本文介绍了利用CsChrimson和GtACR2激活和抑制特定神经元的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）光遗传学操作方法。通过四项实验，应用光遗传学技术研究趋热性和味觉行为，揭示调控这些过程的神经机制。
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方法文章
用于光遗传学操控神经环路的行为学检测方法 黑腹果蝇
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
光遗传学已成为神经科学中的一项基本技术，能够通过光刺激精确控制神经元活动。本研究介绍了在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中易于实施的光遗传学实验装置。研究中使用了两种光遗传学工具：CsChrimson（一种红光激活的阳离子通道）和GtACR2（一种蓝光激活的阴离子通道），并应用于四种实验方法。其中三种方法涉及单只果蝇实验：（1）针对温度敏感性加热细胞的蓝光光遗传热趋向定位偏好实验；（2）激活苦味感知神经元的红光光遗传定位偏好实验；（3）激活甜味感知神经元的喙伸展反应实验。第四种方法（4）是利用多只果蝇进行的果蝇迷宫实验，用于评估回避行为。对神经活动在时间和空间上的操控能力，为理解感觉信息处理和决策过程提供了强有力的手段，凸显了光遗传学在推进神经功能研究方面的潜力。这些方法为未来的神经科学研究提供了可及且可靠的框架，有助于深入理解特定神经通路及其行为结果。
引言
光遗传学已成为神经科学领域中结合光学与遗传学的一项强大技术，通过光刺激实现对神经元活动的精确、非侵入性调控1在 黑腹果蝇 一种广泛使用的模式生物，光遗传学工具可实现对特定神经元的激活与抑制，使研究人员能够调控神经回路。在所使用的工具中，CsChrimson 和 GtACR（Guillardia theta 阴离子通道视紫红质）为神经元靶向提供了互补的方法。CsChrimson通道视紫红质是一种来自绿藻的红光敏感型阳离子通道，在红光照射下可通过去极化实现神经元激活，其峰值激活波长约为590 nm。2. CsChrimson 在组织穿透性方面优于先前的通道视紫红质，并可减少光诱导的行为伪影 果蝇 研究2相比之下，GtACR（包括GtACR2等变体）是一种光控氯离子通道，可通过超极化使神经元沉默。3,4GtACR2 传导阴离子，并可被蓝光激活，其最大激活波长约为 470 nm4CsChrimson 和 GtACR2 可被不同波长的光激活，从而确保对神经元活动进行精确且独立的调控，避免交叉激活5.
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方案
1. 菌株、果蝇饲养与果蝇吸取器
- 菌株与保种
- 实验所用菌株包括 HC-Gal410、Gr5a-Gal420（Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592）、Gr66a-Gal421（BDSC: 57670）、UAS-GtACR23、UAS-CsChrimson2（BDSC: 55136）。将果蝇在标准玉米粉培养基上，于25 °C、12小时光照:12小时黑暗循环条件下饲养。
注意：1 L 玉米粉培养基包含 1 L dH2O、79 g 葡萄糖、7.5 g 琼脂、24 g 酵母粉、57 g 玉米粉、2.1 g 对羟基苯甲酸甲酯（溶于11.1 mL 乙醇中）、6 g 酒石酸钠钾四水合物以及0.9 g 氯化钙。
- 实验所用菌株包括 HC-Gal410、Gr5a-Gal420（Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592）、Gr66a-Gal421（BDSC: 57670）、UAS-GtACR23、UAS-CsChrimson2（BDSC: 55136）。将果蝇在标准玉米粉培养基上，于25 °C、12小时光照:12小时黑暗循环条件下饲养。
- 果蝇饲养与实验准备
- 挑选0至3日龄的果蝇。实验时果蝇将为3至6日龄，以确保年龄一致性（图1A....
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结果
单果蝇蓝光光遗传学趋温位置偏好实验
共测试了四种条件：室内光照且无ATR补充（室内光，ATR -）、室内光照且有ATR补充（室内光，ATR +）、蓝光照射且无ATR补充（蓝光，ATR -），以及蓝光照射且有ATR补充（蓝光，ATR +）。前三种条件作为对照。在对照实验中，果蝇会避开31 °C一侧。而在蓝光照射并补充ATR的条件下，果蝇对25 °C与31 °C两侧无显著偏好，表明通过激活GtACR2成功抑制了HC神经元（图2A）。
单果蝇红光光遗传学位置偏好实验
共测试了四种条件：室内光照且无ATR补充（室内光，ATR -）、室内光照且有ATR补充（室内光，ATR +）、红光照射且无ATR补充（红光，ATR -）以及红光照射且有ATR补充（红光，ATR +）。前三种条件作为对照。对照组中的果蝇未表现出位置偏好，两侧分布相似。在补充ATR的情况下进行红光激活（红光，ATR +）可引导果蝇避开红光区域，表明苦味感知神经元被CsChrimson激活.......
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讨论
光遗传学操控通过实现对神经回路的时空精确控制，彻底改变了神经科学领域27神经回路由通过突触相互连接的神经元群体组成，激活后可执行特定功能。 果蝇 全脑连接组已完成，为脑内突触通路提供了全面深入的解析 果蝇 脑28,29尽管连接组能够预测某些行为背后的潜在神经环路机制，但仍需进一步的实验验证。通过结合遗传学工具与行为检测方法，光遗传学操控为探究神经环路在行为功能中的作用提供了强有力的手段。例如，整合 转- 与光遗传学技术结合使用，可激活或沉默下游神经元，使研究人员能够确定单个突触后神经元在行为学上的意义5,30.
本研究建立了简单、易行且可重复的光遗传学实验方案，用于行为学检测 黑腹果蝇通过设计四种靶向不同神经环路的实验方法，我们展示.......
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披露
作者声明，本文的发表不存在任何利益冲突。所有作者均已披露任何潜在的利益冲突，并确认他们与本研究所述工作无任何可能产生影响的财务或个人关系。
致谢
所有图示的示意图均使用 Biorender.com 制作。本研究由 NIH R01GM140130（https://www.nigms.nih.gov/）资助，受资助者为 L.N.。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1000 mA LED 驱动器 | Luxeon Star | 3021-D-E-1000 | |
| 5 mL VWR培养管，塑料，带双位置盖 | VWR | 60818-664 | |
| 780 长通滤光片 / 红外 780 nm 100 mm × 100 mm | 李氏滤光片 | BH #LE8744 | 裁剪至约 47 x 100 以适配塑料盖 |
| Agfabric 6.5英尺 x 15英尺 昆虫防护网 园艺遮网 用于保护植物、蔬菜、花卉和水果 | 家得宝 | EIBNW6515 | |
| 全反式视黄醛 | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | |
| 铝板（30.5 cm × 30.5 cm × 0.6 cm） | 亚马逊 | 购自亚马逊 | |
| 黑色塑料盒 | LI-COR | 929-97101 | |
| 无水氯化钙 25克 | 赛默飞世尔科技 | AC297150250 | |
| 配备 Exmor R CMOS 传感器的 CX405 Handycam | 索尼 | HDR-CX405 | |
| 埃尔默’s “学校用胶水” | 埃尔默 | ||
| 乙醇，纯品（200度） | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Fisherbrand Isotemp 加热磁力搅拌器 | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| 果蝇品系：Gr5a-Gal4 | 布卢明顿果蝇品系中心 | 57592 | |
| 果蝇品系：Gr66a-Gal4 | 布卢明顿果蝇品系中心 | 57670 | |
| 果蝇品系：HC-Gal4（II） | Dr. Marco Gallio 实验室 | 一份善意的馈赠 | |
| 果蝇品系：UAS-CsChrimson | 布卢明顿果蝇品系中心 | 55136 | |
| 果蝇品系：UAS-GtACR2/TM6B | Dr. Quentin Gaudry 实验室 | 一份善意的馈赠 | |
| Flystuff 62-101 黄玉米粉（11.3 千克），黄色，11.3 千克/单位 | Genesee Scientific | 62-101 | |
| Flystuff 62-107 无活性干酵母，10 千克，营养片状，10 千克/单位 | Genesee Scientific | 62-107 | |
| Flystuff 66-103 Nutri-Fly 果蝇培养基琼脂，石花菜，100目，5公斤（11.02磅）/单位 | Genesee Scientific | 66-103 | |
| FreeMascot OD 8+ 190 nm–420 nm / 600 nm–1100 nm 波长紫光/红光/红外激光防护眼镜 | FreeMascot | B08LGMQ65S | 从亚马逊购买 |
| GoPro Hero8 Black | GoPro | 6365359 | |
| LEE Filters 100×100 毫米红外 #87 红外聚酯滤光片 | B&H 照片 | LE8744 | |
| 长通滤光片，彩色玻璃，50.8 × 50.8 mm，截止波长830 nm，RG830 | 纽波特 | FSQ-RG830 | |
| 对羟基苯甲酸甲酯，99%，Thermo Scientific Chemicals | 赛默飞世尔科技 | 126960025 | |
| MicroWell 微孔板，60 孔，低矮型，无菌聚苯乙烯 | 赛默飞世尔科技 | NUNC 439225 | 盖子用作 "塑料盖" |
| Olympus Plastics 24-160RS, 1000 µL 奥林巴斯人体工学低吸附移液器吸头，盒装，无菌，每单元8盒，每盒96个吸头 | Eppendorf | 24-160RS | |
| Parafilm M 封口膜 | Heathrow Scientific | HS234526B | 4 英寸 × 125 英尺 |
| 氯化钾，ACS，99.0-100.5% | 赛默飞世尔科技 | AA1159530 | |
| Prism | GraphPad | 版本 9 | 数据分析软件 |
| Samco 刻度移液管 | 赛默飞世尔科技 | 225 | 3 mL |
| 载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-2 | 5 mm × 75 mm × 1.0 mm |
| 体视显微镜 | OLYMPUS | CZ61 | |
| 泡沫箱（27 cm 高度） × 22 cm 宽度 × 16 cm 长度） | |||
| 蔗糖 | Fisher Scientific | 225911 | |
| 表面温度探头 | 弗卢克 | 80PK-3A | |
| 注射器 | BD Integra | 305270 | |
| Tate & Lyle 457 葡萄糖，Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 葡萄糖，Tate && Lyle，粉末，50 磅/单位 | Genesee Scientific | 62-113 | |
| 可追溯校准式多位数热电偶温度计 | 可追溯于 cple-parmer | UX-91210-07 | Fisherbrand Traceable BigDigit K型温度计 |
| 三重蓝光LED右侧 | LEDSupply | 07007-PB000-D | 470 nm |
| 三重红光LED右舷灯 | LEDSupply | 07007-PD000-F | 627 nm |
| Tygon PVC 透明管 1/4" ID，3/8" 光密度，5 英尺长度 | McMaster-Carr 供应公司 | 6516T21 | |
| Univivi IR 照明器，850 nm 12 颗 LED 广角红外照明器，用于夜视 | Univivi | 4331910725 | |
| Wakefield Thermal 25.4 mm 圆形散热片星形 LED 基板 - 882-100AB | Wakefield-Vette | 882-100AB | |
| 无线演示器 | DinoFire 商店 | B01410YNAM | 购自亚马逊 |
参考文献
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Mauss, A. S., Busch, C., Borst....
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重印与许可
