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方法文章

小鼠肺纤维化模型中博来霉素的口咽部给药

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DOI：

10.3791/67953

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2025年5月9日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary & Critical Care, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Medicine, Pulmonary & Critical Care Section, VA Greater Los Angeles Healthcare System, 3Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

本方案演示了在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中应用的经口咽部吸入技术。

摘要

间质性肺疾病（ILD）是一组以肺实质进行性且常不可逆的瘢痕形成为特征的疾病谱，其中最常见的是特发性肺纤维化（IPF）。目前已开发出多种IPF动物模型，其中博来霉素小鼠模型应用最为广泛。博来霉素是一种化疗药物，已知可诱导肺泡上皮细胞的DNA损伤，从而在人类中引起急性肺损伤和肺纤维化。在IPF的啮齿类动物模型中，博来霉素可通过多种途径给予，最常用的是气管内注射（IT）。近年来研究表明，经口咽吸入（OA）技术在多种致纤维化剂的应用中与IT方法具有相当的效力，但副作用显著更少，且给药操作更为简便。本实验方案详细描述了通过OA途径将博来霉素递送至小鼠肺部的方法，并展示了后续数据分析定量的若干应用实例。该方法为利用这一广泛应用的动物模型研究IPF潜在分子机制提供了一种简单、快速且安全的手段。

引言

间质性肺疾病（ILD）是一组异质性疾病，其特征是肺泡腔、间质和远端气道发生进行性且不可逆的瘢痕化1。特发性肺纤维化（IPF）是ILD最常见的类型，中位生存期约为三年2。IPF最终为终末期疾病，仅部分患者可选择同种异体肺移植作为挽救性治疗。目前有两项经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于IPF的疗法，但二者均仅能延缓疾病进展速度，而无法使患者的肺功能稳定或改善3,4。目前已有大量研究致力于阐明IPF的发病机制并寻找新的治疗靶点。研究IPF发病过程存在多种动物模型，每种模型均有其优缺点5。尽管尚无单一模型能够完全模拟人类疾病的复杂性，但这些模型仍为理解IPF的分子机制提供了重要见解，并可辅助转化医学研究。

博来霉素小鼠模型仍然是特发性肺纤维化（IPF）研究中最广泛使用且特征最明确的体内模型6。博来霉素是一种肽类药物，可诱导单链和双链DNA断裂。自1962年被发现以来，博来霉素已被证实对多种癌症具有治疗作用，包括睾丸肿瘤和淋巴瘤；然而，其临床应用受到剂量依赖性肺炎及继发性肺纤维化的限制7,8。这种肺毒性在小鼠中可被重现。单次给药后，经过初期的炎症阶段，纤维化通常在第5天左右开始出现，在第14至21天达到高峰9,10,11（图1）。大约6周后，纤维化可自发消退，但通过重复给药可实现持久的纤维化改变12。由于该模型具有短暂性和炎症主导的特点，因此存在一些固有的局限性13；然而，它提供了一个快速、稳定且可重复的系统，有助于初步填补本领域在间质性肺病（ILD）认知上的重大空白，并使研究人员能够在过去五十年间进行结果比较。其他建模方法包括石棉肺和二氧化硅小鼠模型，其病程时间相似（第14至28天）6,14,15,16。然而，这些模型产生的组织学模式更符合尘肺病而非IPF，且需使用空气传播的颗粒物，因此需要谨慎操作。此外，还存在一些基于上皮细胞驱动的转基因表达的动物模型，例如白喉毒素和TGF-β1模型。这些模型可重现IPF中非炎症性的II型肺泡上皮细胞损伤，但所需时间略长（21–30天），并需要使用特殊动物品系，且必须与现有转基因模型进行回交。最后，通过腺病毒介导的细胞因子过表达（如TGF-β1、IL-1β和TNF-α）也已被证明可在啮齿类动物中诱导肺纤维化，通常在第14天即可观察到17,18,19。这类细胞因子过表达模型便于采用经鼻给药方式，但需要严格的病毒纯化与操作处理。

目前存在多种博来霉素给药方法，包括气管内（IT）、鼻内、腹腔内、皮下和静脉注射途径6。其中IT给药最为常用，传统上需通过气管插管或外科气管切开术20实现，这两种方法均需要深度镇静，技术要求高，且与围手术期的发病率和死亡率相关。近年来，经口咽部吸入（OA）技术被证明与IT给药具有相当的疗效，但副作用显著减少，且操作更为简便14,21,22,23,24,25,26。本文中，我们提供了一套详细的可视化操作流程，介绍将博来霉素通过OA方法递送至小鼠肺部的技术，并概述了多种可用于数据分析的下游应用方法。

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方案

本研究中描述的动物实验均在加州大学洛杉矶分校动物研究委员会（ARC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案（ARC-2021-025，ARC-2010-039）下进行。实验全程严格遵守所有关于实验动物使用的州级和联邦法规及政策。动物饲养于加州大学洛杉矶分校动物护理设施中，并由该校实验室与动物医学部（DLAM）的专业技术人员在无病原体条件下进行照护。野生型C57BL/6小鼠通过商业途径获得，并适应环境至少14天。实验选用8至12周龄的雄性小鼠，平均体重为20–25 g。雌性小鼠也可使用，但需确保各实验组之间动物的性别和年龄相匹配27。本研究中所用动物、试剂和设备的具体商业信息列于材料表中。

1. 博来霉素的口咽部给药

  1. 博来霉素的制备
    注意：使用药用级博来霉素，以确保动物之间及实验之间的结果具有一致性和可重复性。博来霉素的给药剂量应以每千克动物所用药物单位（U/kg）计算，而非以每千克毫克（mg/kg）计算。
    1. 将博来霉素粉末溶于无菌的药用级 PBS 中，配制成 10 U/mL 的储备液。博来霉素应现配现用 在化学通风橱中操作，并采取适当的化疗防护措施。将分装样品在 -20 °C 保存，可存放长达 6 个月。
    2. 配制最终工作浓度。剂量依据体重计算（0.5–3 U/kg），并根据所使用的博来霉素类型及实验目的（如存活率观察或致死剂量）进行必要调整。
    3. 根据需要调整给药的最终体积。在本研究中，将博来霉素稀释至0.375 U/mL，按25 g小鼠给药体积为50 μL计算，最终工作浓度为0.75 U/kg。

2. 麻醉诱导

  1. 通过将氯胺酮和赛拉嗪用PBS稀释至工作浓度（分别为10 mg/mL和1 mg/mL）来配制麻醉混合液。此步骤应在无菌条件下使用药用级试剂，并按照机构批准的方案进行。
  2. 使用27.5 G针头和1 mL注射器，按每克动物体重10 µL的剂量经腹腔注射给药（工作剂量：氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）。
    1. 确保小鼠已充分麻醉，对有害刺激（如脚趾夹捏）无反应。麻醉效果应在5分钟内出现。若仍有反应，以20 µL为增量追加氯胺酮/赛拉嗪，直至达到理想的麻醉深度。麻醉期间涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。
      注：与其他注射用麻醉剂和镇静剂相比，氯胺酮因其良好的副作用谱而被优先选用。其对血流动力学（包括心率和呼吸频率）的影响较小。吸入用异氟烷可作为替代麻醉剂。在本研究中，优先选用氯胺酮/赛拉嗪，因其可产生持久镇静作用，并在给药后最大程度减少博来霉素引起的咳嗽或反流。

3. 口咽给药

  1. 待小鼠充分麻醉后，将其悬挂在操作平台上，角度为60°–80°，以前门齿固定，以有效打开口咽部（图2A）。
  2. 使用平滑的微血管夹闭合鼻腔通路，迫使小鼠通过口咽部呼吸。
  3. 使用镊子将舌头从口咽部向外牵拉。
  4. 使用带短平头接头的移液器，将所需体积的博来霉素或生理盐水对照液轻柔地滴入口咽后部。确保液体气泡在肉眼下清晰可见（图2B）。
  5. 持续固定舌头位置，直至动物吸入溶液。此过程通常在视觉上甚至听觉上均可明显察觉。
    注意：若动物迅速吸入溶液，口咽后部的液体可视时间可能短暂，仅数秒内。无论何种情况，若操作成功，动物将表现出呼吸模式的突然且短暂改变，出现快速而浅表的呼吸。液体可能出现冒泡现象，进一步提示液体已成功进入下呼吸道。偶尔可能出现咳嗽。这通常仅涉及极少量博来霉素溶液，不会影响实验结果，动物仍可保留在研究中。应避免重复给药，因其会增加窒息风险并改变最终按体重计算的给药剂量。
  6. 确认吸入完成后，小心移除鼻夹。
  7. 将动物保持悬挂姿势观察15–30秒，以确保无博来霉素溶液反流，随后将其放回笼中。
    注意：建议最大给药体积不超过50 µL，以尽量降低窒息风险。根据所需的博来霉素剂量及小鼠体重，调整博来霉素溶液的浓度。练习该技术时，可使用水溶性染料（如伊文思蓝）确认溶液是否进入下呼吸道而非胃内14。

4. 动物恢复

  1. 处理后，将动物侧卧于笼内，并在笼下放置加热垫以维持热中性状态。
  2. 监测小鼠直至其完全清醒。通常需要1-2小时，具体时间取决于所用氯胺酮剂量及动物的代谢情况。可轻轻夹捏脚趾，并保持动物体温正常以促进苏醒。
  3. 每天对小鼠进行临床监测，观察体重、理毛行为、活动水平及呼吸状态的变化。与其他博来霉素给药方法类似，动物在14-21天的实验过程中可能出现显著体重下降，这是该模型有效性的关键指标。
  4. 根据ARC和IACUC规程，若体重下降超过动物初始体重的20%，则需实施安乐死。体重下降的发生率和严重程度取决于所用博来霉素的剂量以及小鼠的群体特征（见上文）。

5. 组织采集、处理及终点分析

  1. 根据实验目的和预期的时间点，按照IACUC规程对小鼠实施安乐死，并在适当时间点采集其肺组织28。 与对照组相比，博来霉素的作用通常在肉眼观察下已明显可见，表明给药成功。 在本研究中，小鼠分别于第7、14和21天处死。
  2. 进行组织学分析时，整块解剖取出肺组织，并在4%多聚甲醛（PFA）中固定24小时。随后按照先前描述的方法进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（H&E）染色和/或马松三色染色28,29,30。
  3. 进行 胶原含量测定时，将右肺组织匀浆，使用 commercially available kit（见材料表）检测羟脯氨酸含量，方法如前所述31。
  4. 进行流式细胞术分析时，使用组织解离仪和酶解溶液消化右肺组织，以获得单细胞悬液。流式细胞术染色与分析步骤参照先前文献32,33,34进行。

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结果

本方案概述了在博来霉素小鼠模型中采用经口咽部吸入给药的途径。在这些实验中，动物分别接受博来霉素（0.75 U/kg 体重）或磷酸盐缓冲液（PBS）假手术对照处理。在第7、14和21天，小鼠被处死，取出肺组织并进行固定，具体方法如前所述35。采用苏木精-伊红（H&E）组织学染色评估纤维化程度。到第7天时，与PBS对照组相比，可见肺泡隔出现纤维化改变以及轻微的炎性/纤维化改变（图3A、B）。到第14天时，出现更大范围且融合更明显的纤维化区域，并伴有正常肺泡结构的显著破坏（图3C）。至第21天，这些显著的纤维化改变仍然持续存在（图3D）。这些组织病理学改变通过改良的Ashcroft评分系统进行量化29，结果显示第14天与第21天之间的纤维化程度相似（图3E）。

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讨论

本文提供了通过口咽部吸入法给予博来霉素以建立小鼠肺纤维化模型的详细视频实验方案。此外，我们还介绍了口咽部吸入博来霉素后，用于定量分析纤维化及炎症变化的潜在后续应用方法。

尽管没有任何一种动物能完全模拟人类疾病的复杂性，但博来霉素小鼠模型在过去五十年中一直被使用，至今仍是研究特发性肺纤维化（IPF）发病机制应用最广泛的模型。36有多种方法可在啮齿类动物模型中给予博来霉素，包括 通过 经气管（IT）、经鼻（IN）、静脉内（IV）、腹腔内和皮下注射6尽管静脉给药更接近于人类博来霉素诱导的肺炎的发病机制，但气管内给药更为常用；单次给药即可诱导纤维化，避免了高剂量带来的全身毒性，且更具成本效益8IT 给药需要进行气管插管或颈部手术暴露并行气管切开术，两者均需要深度镇静以及较高的操作技术，且伴随显著的围操作期发病率和死亡率。IN 给药是 IT 给药的一种合理替代方式，但已被证明会导致分布模式更不均匀以及肺损伤

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致谢

本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）露丝·L·柯施斯坦国家研究服务奖（NRSA）机构研究培训基金（T32）的支持，该基金授予 RW（编号：2T32HL072752-16）。作者还感谢索尔和乔伊斯·布兰德曼基金会肺健康中心提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗小鼠 CD45，Brilliant Violet 605BioLegend103155
抗小鼠 CD64，AlexaFluor 647BioLegend139322
抗小鼠 Ly6G，AlexaFluor 700BioLegend127622
抗小鼠 MerTK，PE/Cy7BioLegend151522
抗小鼠 SiglecF，PEBD Biosciences552126
BD 鲁尔接头适配器Fisher Scientific13-681-21
博来霉素McKesson1129996来自 NorthStar Rx 16714088601
小鼠经气管插管套件Kent ScientificETI-MSE
可固定活/死细胞染料（紫色）ThermoL34955
FlowJo v10 软件FlowJo
gentleMACS 组织解离仪Miltenyi130-093-235
羟脯氨酸检测试剂盒SigmaMAK463
Liberase TMRoche5401127001
Moria 血管夹Fine Science Tools18350-11
小鼠经气管插管套件KentETI-MSE
移液器步进器DymaxTI15469
野生型 C57BL/6 小鼠 Jackson LaboratoriesJAX, stain #000664

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