本方案演示了在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中应用的经口咽部吸入技术。
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本文内容
摘要
摘要
间质性肺疾病（ILD）是一组以肺实质进行性且常不可逆的瘢痕形成为特征的疾病谱，其中最常见的是特发性肺纤维化（IPF）。目前已开发出多种IPF动物模型，其中博来霉素小鼠模型应用最为广泛。博来霉素是一种化疗药物，已知可诱导肺泡上皮细胞的DNA损伤，从而在人类中引起急性肺损伤和肺纤维化。在IPF的啮齿类动物模型中，博来霉素可通过多种途径给予，最常用的是气管内注射（IT）。近年来研究表明，经口咽吸入（OA）技术在多种致纤维化剂的应用中与IT方法具有相当的效力，但副作用显著更少，且给药操作更为简便。本实验方案详细描述了通过OA途径将博来霉素递送至小鼠肺部的方法，并展示了后续数据分析定量的若干应用实例。该方法为利用这一广泛应用的动物模型研究IPF潜在分子机制提供了一种简单、快速且安全的手段。
引言
间质性肺疾病（ILD）是一组异质性疾病，其特征是肺泡腔、间质和远端气道发生进行性且不可逆的瘢痕化1。特发性肺纤维化（IPF）是ILD最常见的类型，中位生存期约为三年2。IPF最终为终末期疾病，仅部分患者可选择同种异体肺移植作为挽救性治疗。目前有两项经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于IPF的疗法，但二者均仅能延缓疾病进展速度，而无法使患者的肺功能稳定或改善3,4。目前已有大量研究致力于阐明IPF的发病机制并寻找新的治疗靶点。研究IPF发病过程存在多种动物模型，每种模型均有其优缺点5。尽管尚无单一模型能够完全模拟人类疾病的复杂性，但这些模型仍为理解IPF的分子机制提供了重要见解，并可辅助转化医学研究。
博来霉素小鼠模型仍然是特发性肺纤维化（IPF）研究中最广泛使用且特征最明确的体内模型6。博来霉素是一种肽类药物，可诱导单链和双链DNA断裂。自1962年被发现以来，博来霉素已被证实对多种癌症具有治疗作用，包括睾丸肿瘤和淋巴瘤；然而，其临床应用受到剂量依赖性肺炎及继发性肺纤维化的限制7,
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方案
本研究中描述的动物实验均在加州大学洛杉矶分校动物研究委员会（ARC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案（ARC-2021-025，ARC-2010-039）下进行。实验全程严格遵守所有关于实验动物使用的州级和联邦法规及政策。动物饲养于加州大学洛杉矶分校动物护理设施中，并由该校实验室与动物医学部（DLAM）的专业技术人员在无病原体条件下进行照护。野生型C57BL/6小鼠通过商业途径获得，并适应环境至少14天。实验选用8至12周龄的雄性小鼠，平均体重为20–25 g。雌性小鼠也可使用，但需确保各实验组之间动物的性别和年龄相匹配27。本研究中所用动物、试剂和设备的具体商业信息列于材料表中。
1. 博来霉素的口咽部给药
- 博来霉素的制备
注意：使用药用级博来霉素，以确保动物之间及实验之间的结果具有一致性和可重复性。博来霉素的给药剂量应以每千克动物所用药物单位（U/kg）计算，而非以每千克毫克（mg/kg）计算。- 将博来霉素粉末溶于无菌的药用级 PBS 中，配制成 10 U/mL 的储备液。博来霉素应现配现用 在化学通风橱中操作，并采取适当的化疗防护措施。将分装样品在 -20 °C 保存，可存放长达 6 个月。
- 配制最终工作浓度。剂量依据体重计算（0.5–3 U/k....
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结果
本方案概述了在博来霉素小鼠模型中采用经口咽部吸入给药的途径。在这些实验中，动物分别接受博来霉素（0.75 U/kg 体重）或磷酸盐缓冲液（PBS）假手术对照处理。在第7、14和21天，小鼠被处死，取出肺组织并进行固定，具体方法如前所述35。采用苏木精-伊红（H&E）组织学染色评估纤维化程度。到第7天时，与PBS对照组相比，可见肺泡隔出现纤维化改变以及轻微的炎性/纤维化改变（图3A、B）。到第14天时，出现更大范围且融合更明显的纤维化区域，并伴有正常肺泡结构的显著破坏（图3C）。至第21天，这些显著的纤维化改变仍然持续存在（图3D）。这些组织病理学改变通过改良的Ashcroft评分系统进行量化29，结果显示第14天与第21天之间的纤维化程度相似（图3E）。
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讨论
本文提供了通过口咽部吸入法给予博来霉素以建立小鼠肺纤维化模型的详细视频实验方案。此外，我们还介绍了口咽部吸入博来霉素后，用于定量分析纤维化及炎症变化的潜在后续应用方法。
尽管没有任何一种动物能完全模拟人类疾病的复杂性，但博来霉素小鼠模型在过去五十年中一直被使用，至今仍是研究特发性肺纤维化（IPF）发病机制应用最广泛的模型。36有多种方法可在啮齿类动物模型中给予博来霉素，包括 通过 经气管（IT）、经鼻（IN）、静脉内（IV）、腹腔内和皮下注射6尽管静脉给药更接近于人类博来霉素诱导的肺炎的发病机制，但气管内给药更为常用；单次给药即可诱导纤维化，避免了高剂量带来的全身毒性，且更具成本效益8IT 给药需要进行气管插管或颈部手术暴露并行气管切开术，两者均需要深度镇静以及较高的操作技术，且伴随显著的围操作期发病率和死亡率。IN 给药是 IT 给药的一种合理替代方式，但已被证明会导致分布模式更不均匀以及肺损伤
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致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）露丝·L·柯施斯坦国家研究服务奖（NRSA）机构研究培训基金（T32）的支持，该基金授予 RW（编号：2T32HL072752-16）。作者还感谢索尔和乔伊斯·布兰德曼基金会肺健康中心提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗小鼠 CD45，Brilliant Violet 605 | BioLegend | 103155 | |
| 抗小鼠 CD64，AlexaFluor 647 | BioLegend | 139322 | |
| 抗小鼠 Ly6G，AlexaFluor 700 | BioLegend | 127622 | |
| 抗小鼠 MerTK，PE/Cy7 | BioLegend | 151522 | |
| 抗小鼠 SiglecF，PE | BD Biosciences | 552126 | |
| BD 鲁尔接头适配器 | Fisher Scientific | 13-681-21 | |
| 博来霉素 | McKesson | 1129996 | 来自 NorthStar Rx 16714088601 |
| 小鼠经气管插管套件 | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| 可固定活/死细胞染料（紫色） | Thermo | L34955 | |
| FlowJo v10 软件 | FlowJo | ||
| gentleMACS 组织解离仪 | Miltenyi | 130-093-235 | |
| 羟脯氨酸检测试剂盒 | Sigma | MAK463 | |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | |
| Moria 血管夹 | Fine Science Tools | 18350-11 | |
| 小鼠经气管插管套件 | Kent | ETI-MSE | |
| 移液器步进器 | Dymax | TI15469 | |
| 野生型 C57BL/6 小鼠 | Jackson Laboratories | JAX, stain #000664 |
参考文献
- Martinez, F. J., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17074(2017).
- Hutchinson, J., Fogarty, A., Hubbard, R., Mckeever, T. Global incidence and mortality of idiopathic pulmonary fibrosis: A systematic review. Eur Respir J. 46 (3), 7....
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重印与许可
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