铜纳米颗粒通过产生活性氧发挥抗菌作用。本文介绍的实验方法表明，铜纳米颗粒对三种具有临床意义的病原体具有抑制效果，且该杀菌过程涉及某些程序性细胞死亡通路。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，由于抗生素的过度使用和滥用，人们对多重耐药病原体和无法治愈的感染的担忧日益增加。纳米材料（如金属及金属氧化物纳米颗粒）因其在对抗多重耐药病原体方面的潜力，已成为生物医学领域备受关注的新策略。本研究探讨了铜纳米颗粒（CuNPs）作为杀菌剂对抗三种常见的医院获得性机会性病原体——大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，A. baumannii）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）的效果，这些病原体的耐药性正不断增强。本文提供了合成两种尺寸（20 nm 和 60 nm）铜纳米颗粒的详细方案，并通过菌落实验评估其杀菌效果。通过检测活性氧（ROS）生成的变化，探讨了CuNPs抗菌作用的潜在机制。此外，应用了四种可抑制人类蛋白功能的调节剂，以研究程序性细胞死亡（PCD）通路在细菌杀伤过程中可能发挥的作用。通过该方法，结合对铜稳态蛋白（包括依赖铜的转录调控因子）的研究，提示了铜耐药菌株可能出现的风险。这些发现为研究CuNPs的杀菌效应及其在应对抗生素耐药性方面的潜在作用提供了系统的方法学框架。
引言
耐药细菌是医学领域令人严重关切的问题。它们的快速出现降低了传统抗生素的疗效，导致更多的临床并发症。这些细菌对公共卫生构成重大威胁，并迫切需要开发新的抗菌剂。其中一个研究方向是纳米材料。纳米材料具有独特的物理化学性质，能够以破坏微生物存活能力的方式与微生物相互作用。例如，银纳米颗粒（AgNPs）可在细菌中诱导氧化应激，导致蛋白质功能障碍、膜结构破坏、DNA损伤，最终引起细胞死亡1。而金纳米颗粒（AuNPs）则以其抗真菌特性著称，并可通过作为载体来增强抗生素的杀菌效果2。
此外，由于铜纳米颗粒（CuNPs）具有显著的抗菌效果和较低的生产成本，也受到了广泛关注。研究表明，CuNPs可通过破坏酶活性和产生活性氧（ROS）发挥广谱杀菌作用3。CuNPs所带的正电荷有助于其穿透细菌细胞，增强细胞摄取4。这一机制使CuNPs成为用于植入物等表面涂层以预防感染的有前景的选择3。然而，一个有趣的研究发现是，CuNPs的杀菌效果似乎具有尺寸依赖性。一些研究发现，较小的CuNPs表现出更强的抗菌活性，这可能归因于其更高的表面积与体积比5。
活性氧（ROS）的生成会对细胞和细菌造成广泛损伤，包括脂质过氧化、蛋白质功能障碍、DNA断裂以及糖异生/糖原分解的抑制，并参与坏死或程序性细胞死亡（PCD）6,7,8。近期研究表明，细菌中存在类似于真核生物系统的程序性细胞死亡机制，其作用模式和效应分子与真核系统相似9。细菌群体可通过毒素-抗毒素（TA）系统在应激条件下（包括氧化应激）诱导程序性细胞死亡10。简而言之，毒素-抗毒素系统由能够破坏关键细胞过程的毒素和能够在正常生长条件下与毒素形成稳定复合物以抑制其毒性的抗毒素组成。大多数细菌和古菌的基因组中均含有TA位点，通常以染色体外和染色体DNA的多个拷贝形式存在。目前已发现多种类型的TA系统，其中II型TA系统（即MazE/MazF模块）尤为引人关注。在应激条件下，抗毒素被降解，从而释放毒素以抑制其细胞靶标。在E. coli和S. aureus中，毒素MazF可在氧化应激、高温和氨基酸饥饿等应激条件下被激活。结果，抗毒素MazE的表达减少，导致毒素MazF被释放10。研究发现，MazF可促进某些蛋白的合成，使小部分亚群在不利环境中存活，而大部分群体则经历mazEF介导的细胞死亡。这种细胞死亡可以是依赖ROS的，即ROS诱导转录或翻译抑制；也可以是不依赖ROS的，即DNA损伤触发死亡通路11。
本研究探讨了CuNPs诱导细菌死亡的机制。研究并未仅局限于TA系统，而是采用了先前研究中使用的四种PCD调节剂7,12，以探究细菌中可能存在的PCD通路。
通过研究两种不同尺寸（20 和 60 nm）的铜纳米颗粒（CuNPs）在不同浓度下的杀菌效应，并结合菌落实验、活性氧（ROS）检测以及程序性细胞死亡（PCD）调节剂（SBI、Z-VAD、NSA 和 Wortmannin）等方法，本研究揭示了程序性细胞死亡并非多细胞生物所特有，而是在细菌群体受到胁迫时同样会发生。通过提供详细的实验方案，本研究旨在帮助科研人员评估CuNPs在其自身系统中的杀菌效果及作用机制。此外，这些发现深化了对细菌程序性细胞死亡的理解，并为开发基于CuNPs的新型疗法以应对耐药菌感染提供了支持。
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方案
本研究中使用的试剂和设备列在材料表中。
1. 铜纳米颗粒的制备
- 从商业来源获取商用铜纳米粉末（25 nm 和 60-80 nm）。
- 使用 1.0 mM 十二烷基硫酸钠（SDS）作为两种粒径均为 1 mg/mL 的纳米颗粒的分散剂。
- 在室温下使用超声波水浴分散纳米颗粒，时间不少于 30 分钟。完全分散后的纳米颗粒即可用于后续实验。
2. 细菌的制备
- 从美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）获取大肠埃希菌（E. coli）(Migula) Castellani 和 Chalmers 菌株 25922 以及鲍特氏不动杆菌（A. baumannii）Bouvet 和 Grimont 菌株。从生物资源保藏与研究中心（Bioresource Collection and Research Center）获取金黄色葡萄球菌（S. aureus）。
- 在37 °C有氧条件下，于Luria-Bertani（LB）肉汤培养基中培养细菌。
- 用LB培养基将细菌培养物稀释至600 nm处的光密度（OD600）约为0.5。
3. 细胞活力评估
- 菌落实验
- 使用储备的CuNP溶液（1 mg/mL）配制两种粒径CuNPs的不同浓度溶液，包括0 µg/mL、1 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、50 µg/mL和100 µg/mL。
- 将步骤2.3中制备的细菌培养物分装至微量离心管中，在室温下以3300 × g 离心10分钟。
- 保留细菌沉淀，并分别加入不同浓度的两种粒径CuNPs，轻轻吹打混匀。
- 分别以PBS和70%乙醇处理细菌沉淀，作为阴性对照和阳性对照。
- 将所有处理后的细菌在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育24小时。
- 孵育结束后，用PBS洗涤所有处理组细菌，并将其涂布于LB琼脂平板上。将平板置于37 °C培养箱中培养24小时。
- 次日计数各处理组的菌落数量并进行统计分析。建议每组设三个重复，以确保统计学准确性。
- 杀菌机制研究
- 按照步骤3.1.2所述方法制备细菌，并分别用5 µM SBI-0206965（SBI）处理2小时、0.5 µM necrosulfonamide（NSA）处理1小时、100 nM wortmannin（Wort）处理30分钟，或100 nM Z-VAD-FMK（Z-VAD）处理30分钟。
- 在存在或不存在5 µM SBI、0.5 µM NSA、100 nM Wort和100 nM Z-VAD的条件下，按照步骤3.1.1所述方法，用不同浓度的两种粒径CuNP溶液共处理细菌。
- 对经调节剂处理后的细菌（步骤3.2.1）进行离心，弃去上清液。
- 将细菌沉淀重悬于步骤3.2.2中配制的溶液中，在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育24小时。
- 分别以70%乙醇和PBS处理细菌作为阳性对照和阴性对照。在相同抑制剂条件下，使用不含CuNPs的溶液作为空白对照（0 µg/mL；mock），每组均额外孵育24小时。
- 孵育结束后，按1:10的体积比向培养物中加入细胞活力检测试剂，在37 °C振荡条件下继续孵育2小时。
- 将孵育2小时后的培养物（步骤3.1.2）离心，转移荧光上清液至96孔板中。使用酶标仪检测荧光信号，激发波长为560 nm，发射波长为590 nm。
- 将剩余上清液稀释至10-5 和10-4，涂布于LB琼脂平板进行培养。
- 次日计数单菌落。
4. 活性氧的检测
- 按照步骤 2.3 所述制备细菌培养物，并将其分装至微量离心管中。
- 对细菌施加不同的应激条件，作为诱导活性氧（ROS）的阳性对照组（结果中未显示数据）。处理方法详见步骤 4.2.1–4.2.4。
- 将细菌暴露于 405 nm 紫外光下 3 小时。随后在 45 °C 下孵育细菌 2 小时。
- 接着在 4 °C 下孵育细菌 2 小时。
- 用 3% H2O2 处理细菌 30 分钟。
- 将细菌在 LB 肉汤中于 37 °C 维持培养，作为阴性对照。
- 按照步骤 3.1.1 所述配制不同浓度的 CuNPs，并用 20 nm 或 60 nm 的 CuNPs 以 1 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL 和 100 µg/mL 的浓度处理细菌，处理时间为 24 小时。
- 用 PBS 洗涤孵育后的细菌两次，以去除残留的纳米颗粒。
- 在 PBS 中配制 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）染料，终浓度为 5 µM。
- 将细菌沉淀重悬于 5 µM 的 H2DCFDA 中，并使用流式细胞仪在 520/30 nm 发射波长下测定荧光强度。
注意：FL1 绿色荧光强度与处理组细菌中的 ROS 水平呈正相关。建议设置三个重复，以确保统计学准确性。
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结果
两种粒径CuNPs对三种病原菌的抗菌活性
采用三种机会性病原菌（E. coli、S. aureus 和 A. baumannii）检测CuNPs的杀菌活性。将细菌分别暴露于0 µg/mL、1 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、50 µg/mL和100 µg/mL浓度的20 nm或60 nm CuNPs中，通过菌落计数法测定最小杀菌浓度（MBC），以评估杀菌效果。结果显示，两种粒径的CuNPs对三种菌株均表现出显著的杀菌作用（图1）。对于E. coli，在20 nm CuNPs处理组中，菌落数量自1 µg/mL起显著减少；而在60 nm CuNPs处理组中，则自5 µg/mL起出现显著下降（图1A）。相比之下，S. aureus在两种粒径CuNPs的所有浓度处理下均表现出明显的菌落减少（图1B）。对于A. bau...
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讨论
本研究探讨了两种粒径和不同浓度的铜纳米颗粒（CuNPs）对大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的抗菌作用及其机制。通过采用既定实验方案，观察到CuNPs诱导的杀菌效应涉及氧化应激及可能的程序性细胞死亡（PCD）激活。然而，金属稳态与细菌应激反应之间的相互作用仍 largely 未被深入研究。既往研究已鉴定出细菌的耐药策略，例如铜外排泵和金属结合蛋白，这些机制可能影响细菌对CuNPs的敏感性19。此外，铜离子潜在的细胞毒性仍是其治疗应用中的关注点，凸显了精确优化剂量的必要性20。深入理解CuNPs的杀菌机制，对于推动其安全有效应用至关重要。
本讨论将重点阐述该方法的操作步骤及其相关影响。该实验方案的关键步骤包括：正确制备和分散铜纳米颗粒（CuNP），确保细菌培养物在600 nm处的光密度（OD600）为0.5，以获得可重复的实验结果，以及将细菌沉...
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披露
作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。
致谢
我们感谢中国台湾慈济大学核心设施中心提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Acinetobacter baumannii Bouvet和Grimont菌株 | 美国典型培养物保藏中心（ATCC），美国弗吉尼亚州马纳萨斯 | 17978 | 用于CuNP毒理实验的细菌 |
| Bio-Rad iMark 微孔板读数仪 | Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫克力士 | 168-1130 | 用于测定细菌活性实验中的吸光度。 |
| 细胞渗透性2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯 （H2DCFDA） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | D6883 | 用于检测经处理细菌细胞中的活性氧（ROS）。 |
| 铜纳米颗粒（CuNPs）25 nm | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 774081 | 用于制备CuNP储备液 |
| 铜纳米颗粒（CuNPs）60-80 nm | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 774103 | 用于制备CuNP储备液 |
| Escherichia coli（Migula）Castellani和Chalmers | 美国典型培养物保藏中心（ATCC），美国弗吉尼亚州马纳萨斯 | 25922 | 用于CuNP毒理实验的细菌 |
| Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter，美国加利福尼亚州布雷亚 | 用于多个实验中的流式细胞术分析，包括活性氧检测。 | |
| LB琼脂 | FocusBio，中国台湾苗栗 | LBA500 | 用于细菌培养 |
| LB（Luria-Bertani）肉汤 | Becton, Dickinson and Company，美国马里兰州斯帕克斯 | 244620 | 用于细菌培养 |
| 坏死磺酰胺（Necrosulfonamide，NSA） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 480073 | 在细菌死亡通路研究中用作预处理调节剂。 |
| PrestoBlue细胞活性检测试剂 | Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 | P50200 | 通过荧光法评估细胞活性。 |
| SBI-0206965（SBI） | BioVision，美国加利福尼亚州米尔皮塔斯 | 9580 | 在细菌死亡通路研究中用作预处理调节剂。 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | L4509 | 用作铜纳米颗粒的分散剂以减少聚集。 |
| Staphylococcus aureus | 美国典型培养物保藏中心（ATCC），美国弗吉尼亚州马纳萨斯 生物资源保存及研究中心（BCRC），中国台湾新竹 | 13567 | 用于CuNP毒理实验的细菌 |
| Varioskan LUX多功能微孔板读数仪 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | VLBLATGD2 | 用于细胞活性实验中的荧光测定 |
| 渥曼青霉素（Wortmannin，Wort） | Abcam，美国马萨诸塞州 | ab120148 | 在细菌死亡通路研究中用作预处理调节剂。 |
| Z-VAD-FMK（Z-VAD） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | V116 | 在细菌死亡通路研究中用作预处理调节剂。 |
参考文献
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