方法文章

一个 体外 导尿管相关尿路感染的膀胱模型

DOI：

10.3791/67966

⸱

2025年6月24日

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

本文内容

摘要

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本方案详细描述了一种 体外 导管化尿路模型，可用于研究模拟导管相关性尿路感染中浮游状态及生物膜相关细菌群体。该模型还可进一步用于评估旨在控制尿路感染的抗菌产品的有效性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

导管相关性尿路感染（CAUTI）是最常见的医疗相关感染之一。尿道导管上生物膜的形成是此类感染发病机制中的关键环节，常导致导管堵塞以及肾盂肾炎和败血症等严重并发症。建立并研究该环境下生物膜形成的模型，对于深入理解CAUTI发病机制的基本原理，以及开发和开展有效的治疗策略以控制CAUTI和导管堵塞的稳健临床前评估均至关重要。本方案描述了一种 体外 导尿管化尿路模型，可模拟临床实践中使用的导尿管密闭引流系统，从而在具有代表性的条件下促进对导管相关性尿路感染（CAUTI）及导管生物膜形成的研究所用。此外，本方案详细阐述了该模型的应用方法 体外 用于评估抗菌导管维护产品有效性的膀胱模型，包括目前在英国国家医疗服务体系（NHS）供应链上提供的产品。

引言

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导尿管是最常用的医疗器械之一，在急性护理机构中的估计使用率为19%1,2,3导管主要用于膀胱功能障碍时辅助管理尿液排出，通过直接插入膀胱，使尿液得以从膀胱排出 通过 一个中央管腔2,3导尿管可间歇性使用，即定期插入膀胱以引流尿液；也可使用留置导尿管，即将导管长期留置于膀胱内 原位 在膀胱中持续引流尿液3,4尽管导尿管被广泛使用，但其是导致尿路感染（UTIs）的最主要危险因素，而尿路感染约占医疗机构相关感染的五分之一。5,6事实上，导管本身通常成为微生物定植的初始部位，为尿路致病菌提供附着表面，进而定植于泌尿道1,6,7,8几乎所有接受长期持续导尿（导尿管留置 ≥28 天）的患者都会发生菌尿，导尿管留置每增加一天，发生菌尿的风险约上升 5% 原位2,9,10,11相应地，约80%的尿路感染与使用导尿管有关6.

导管相关性尿路感染（CAUTIs）给医疗服务带来了沉重负担，通常比非复杂性尿路感染引起更严重的上尿路感染症状（如输尿管炎和肾盂肾炎），并增加继发性血流感染的风险1,7,12,13,14。CAUTIs的标准治疗包括抗生素疗法，然而由于导管表面形成复杂的生物膜群落，这些感染通常对抗微生物治疗具有耐受性15,16,17,18,19,20。事实上，据估计 约80%的CAUTIs由可形成生物膜的尿路致病菌引起19。生物膜的形成特征是细菌细胞附着于导管表面，并在大量胞外多聚物基质（EPS）中形成嵌入式群落21,22,23,24。EPS的产生是生物膜群落的显著特征，也是生物膜相关细胞表现出多种新特性（如对抗微生物药物和免疫清除的抵抗力增强）的主要原因21,22,24。EPS可通过物理屏蔽细胞、保护其免受抗微生物剂或免疫效应分子的作用而直接参与这些表型的形成，也可通过促进生物膜群落其他方面的发育（如生物膜的理化微环境及持留细胞的形成）而间接发挥作用23,24,25,26。此外，某些尿路致病菌（包括占CAUTIs约11%的Proteus spp.）具有强效的脲酶，能够水解尿液中的尿素，导致尿液pH总体升高2,27,28,29,30。pH升高伴随钙和镁磷酸盐晶体的沉淀，这些晶体可被纳入生长中的生物膜，导致生物矿化并形成致密的结晶性生物膜结构，从而堵塞导管。这些结晶性生物膜不仅使治疗变得困难，还可能引发严重并发症，如肾盂肾炎和败血症2,28,31,32,33,34。

导尿管化泌尿道中复杂的环境生态位，以及生物膜形成在这些感染中的重要作用，为导尿管相关性尿路感染（CAUTI）发病机制的研究带来了特殊挑战。目前用于研究和量化生物膜形成的实验室模型，例如基于96孔板的检测方法，虽然简单且广泛应用，但并不适用于CAUTI中生物膜（尤其是结晶性生物膜）形成的研究。例如，这些模型未能考虑CAUTI生态位中的关键因素，如尿液所提供的复杂营养环境、导尿管表面特性对细菌黏附及后续生物膜生成的影响，以及尿液介质的持续流动35,36,37,38,39,40。此外，用于测定尿路致病菌抗菌敏感性的常规检测方法，往往不能真实反映临床实际情况。最小抑菌浓度（MIC）试验和微生物悬浮液检测常被用于推断CAUTI致病菌的抗菌敏感性，但通常未能模拟CAUTI环境中的重要变量，例如导尿管的存在及其所引发的生物膜形成对抗菌药物敏感性可能产生的影响41,42,43。

本研究详细介绍了实验的建立与运行过程 体外 模拟导尿管化尿路环境并复制临床实践中所用标准导尿管密闭引流系统的膀胱模型，最初由 Stickler 等人描述。44 1999年（图1）该模型采用标准尺寸的Foley导尿管（目前可在NHS供应链获得）以及人工尿液培养基（AUM），后者由Nzakizwanayo等人先前所述。45以模拟导管相关性尿路感染（CAUTI）及生物膜的形成。 体外 膀胱模型由一个双层玻璃腔室构成，该腔室作为 "膀胱" 并通过一个出口将导尿管插入中央玻璃腔室。在中央玻璃腔室的顶部有一个入口，用于向其中注入AUM "膀胱" 使用蠕动泵以生物学相关的流速通过导管输送液体 通过 将引流眼孔连接至废液袋。此外，外层腔室连接至水浴循环系统，可使模型保持在恒定温度。 体外 膀胱模型可进行接种 通过 中央腔室，从而可在具有生物学代表性的微环境中研究导管相关性尿路感染（CAUTI）病原体。此外，由于模型已插入导管并持续灌注新鲜人工尿液培养基（AUM），因此可对浮游态和生物膜相关细胞的生长及群体动态进行研究。

以往的研究已利用 体外 用于多种应用的膀胱模型，包括对重要导管相关尿路感染病原体中生物膜形成的基础研究，包括 奇异变形杆菌 和 大肠杆菌 43,45,46,47,48,49此外，该 体外 该模型已被用于评估旨在控制导管相关性尿路感染（CAUTI）或预防堵塞的产品的有效性50,51,52近年来，研究模型已被用于确定与抗菌素耐药性（AMR）相关的适应性变化和突变是否影响生物膜形成及导尿管相关尿路感染（CAUTI）的发病机制 P. mirabilis43,46。该 体外 膀胱模型还被用于研究旨在治疗导管相关性尿路感染（CAUTI）的新型抗菌治疗方法，包括新配方的诊疗一体化导管涂层和噬菌体疗法。47,48本方案涵盖了设置与运行 体外 膀胱模型、分别对模型中和导尿管表面的可存活浮游态细胞及生物膜相关细胞进行计数，以及检测尿液pH值以监测脲酶的产生。此外，还详细描述了用于评估旨在治疗或预防导管相关性尿路感染（CAUTI）的抗菌产品的方案，包括目前在英国国家医疗服务体系（NHS）供应体系中可获取的膀胱冲洗液和抗菌润滑凝胶。

方案

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示意图展示 体外 膀胱模型的设置如图所示 图1. 体外 膀胱模型设计为可与标准弗利导尿管兼容（尺寸如图所示） 图1 与标准14法式导管兼容）。对所有物品进行灭菌 体外 膀胱模型设备，并在使用前将介质回路中使用的任何硅胶管夹紧。在整个装置设置过程中，必须严格遵守无菌操作技术。 体外 模型，建议在无菌条件下组装模型（即， 在II级微生物安全柜或层流罩中进行）。建议至少设置n = 5个重复，以确定统计学显著性 体外 膀胱模型实验。所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 人工尿液培养基的制备

注意：建议使用人工尿液培养基（AUM） 体外 由于实验需要大量培养基，以及人源尿液样本存在变异性，给膀胱模型的研究带来了挑战。本方案详细描述了AUM的制备方法，该方法在此前研究基础上进行了优化，以适用于后续实验。 体外 Nzakizwanayo 等人提出的膀胱模型. （最终体积 5 L）43,45,46,48,53,54.

  1. 制备AUM溶液1
    1. 称取以下化合物，并加入装有850 mL去离子水的1 L硼硅酸盐瓶中：3.25 g六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）2.6H2O)、23 g 氯化钠（NaCl）、11.5 g 无水硫酸钠（Na2SO4)，3.25 g 柠檬酸三钠（Na3C6H5O7)，0.1 g 草酸钠（Na2C2O4)，14 g 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)，8 g 氯化钾（KCl），5 g 氯化铵（NH₄Cl4Cl）、25 g 明胶和 5 g 胰蛋白胨大豆肉汤。
  2. 在搅拌AUM溶液的同时，使用pH计测量pH值，并根据需要滴加3 M NaOH或HCl，调节至5.75（± 0.02）。
    注意：调节AUM的pH时，应将NaOH/HCl逐滴加入，以防止溶液中的盐析出。
  3. AUM 经 pH 调整后，用去离子水定容至 1 L，并进行高压灭菌。
    注意：溶液灭菌后可在室温下保存最长三个月（若观察到沉淀或浑浊现象，应弃用AUM溶液1）。
  4. 分别配制AUM溶液2，加入125 g尿素（CH4N2O) 和 2.45 g 氯化钙（CaCl2) 加入无菌去离子水至无菌500 mL烧杯中，定容至400 mL。
    注意：配制钙尿素溶液2时会发生吸热反应，因此建议将AUM溶液2置于加热板/磁力搅拌器上搅拌并加热至约50 °C，以促进化合物溶解，防止溶液冻结。
  5. 尿素和氯化钙完全溶解后，使用真空泵和0.45 µm硝酸纤维素滤器对溶液2进行过滤除菌，并收集至无菌的500 mL玻璃瓶中。溶液2经除菌后可在4 °C下稳定保存三个月，或在室温下稳定保存一个月。
    注意：若观察到沉淀或浑浊现象，应弃用AUM溶液2。
  6. 在超净工作台或II级生物安全柜中，将AUM溶液1和溶液2与3.6 L无菌去离子水在无菌的5 L玻璃抽滤瓶中无菌混合。AUM应呈淡黄色且透明。
  7. 使用血清移液管从总AUM体积中移取50 mL，分装至一个50 mL离心管中，留作后续使用。
  8. 使用橡胶塞或铝箔密封吸引瓶，并在室温下放置直至 体外 模型被组装。
  9. 无菌条件下从50 mL AUM分装液中取出10 mL，保留剩余溶液用于接种物制备。使用pH计测量10 mL AUM分装液的pH值，应为约pH 6.1（±0.2）。配制好的AUM在室温下可稳定保存约一个月，若出现沉淀或浑浊应予以弃用。

2. 体外 膀胱模型设置

  1. 将 Foley 导尿管插入中央玻璃腔室中 体外 膀胱模型（示意图详见 图1用提供的无菌水注射器充盈球囊以固定导管位置，并将废液袋连接到导管端口。
  2. 连接 体外 膀胱模型装置45 至 AUM 储液槽 通过 连接管路。根据制造商的说明，将培养基回路管路连接至蠕动泵，确保管路具有适当张力且未被拉伸。
  3. 连接 体外 将膀胱模型固定在支架上，并在模型下方的支架上固定废液袋，以确保液体流经模型 通过 重力
  4. 将膀胱模型的外腔连接至循环水浴装置 通过 硅胶管（图1B将水浴锅温度设定为37 °C，并开启水浴循环泵。
    1. 在接种前，将水浴运行30分钟 在 体外膀胱模型实验过程中，需确保温度稳定在37 °C，并在整个实验期间维持水浴的水位在适当高度。
  5. 移除培养基管路上的所有夹子，并将蠕动泵设置为以约0.75 mL/min的流速运行，以模拟人体尿液生成量（约1080 mL/天）。实际流速将在实验过程中计算。
  6. 运行 AUM 通过 体外 膀胱模型 通过 在接种前，使用蠕动泵运行30分钟，以确认培养基流速稳定且无菌引流系统完好无损。
  7. 在实验前，排空废液袋中积聚的培养基。可通过测量培养基体积来计算精确的流速（详见步骤4）。

3. 接种 体外 膀胱模型

  1. 准备过夜培养物 体外 通过将固体琼脂上生长的细菌菌落环悬于10 mL LB肉汤中，制备膀胱模型。在37 °C下振荡培养过夜。
    注意： 体外 膀胱模型可用于研究多种导管相关性尿路感染（CAUTI）病原体，包括产尿素酶菌株，例如 奇异变形杆菌，且可相应地调整所用的培养基。
  2. 将过夜培养物的全部体积在 4,500 x g 室温孵育10分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于10 mL AUM中，测定OD值595 nm 使用分光光度计。
  3. 将重悬的菌液用OD值进行归一化处理595 nm 1.0 和最终体积为 10 mL 的 AUM，使用以下公式：
    Equation for static equilibrium; formula \( \frac{A_2 \times V_2}{A_1} = V_1 \); physics concept.
    其中，A1 是OD处的吸光度600 nm 过夜培养物的A2 是所需在 OD 处的吸光度600 nm 接种物的体积（1.0），V2 是所需的接种物体积（10 mL），以及 V1 是用于归一化的过夜培养物所需体积。
    注意：10 mL 的 OD595 nm 1.0 的悬液可确保模型接种时含有约 1010 大多数细菌菌株的菌落形成单位（CFU）（已验证） 奇异变形杆菌, 大肠杆菌, Enterococcus faecalis, 铜绿假单胞菌 和 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌），以复制已建立的感染。起始接种量可根据所用物种或拟模拟感染阶段的不同而调整（例如，可采用较低的接种密度来模拟早期感染）。47.
  4. 灭菌 体外 使用70%乙醇处理膀胱模型，并取下塞子（培养基入口），使内腔可接触。用血清移液管从膀胱模型内部体积中移除10 mL AUM。
    注意：接种与取样时 体外 从中央室取出模型时，操作应迅速且保持无菌，始终穿戴适当的个人防护装备，并定期用70%乙醇对手套和表面进行去污染处理。
  5. 接种 体外 膀胱模型 通过 使用完全归一化的10 mL悬浮液加入中心室，并用血清学移液管充分混匀。从中心室中移除10 mL液体 体外 使用移液管将膀胱模型中的液体转移，并分装至15 mL通用管中，用于后续的CFU/mL计算和pH测定。
  6. 用70%乙醇彻底消毒膀胱模型和塞子的外表面，并更换塞子。短暂恢复培养基流动，以确保中央腔室中的AUM液面达到观察孔位置，随后停止流动。
  7. 让培养物在膀胱模型中建立1小时，然后开启培养基流动 通过 蠕动泵以约0.75 mL/min的速度运行。
  8. 在接种物培养期间，从中央室采集的样品中制备稀释液。
    1. 将100 µL样品在900 µL无菌PBS中进行系列稀释，直至样品稀释至10⁻¹-7将稀释液在适当的固体培养基上每份点样10 µL，每个稀释度设三个重复，于37 °C过夜培养。
    2. 孵育结束后，计数每个稀释度平板上的菌落数，并计算初始接种物的准确CFU/mL。
      注意：如果使用会成群的物种，即 奇异变形杆菌使用无盐麦康凯琼脂（蛋白胨 20.0 g/L，乳糖 10.0 g/L，胆盐 5.0 g/L，中性红 0.075 g/L，琼脂 12.0 g/L），以确保单菌落仍清晰可见，便于计数。
  9. 孵育1小时后，开启培养基流 通过 启动蠕动泵 体外 膀胱模型，记录模型开启的时间。

4. 计算 体外 膀胱模型流速

  1. 一旦 体外 模型接种后启动培养基流，运行4小时。短暂暂停培养基流动，将废液袋中残留的全部AUM收集至容量瓶中 通过 引流口。记录收集到的体积。
    注意：流速可根据步骤2.7中收集的培养基体积进行计算，但通过延长模型运行时间（即建议运行4小时）可获得更准确的流速，因为这能降低培养基管路中残留空气对计算流速造成影响的可能性。
  2. 恢复培养基流 通过 蠕动泵，确保废液袋的排水口处于关闭状态，以维持无菌引流系统。
  3. 计算实际流速 体外 模型，请使用以下方程：
    Urine flow rate formula: volume/time, shown as an equation for medical analysis.
    注意：建议流速范围为 0.55–1.0 mL/min，以模拟人体尿液生成。
  4. 如果培养基流速超出可接受范围，则弃去该重复组，并调整蠕动泵的转速，使其处于可接受范围内。

5. 从浮游细胞中取样 体外 膀胱模型

注意： 体外 膀胱模型应在整个实验过程中定期取样，以监测种群动态。所有模型均应在接种后立即取样、在AUM流启动时取样、接种后4小时（此时计算流速）取样，以及在模型终止时取样（无论是因堵塞还是达到预设终点）。若运行模型以 >24 h时，建议每隔24 h取样一次以监测CFU/mL，用户可根据需要额外增加取样次数。

  1. 用70%乙醇对膀胱模型塞子进行去污处理，并取下塞子以接触中央腔室。
  2. 避开导尿管尖端和球囊，使用血清学移液管轻轻混匀中央腔室中的内容物。
  3. 使用血清学移液管从腔室中取出10 mL样品，并转移至无菌管中。立即用70%乙醇对塞子进行去污处理并重新安装，以完成无菌、封闭的引流回路。
  4. 用移液管从样品中取出1 mL，并分装至1.5 mL微量离心管中，用于系列稀释。
  5. 使用pH计测量剩余样品的pH值，确保样品充分混匀，并在使用前校准pH计。
  6. 对保留的1 mL分装样品进行系列稀释，并按此前步骤3.8所述方法接种至适当的固体培养基上，接种所有稀释梯度。
    注意：从膀胱模型中采集的浮游样品也适用于其他分析，包括基因组学或分子生物学应用（可选）。

6. 从生物膜相关细胞中取样 体外 膀胱模型

  1. 导管的移除与准备
    注意：体外膀胱模型的生物膜取样为终点分析，需使模型失活并取出导管进行后续处理。
    1. 将废液袋从导管上断开，并通过放气排空模型中残留的尿液。使用无菌镊子从模型底部取出导管。
    2. 将取出的导管置于无菌板上，使用无菌手术刀在所需位置进行切割分段（如图2所示）。
    3. 沿导管纵向切开各段以暴露管腔；然后使用无菌镊子将导管段在无菌PBS中浸洗3次，以去除非黏附性细胞。
      注意：若后续需对导管段进行成像分析（例如使用扫描电镜SEM），则应保留1 cm长的完整导管段（不作纵向切开），并在固定前用无菌纸巾吸除管腔内多余水分。
  2. 生物膜的破坏以进行CFU/mL计数
    注意：若生物膜具有显著结晶性或黏液状特征，破坏生物膜相关细胞的方案可能需要进一步优化。
    1. 将制备好的导管段置于0.25%胰蛋白酶溶液中，在37 °C孵育30分钟。所用胰蛋白酶体积应为刚好覆盖导管段所需的最小量；例如，对于一段垂直切割的1 cm导管段，1 mL的0.25%胰蛋白酶溶液已足够。
    2. 孵育后，将含有导管段的溶液超声处理10分钟。随后取出并弃去导管段。为灭活胰蛋白酶，应立即将细胞悬液用无菌PBS稀释，并按照步骤3.8所述方法接种至合适的固体培养基上进行CFU计数。
  3. 通过结晶紫染色定量导管生物膜
    1. 将制备好的导管段加入适当规格的平底多孔板孔中。加入适量0.1%结晶紫溶液，完全浸没导管段，在室温下静置孵育15分钟。同时应包含一段无菌导管段作为背景对照。
    2. 从孔板中取出导管段，转移至新的孔板中。每段导管用蒸馏水清洗两次。
    3. 清洗后，将导管段转移至另一新孔板中，加入33%乙酸覆盖。在室温下孵育15分钟。
    4. 将导管段从孔板中取出，使用酶标仪测定各重复孔在OD595 nm处的吸光度，以含有无菌导管段的孔作为背景对照。

7. 抗微生物药物敏感性试验在 体外 膀胱模型

注意：大多数用于控制导管相关性尿路感染的治疗方法均与标准弗利导管兼容，但使用前需确认其兼容性 体外 膀胱模型实验

  1. 抗菌润滑凝胶
    注意：为模拟导尿管插入时使用润滑剂的情况，此步骤应在步骤2.1中、插入弗利导尿管之前立即进行。插入导管后应立即连接模型，并省略步骤2.6，以避免凝胶在接种前被稀释和排出。接种应与导管插入在同一天进行。专为导尿管设计的润滑剂通常以单次使用、无菌的独立包装注射器提供，规格为6 mL或11 mL。约5 mL润滑剂足以填充膀胱模型的颈部并覆盖模型底部。
    1. 使用无菌技术，将含有润滑剂的注射器末端插入膀胱模型的颈部，注入5 mL凝胶以填充颈部并进入腔室基部。
    2. 旋转模型使基底均匀涂覆凝胶，然后将导尿管插入模型，推动导管尖端穿过凝胶，并通过常规充盈球囊固定导管。
    3. 将模型连接到其余装置，然后向模型管腔内注入尿液，直至尿液开始排出。一旦尿液开始从导管侧孔排出，立即停止泵运行，以防止接种前凝胶流失。
      1. 将模型孵育30分钟，使尿液温度升至37 °C，随后按照先前所述方法接种模型，以确保凝胶组分在尿液体积中的扩散时间保持一致。
    4. 按照步骤3.5所述接种模型，并在开启蠕动泵前孵育1小时。在开启泵的同时，取1 mL浮游菌样，按步骤3.8所述进行稀释涂布，用于菌落形成单位（CFU）计数。
  2. 灌注液
    注意：灌洗液通常以大量装或单个无菌一次性“袋装”形式提供。若使用单个灌洗液袋，需在实验前确认其与所用导管的引流口兼容。若使用大量装灌洗液，应使用三腔导管，并遵循生产商说明确定给药体积和时间。
    1. 治疗前运行 体外 模型至少运行 4 h，以确保生物膜相关群落有足够时间形成。模型运行 4 h 后，暂停培养基流动，从内腔室采集治疗前样本 体外 模型，详见步骤5。
      注意：如果使用大量灌注溶液，请继续执行步骤 7.2.5。
    2. 若使用单独的灌洗“袋装液”，请先将废液袋从导管上断开，并使用随灌洗袋提供的帽盖封闭废液袋。立即将灌洗液袋连接至导管，轻柔施压，将液体挤入导管的中央腔。按照制造商说明书指示进行操作（例如，作用时间为15分钟）。
    3. 完成推荐的治疗后，让残余溶液从内腔排出 通过 将导管眼孔插入灌注袋，然后断开袋子。袋中剩余的内容物可丢弃或用于后续下游实验。
    4. 用70%乙醇对导管引流口和废液袋连接口进行消毒，然后重新连接，完成无菌密闭引流系统。
      注意：若使用灌洗袋，请继续执行步骤 7.2.7。
    5. 若使用三腔导管，先用70%乙醇对灌洗腔端口进行消毒，并立即按照制造商说明，使用无菌注射器开始灌洗。
      注意：在冲洗前测量废液袋中残余尿液的体积，以便在后续的堵塞时间或流速计算中将其计入。
    6. 灌注完成后，丢弃注射器以及废液袋中残留的灌注液。
    7. 从处理后的样本中取样 体外 膀胱模型中央腔室（详见步骤5），并恢复AUM流 通过 继续使用蠕动泵进行实验。

8. 终止 体外 膀胱模型实验

注意：尿素酶阳性微生物，例如 P. mirabilis 可能导致导尿管堵塞 通过 结晶性生物膜形成。因此，堵塞可作为具有生物学意义的终点指标 体外 膀胱模型中可通过导管侧孔被结晶性生物膜完全堵塞以及玻璃“膀胱”中央腔室内AUM体积增加来直观识别图3).

  1. 一旦 体外 膀胱模型已运行至预设终点（可能是堵塞或规定的运行时间），关闭AUM流 通过 蠕动泵，并按照步骤5所述从中央腔室采集终点样品。
  2. 关闭水浴循环，断开培养基回路与水浴回路之间的管路连接 体外 膀胱模型
  3. 移除塞子 体外 膀胱模型，并使用血清移液管完全移除残余尿液的全部体积。妥善处理任何受污染的培养基（即，通过高压灭菌进行消毒）。
  4. 排空废液袋并丢弃残留培养基。断开导管废液袋与导管接口的连接，并将其丢弃。
  5. 使用注射器，在从模型中取出导管前缓慢放空导管球囊。
    注意：若使用尿素酶阳性的细菌种类，导管可能会“粘附”在玻璃器皿的壁上 体外 模型。避免对导管施加过大力量，而应继续进行步骤 8.6。
  6. 浸泡 体外 5% 抗菌清洁溶液中的模型（参见 材料清单) 过夜，然后用清水彻底清洗，以确保去除残留的消毒剂。高压灭菌以达到灭菌效果。
    注意：若使用尿素酶阳性菌种，需在消毒液中加入5%（w/v）柠檬酸，以帮助溶解中央腔室中的生物矿化沉积物。该酸性溶液还可通过降解结晶性生物膜沉积物，帮助释放已粘附在模型上的导管。
  7. 断开培养基回路管路与AUM储液罐的连接，并弃去任何残留的培养基。用水冲洗管路，以去除残留的AUM，随后进行高压灭菌。
  8. 为计算确切的堵塞时间，记录废液袋中的最终体积，并结合步骤4.4中的公式和先前计算的流速，确定堵塞发生的时间。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

成功运行的 体外 膀胱模型的建立依赖于在整个实验过程中严格遵循无菌操作技术，并仔细观察培养基的浑浊度（图3）。接种前，无菌AUM呈淡黄色，且透明 体外 膀胱模型中央腔室（图3A）。培养基储液器中的AUM在整个实验过程中应保持澄清，任何浑浊变化都可能表明溶液中盐类析出或培养基污染。如果培养基储液器或培养基循环管路中的AUM出现浑浊或颜色发生显著变化，应弃去该重复样本并重新实验。接种后，AUM中浑浊度的增加表明 体外 膀胱模型的中央腔室清晰可见（图3B). 浊度的变化在脲酶阳性生物中通常更为明显，例如 P. mirabilis，但在尿素酶阴性生物中接种后仍应可见。启动AUM流后，常可观察到AUM浊度降低，这是由于浮游细胞被冲出所致，并不表示模型中无活细胞。若使用尿素酶阳性生物，还可通过观察中央腔室培养基液面变化来确定堵塞时间图3C）。在模型运行过程中，应能完全看到导管的侧孔和尖端，以表明液体正正常排入废液袋。当发生堵塞时，中央腔室中的AUM液面将上升至导管侧孔和尖端以上，表明实验已达到终点，可进行各项终点指标的读取并终止实验。在实验过程中，需注意压力效应对系统的影响。 体外 膀胱模型培养基管路可能导致模型出现阻塞假象。若怀疑发生阻塞，在终止实验前应检查自动尿液测量装置（AUM）管路、导管及废液袋管路是否拉直绷紧，因为管路中任何可能存在的气泡或弯折均可能造成“气锁”，从而阻碍导管正常引流。

在……期间 体外 膀胱模型实验中，浮游采样可为模型内的生长动态以及导管相关性尿路感染（CAUTI）的发展进程提供有价值的见解。在整个实验过程中，无需终止模型即可监测细胞生长、pH值及生物膜的形成情况。图 4）。若使用尿素酶阳性菌株，可通过计算阻塞时间来衡量生物膜形成的速率，并用于比较不同细菌菌株的特性（图4）。野生型菌株的比较 P. mirabilis 以及一个LPS突变体（mini-tn5 插入到 waaC) 结果表明，突变体中阻塞发生的时间延长，从而减少了生物膜的形成图4）。尿素酶阴性生物通常不会阻断 体外 膀胱模型，因此建议在实验前确定一组终点指标。在某些情况下，尿素酶阴性微生物也可能导致导管堵塞。例如，尿素酶阴性的菌株 肺炎克雷伯菌 可产生大量黏液性生物膜，但这些生物膜通常比尿素酶阳性生物膜需要更长时间才能阻塞引流，因此仍建议设定固定的观察终点。

在整个膀胱模型实验过程中测量 pH 值，也可为不同菌株间的差异以及导管相关性尿路感染（CAUTI）的进展提供参考依据。若使用尿素酶阴性微生物，则模型中的 pH 值 体外 膀胱模型中央腔室在整个实验过程中应基本保持稳定，尽管随着实验过程中种群动态的变化，pH值可能出现小幅波动。接种 体外 含有脲酶阳性生物的模型会随时间推移出现显著的pH升高，通常在发生阻塞时pH达到最高，此时可观察到pH值高达约8–9（图4B).

每毫升浮游菌落形成单位（CFU/mL）的计数是 体外 膀胱建模，使操作者能够评估接种是否成功，并监测实验进展。实验结束时测量每毫升菌落形成单位（CFU/mL）可揭示不同细菌菌株在膀胱定植能力上的差异。在比较mini-Tn5 突变菌株 P. mirabilis 与野生型相比，在发生阻塞时观察到CFU/mL显著减少（图4C）。此外，通过计数导管表面生物膜中的菌落形成单位（CFUs）以及定量生物膜生物量，可深入了解不同病原体定植于留置导尿管泌尿道的能力。采用结晶紫染色法以确定野生型菌株与突变株之间在生物膜形成能力上的差异。 P. mirabilis 菌株 HI4320 及经氯己定传代的分离株图5在595 nm处测得的光密度结果显示，经氯己定传代的分离株相比野生型及未添加氯己定传代的对照组，其生物膜形成能力下降。

由于该研究的目的是 体外 膀胱模型旨在准确模拟导管相关性尿路感染（CAUTI）的微环境，也可用于在具有临床相关性的环境中研究抗菌治疗手段对CAUTI的治疗效果。对于产脲酶的病原体，通过比较经治疗模型与未经治疗模型的阻塞时间，可有效评估治疗干预的效果。治疗 体外 接种了的膀胱模型 P. mirabilis 使用0.02%氯己定膀胱灌注溶液显著延长了阻塞发生的时间，相较于未处理或使用0.9%生理盐水处理的模型图6A）。此外， 体外 膀胱模型可用于研究抗菌治疗药物的杀菌活性。通过监测抗菌处理后浮游态和生物膜相关细胞的CFU/mL变化，可以判断治疗是否有效。处理 体外 接种了的膀胱模型 P. mirabilis 展示了一种 >与未处理组和0.9%生理盐水冲洗模型相比，按照制造商说明使用后，浮游状态的CFU/mL立即减少了7个对数级图6B).

Bioreactor operation diagram, media flow setup, nutrient solution circulation, temperature control.
图1主要组件示意图 体外 膀胱模型 (A膀胱模型（密闭引流系统）：（1）双层玻璃腔室模拟膀胱；（2）培养基入口，AU被供给 通过 蠕动泵连接至膀胱模型内腔（3）进水口供水 通过 循环水浴连接至外腔（4），出水口（5）连接导尿管，导尿管插入内腔（6）引流腔连接点；该连接点用于连接废液袋/灌洗袋（7），引流袋用于收集尿液流出。B) 示意图显示了装置的设置 体外 膀胱模型及培养基和水在模型中的流动方向。人工尿液储存在室温下的培养基储液罐（1）中，并供给模型 通过 蠕动泵（2）以约 0.75 mL min 的恒定流速-1 在整个实验过程中，培养基流入代表膀胱的双层玻璃容器中央腔室（3），并由此排出 通过 将 Foley 导尿管（4）的引流孔与引流袋（5）连接，完成无菌密闭引流系统。 体外 膀胱模型保持在恒定的37 °C温度下 通过 一个循环水浴装置（6），水流经双层玻璃容器的外层腔室。虚线表示硅胶管，箭头表示流动方向。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显示充气和引流管腔、测量标记的球囊导管设计示意图
图2：用于处理生物膜相关细胞的导尿管切段示意图。 导尿管上可用于解剖以进行后续生物膜定量的示例位置。（A）首先在导尿管尖端/侧孔近端8 cm区域（生物膜形成最显著的区域）进行横向切段。使用手术刀切除1 cm长的管段，通常避免包含未充气球囊的区域，因其处理过程中的重复性较差（1-3）。（B）导尿管初步切成1 cm小段后，再沿中央管腔做一次纵向切开，以暴露可能存在的生物膜，便于进一步定量分析，例如菌落形成单位（CFU/mL）计数或结晶紫染色定量。虚线表示解剖切割位置。请点击此处查看该图的放大版本。

Static filtration process depicted in three stages; laboratory setup for separation experiment.
图3：一个的阶段 体外 膀胱模型实验 图像的 体外 膀胱模型中央腔室，在不同实验阶段。A中国台湾的 AUM 体外 膀胱模型中央腔室在接种前的状态。中央腔室中的培养基完全透明，表明灭菌成功；导管尖端和侧孔位于培养基液面之上，表明导管引流正常。B) 培养基中的 体外 接种后膀胱模型中央腔室 P. mirabilis （接种后4小时）。接种成功的标志是培养基浑浊度增加。导管尖端和侧孔的可见性表明AUM已成功经导管引流，未发生堵塞。C) 一个阻断示例 体外 膀胱模型。接种 P. mirabilis 随后的生物膜形成和矿化导致导管侧孔堵塞，阻碍了液体引流，致使中心腔室内的培养基液面上升至导管尖端以上。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Bar chart comparison of blockage time, pH, CFU/mL in WT and Mutant experiments.
图4终点测量指标 体外 膀胱模型运行至阻塞。 示例终点测量值在阻塞发生时的记录 体外 接种临床分离菌株的膀胱模型 P. mirabilis，RS47（野生型）和一种生物膜形成能力减弱的突变株RS47-2（突变型）。(A野生型与突变株的阻塞时间（h） P. mirabilis. (BpH值 体外 发生阻塞时的膀胱模型。C) 每毫升浮游细胞的菌落形成单位（CFU/mL） 体外 阻塞发生时的膀胱模型腔室。所有数据均为五次生物学重复的平均值。误差线表示平均值的标准误差（SEM）。 p* ≤ 0.05; *p* ≤ 0.01。此图改编自 Clarke 等人。46. 请点击此处以查看此图的放大版本。

Bar graph illustrating enzyme activity assay results, showing OD595 measurements for samples WT, 1-8.
图5：生物膜相关细胞的测量来自 体外 膀胱模型 定量分析 P. mirabilis 生物膜形成，比较野生型菌株HI4320与在含或不含氯己定（CHD）条件下传代适应的群体 通过 结晶紫染色及在595 nm处测量光密度（OD）。WT： P. mirabilis HI4320；1、3、5：未暴露于CHD的传代对照；2、4、6：在4 µg/mL CHD中传代的HI4320。所有数据代表五次生物学重复的均值。误差线表示标准误（SEM）。 *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. 请点击此处以查看此图的放大版本。

Bar graphs comparing treatment effects on blockage time and CFU/mL, highlighting statistical analysis.
图6：来自的测量结果 体外 抗菌处理后的膀胱模型 浮游生物样品取自一个 体外 接种了的膀胱模型 P. mirabilis，用0.02%氯己定抗菌溶液（100 mL）或0.9%生理盐水对照冲洗后。A阻断时间 体外 灌注后膀胱模型。（B) 灌洗处理后立即测定的浮游状态CFU/mL。所有数据均为五次生物学重复的平均值。误差线表示标准误（SEM）。 p* ≤ 0.05; *p* ≤ 0.01; ***p* ≤ 0.0001. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

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导管化的泌尿道代表了一种复杂的生物微环境，在实验室条件下难以复制。 体外 膀胱模型旨在模拟导管相关性尿路感染（CAUTI），采用标准导尿管以复制临床实践中使用的无菌封闭引流系统。留置导尿的泌尿道极易发生感染，导尿管本身即是导致CAUTI发生的最大单一危险因素，这一事实充分证明了其感染风险。6,55因此，严谨的无菌操作技术对于实验的成功至关重要 体外 膀胱模型。AUM 的浑浊度是无菌性的一个明确指标，因为被污染或过期的培养基会随时间推移而变得浑浊，此时所有重复样本均需丢弃。在接种和取样过程中也应严格采用无菌操作技术。 体外 膀胱模型，因为打开中央腔室以加入制备好的接种物会破坏无菌的密闭引流系统，从而导致 体外 易受污染的膀胱模型。为避免中央腔室污染，可使用三腔导管采集浮游菌群（通过夹闭废液腔并引流） 通过 额外的管腔）。在4小时时间点预计会出现一定程度的冲洗损失，但如果在此时无法计数到可存活的浮游细胞，则可能需要进行故障排查。若在4小时后仍无法计数到可存活细胞，可能需要优化接种密度或AUM配方，以更好地支持细菌定植。此外，接种物的过度冲洗可能提示培养基回路存在问题；例如，管路中的弯折可能阻碍充分引流，导致有毒代谢产物积聚，从而抑制细菌生长；而用于冲洗培养基管路的残留消毒剂也可能产生杀菌作用。

本方案详细描述了AUM的制备方法，该方法此前由Nzakizwanayo等人描述过 等，因为它此前已验证可用于该用途 体外 带有显著导管相关尿路感染（CAUTI）病原体的膀胱模型，包括 奇异变形杆菌 和 大肠杆菌43,45,46,48然而，可以调整本方案中使用的AUM培养基配方，以选择性促进其他病原体的生长。已有多种不同的AUM配方发表，可替代用于培养体系中。28,56,57,58,59,60此外，可在培养基储液中补充AUM中的营养物质或抗生素，以筛选特定病原体的生长。从历史上看， 体外 膀胱模型也已使用混合人尿进行供给，然而，运行一个实验所需的培养基体积较大 体外 膀胱模型复制品可能导致人体样本采集变得不切实际53,54此外，不同患者的尿液成分可能存在显著差异，这会影响实验的可重复性，因为激素、盐类和蛋白质浓度以及水合状态的差异已被证实会影响细菌生长和生物膜形成。38,39,61,62.

上述方案详细描述了接种的步骤 体外 带有约10的膀胱模型10 CFU/mL 复制晚期 CAUTI。然而，接种部位的 体外 膀胱模型可在未来的检测中加以改进，以更好地模拟导管相关性尿路感染（CAUTI）的早期阶段，即 尿道导管的初始定植及向膀胱的上行感染。在实验设置前，通过人工方式将已知细菌接种量污染 Foley 导管 体外 模型可为导管相关性尿路感染（CAUTI）的早期阶段提供研究 insight。事实上，既往研究已通过调整接种菌量密度以模拟感染的早期阶段；例如，Nzakizwanayo 等人 等 接种 体外 起始CFU/mL较低的膀胱模型（约 103 CFU/mL）以模拟早期感染阶段47值得注意的是，改变接种密度可能会延长堵塞发生的时间，因此在实验前需要进行额外的验证。

此外，尽管本方案详细描述了接种 体外 在使用细菌单一代培养的模型基础上，可进一步将模型接种真菌病原体。既往研究表明，高达8%的导管相关性尿路感染（CAUTIs）由真菌感染引起 念珠菌属 spp.，能够形成生物膜，这些生物膜通常对抗真菌治疗具有耐受性27,63此外，该 体外 膀胱模型可进行改造以适用于多微生物导管相关尿路感染（CAUTI）的研究。事实上，有研究指出高达86%的CAUTI为多微生物感染，且相较于单一种类微生物感染，这类感染通常与更严重的症状以及更高的死亡率相关。27,64,65,69. 体外 可将多种微生物接种至模型中，以研究多微生物生物膜的形成及导管相关性尿路感染（CAUTI）的进展过程，但在接种前需对多微生物群落进行严谨验证，并调整接种物浓度。既往研究已采用该方法 体外 用于监测单一种类生物膜形成差异的膀胱模型 P. mirabilis 与双重菌种导管相关尿路感染相比的导管相关尿路感染 E. faecalis，揭示了菌株之间的代谢相互作用，与单一种类感染相比，这种相互作用促进了生物膜的形成70.

使用该方法的一个主要优势是 体外 用于研究导管相关性尿路感染（CAUTI）的膀胱模型，其优势在于能够观察标准导尿管表面生物膜的形成。在CAUTI中，生物膜的形成通常始于导尿管腔内由尿液有机成分构成的 conditioning film（条件膜）的形成，尿路致病菌可首先黏附于该膜，随后增殖并形成成熟的生物膜。2,18,71,72,73标准的生物膜形成研究实验通常使用标准的细菌培养基而非人工尿液培养基（AUM），且多基于细菌在聚苯乙烯微孔板或悬柱上的黏附性进行检测，即 卡尔加里装置；然而，以往的研究表明，系统的营养环境、pH值和氧含量，以及流速和表面结构差异（硅胶与塑料）等物理特性，均可能影响生物膜的形成36,37,74,75,76,77,78此外，培养具有强烈脲酶活性的细菌，例如 P. mirabilis 在AUM的封闭系统中，可能导致有毒代谢产物的积累，进而引起细胞死亡78,79。这在一定程度上被缓解了 体外 随着中央腔室中的AUM被持续更换为新鲜培养基，膀胱模型得以维持 通过 培养基循环系统，可在更接近临床实际的条件下研究导管相关性尿路感染（CAUTI）的生物膜45日常运行的 体外 膀胱模型及所选的实验终点在很大程度上取决于模型接种的是产脲酶阳性还是阴性微生物。理论上， 体外 模型在提供充足体积的AUM且保持模型无菌的条件下可无限期运行；然而，建议在实验前预先设定终点，该终点可以是堵塞，也可以是任意设定的天数。通常建议 体外 接种尿素酶阴性微生物的模型培养时间不超过7天，以模拟临床环境，因为该时长通常足以观察大多数微生物的生物膜形成，同时符合临床干预规范；根据标准最佳实践，导管一旦出现可见感染即应更换1,2,3,47,48尽管产脲酶生物可能形成结晶性生物膜，但不同产脲酶菌株在产生结晶所需时间上存在较大差异。 体外 膀胱模型阻塞，伴随某些菌株 奇异变形杆菌 导致导管在不到10小时内堵塞，而其他情况则需超过30小时才发生堵塞39,46在进行标准尿素酶试验之前 体外 膀胱模型实验，以确定模型应运行至堵塞还是预设终点80.

也许使用该方法的主要局限性在于 体外 用于研究生物膜形成的膀胱模型存在一个局限性，即生物膜的测量属于终点读数，因其需要取出并解剖导尿管。相比之下，浮游样品可直接从 体外 在实验过程中的任意时间点获取膀胱模型的生物膜样本。此外，一旦从 体外 膀胱模型，可采用多种下游技术进一步定量分析生物膜的形成。以往研究利用火焰光度法测定结晶性生物膜中钙和镁的含量，也可使用更复杂的染色方法准确定位尿素酶阴性生物膜胞外多聚物基质（EPS）的组分45,73,81,82,83,84.

本研究还描述了该方法的应用 体外 用于研究治疗导管相关尿路感染（CAUTI）药物效果的膀胱模型。 体外 膀胱模型模拟了导管相关性尿路感染（CAUTI）微环境的重要特征，例如使用人工尿液培养基（AUM），以及临床上常见的生物膜形成和CAUTI中出现的有机负荷增加。治疗药物（如抗生素）可直接添加至AUM储液罐中，以模拟药物在临床环境中的生物可利用性；既往研究已利用被重新定位的药物（如硫利达嗪和氟西汀）证明其具有抗生物膜作用81此外，最小抑菌浓度测定和细菌悬液试验常被用于推断杀菌剂的抗菌活性，但目前鲜有证据表明这些测定结果能与实际应用中杀菌剂的敏感性相关联。41,85,86,87,88。该 体外 膀胱模型在测试旨在治疗或预防导尿管相关尿路感染（CAUTI）的杀菌产品方面具有优势，因为该模型包含导尿管，并能更真实地模拟CAUTI的微环境，从而使抗菌润滑凝胶和灌洗液等产品能够按照生产商的说明进行测试。以往的研究也已使用过该模型。 体外 膀胱模型以确定噬菌体疗法的有效性，并证明噬菌体治疗可延长 P. mirabilis 阻断所需时间 体外 超过100小时的膀胱模型47使用标准尺寸的导尿管 体外 膀胱模型还意味着可以对新型涂层导管进行抗菌活性检测。Slate 之前的研究工作 等 证明了采用诊断治疗型环丙沙星涂层的导管可延长 P. mirabilis 阻塞时间延长至约60小时 体外 膀胱模型48。这凸显了该方法的潜在应用价值 体外 在研究旨在治疗导管相关性尿路感染（CAUTI）的新型疗法时，膀胱模型可用于在具有生物学相关性的模拟CAUTI微环境中更准确地评估抗菌药物。

披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢Jonathan Nzakizwanayo博士和Anthony J. Slate博士在制定本方案过程中提供的专业知识。巴斯大学的研究工作由英国医学研究理事会GW4生物医学博士培训项目资助，V.B. 获得该机构的学生奖学金（MR/N0137941/1）。B. V. J. 还获得邓希尔医学信托基金（RPGF1906\171）的资助。O.E.C. 的研究由西北肾脏研究基金会（注册慈善编号：1144798）提供经费支持。图1 使用Biorender.com制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
313 快速装泵头扩展装置Watson-Marlow313蠕动泵 - 额外泵头扩展装置 
323S/D 手动控制可调速泵Watson-Marlow323S/D蠕动泵
3L 床袋，无菌带杠杆龙头 Great Bear Healthcare GDW173
内径 3 mm 铂金固化硅胶管Fisher10111801小型 AUM 回路管路（连接泵管与模型）
内径 5 mm 铂金固化硅胶管Fisher10539201中型 AUM 回路管路（连接泵管与 AUM 储液罐）
氯化铵 (NH4Cl)Fisher11473713
无水硫酸钠 (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon 锥形接头 Fisher10712807用于连接 AUM 回路中不同长度的管路
床袋挂架 Great Bear Healthcare 10705P
Bochem 夹管夹，25 mm 直径Fisher11805101
氯化钙 (CaCl2)Fisher10021681
一水柠檬酸 MerckC1909-500G用于实验后清除模型上的结晶性生物膜 
Fisherbrand 玻璃刻度 B 类 1 型移液管Fisher11992168通过钻孔塞向体外膀胱模型供给 AUM
明胶VWR24360.233
GraphPad Prism 10GraphPadV10.0用于绘制体外膀胱模型结果图表及进行统计分析的分析软件。 
Hanna HI 2211-02 pH 台式计Phillip Harris PP00057414
体外膀胱模型 --定制设备，如 Nzakizwanayo 等人 (2019) 之前所述。
Instillagel 6 mL 润滑凝胶mydoctorshop.co.uk40-006第 7.1 节中使用的润滑凝胶；其他供应商也可提供。
Kartell Plastilab 不等径锥形接头Fisher 11914289用于连接不同直径的管路
无盐麦康凯琼脂（脱水）Fisher10472643用于计数迁徙性细菌的单个菌落，例如奇异变形杆菌 (Proteus mirabilis)
六水氯化镁 (MgCl2·6H2O)Fisher10386743
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Y 形接头Fisher10186070用于从一个 AUM 储液罐为多个 AUM 回路供液（每罐可连接 1–4 个模型） 
氯化钾 (KCl)Fisher10375810
Pyrex 抽滤瓶，带磨砂玻璃侧口，容量：5000 mLFisher11347884AUM 储液罐
带孔橡胶塞，外径：37 mm，红色，直径：37 mmFisher11517612用于 AUM 储液罐及向体外模型供给 AUM
14 法式 100% 硅胶导尿管，附无菌注水注射器 Great Bear Healthcare 4833-0514
氯化钠 (NaCl)Fisher10735921
草酸钠 (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse 浓缩杀菌清洁剂 5 L Fisher12447580用于实验后对模型进行灭菌
柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7)Fisher11434993
胰蛋白胨大豆肉汤Fisher10198002
尿素 (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0.9%B.BraunFB99833第 7.2 节中使用的生理盐水膀胱冲洗袋 
Watson-Marlow Pumpsil 内径 1.6 mm 铂金固化硅胶管Fisher12406280厚型 AUM 回路管路（用于蠕动泵）

参考文献

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