分 |
| Nunc 40.4 mm 玻璃底培养皿 | Thermo Fisher | 12-567-400 | 成像室选项 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | 样品固定 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | 79383 | 单体溶液组分，洗涤，酶缓冲液 |
| 蛋白酶K 来自 Engyodontium album | Invitrogen | 25530-031 | 蛋白质消化 |
| 奇异变形杆菌 ATCC 12453 | Microbiologics | 0440P | 研究对象 |
| 小型扁头画笔 | 当地五金店 | - | 样品操作/处理 |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | 241245 | 酶缓冲液组分 |
| 丙烯酸钠 | Sigma-Aldrich | 408220 | 单体溶液组分 |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | 酶缓冲液组分 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888 | 单体溶液组分，酶缓冲液组分 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | 载玻片清洗 |
| 固态激光线 | 奥密克戎 | 暂无内容 | 488、568 和 647 nm 激发激光线 |
| SYTO 61 核酸染色 | Invitrogen | S11343 | 荧光染料 |
| 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 | SAFC | 108219 | 酶缓冲液组分 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 样品通透化，酶缓冲液组分 |
| Volocity 7.0.0 采集软件 | Quorum Technologies | - | 显微镜采集控制器软件 |
| Volocity ViewVox 转盘系统 | Perkin-Elmer | 暂无内容 | 共聚焦显微镜用旋转盘系统 |
| 麦胚凝集素 – Alexa Fluor 488 荧光凝集素偶联物 | Invitrogen | W11261 | 荧光染料 |
参考文献
- Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
- Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms....
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