分离、固定及通过流式细胞术表征幼年金头鲷头肾白细胞

摘要

本文描述了从黑鲷头肾中提取的白细胞的分离与固定方法，并通过流式细胞术评估其活力。本研究有助于实验方案的标准化，能够在不损害样品质量的前提下处理更多数量的样品，从而推动鱼类免疫学知识的进步。

摘要

免疫对于生物体的生理调节至关重要，是抵御病原体和环境应激的主要防御机制。免疫细胞的分离与分析为了解机体对外界压力的免疫应答提供了关键见解。然而，对于诸如海洋鱼类等研究较少的物种，缺乏统一的实验方案常常导致技术和分析上的挑战，从而阻碍数据的解读以及对物种特异性免疫反应的深入理解。本研究旨在建立一种基于流式细胞术的优化分析流程，用于表征并测定幼年大西洋鲷（Sparus aurata）头肾（硬骨鱼类主要的造血器官）中白细胞的活力状态。该流程首先通过汉克斯平衡盐溶液（Hanks' balanced salt solution）进行组织匀浆以分离白细胞，随后采用优化的Percoll密度梯度离心法，确保获得高回收率的白细胞，并最大限度减少红细胞污染，从而满足后续高效流式细胞术分析的要求。此外，本研究应用了一种新型细胞活性染料技术（LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit），根据荧光染色模式区分活细胞与死细胞。细胞固定采用3.7%甲醛处理，以保持细胞形态、活性及染色效率。流式细胞术成功鉴定了三种主要的白细胞群体：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。该方法不仅可用于细胞活力检测，还可实现细胞类型的准确区分。流式细胞术方案的改进推动了鱼类免疫学的发展，提高了免疫细胞分析的准确性与效率。此外，由于该方案允许细胞固定后进行后续分析，显著减少了免疫评估所需的时间和工作量，因此在多个研究领域中均具有重要的科研与应用价值。

引言

免疫在生物体的生理调节中起着核心作用，是抵御多种病原体和环境应激因素的主要防御机制¹。与其他脊椎动物一样，鱼类拥有复杂、动态且协调的免疫系统，对其整体健康和生存至关重要¹。

硬骨鱼类具有先天性和适应性免疫系统，二者协同作用以识别、应对并中和有害入侵者²。先天性免疫系统作为第一道防线，对病原体提供即时且非特异性的反应²，而适应性免疫系统则随着时间推移逐步发展，提供更特异的免疫应答，使鱼类能够识别特定病原体并建立免疫记忆³。鱼类的免疫系统依赖于特化的初级淋巴器官（即胸腺和头肾）以及次级淋巴器官（如脾脏和黏膜相关淋巴组织（MALT））来支持免疫防御并维持整体健康⁴。头肾是硬骨鱼类主要的造血器官，在免疫细胞（包括白细胞）的发育与成熟过程中发挥关键作用⁵。

近年来，在研究多种鱼类的免疫反应方面已取得显著进展²。其中一个关键研究领域是了解白细胞群体及其活性。白细胞也称为白血球，通常分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞，在鱼类的免疫防御中发挥着至关重要的作用。白细胞中含有吞噬细胞，负责吞噬并清除病原体，并释放杀菌性的活性氧物种，有助于消除入侵的微生物⁶。白细胞还参与炎症过程，在隔离和清除感染的同时促进组织修复⁶。白细胞群体的数量和活性是评估动物健康与疾病状态下免疫状况的重要指标^7,8。

一些研究表明，压力因素（如不利的环境条件）可以改变红细胞的数量和形态以及循环白细胞的组成^9,10。例如，Franke 等人（2024年）综述指出，在气候变化情景下研究鱼类免疫系统至关重要，因为环境应激源可能损害鱼类免疫力，增加患病易感性，并增强某些病原体的感染性，最终加速疾病进展¹¹。此外，了解鱼类免疫不仅对推动基础生物学研究具有重要意义，也有助于支持社会多个领域，例如水产养殖业。随着全球水产养殖业持续扩张，保障养殖鱼类物种的健康与福利正变得日益重要。然而，鱼类福利仍是一个相对较新的研究领域，养殖鱼类的免疫反应仍需进行系统且标准化的评估。优先开展免疫反应研究至关重要，因为所获得的信息可通过有效且针对性的方法提高养殖动物的福利和抗逆能力，从而提升水产养殖的可持续性和生产效率。

白细胞的定量与鉴定通常采用血液学方法，例如使用Bürker、Neubauer或Thoma血细胞计数板进行人工计数，以及染色血涂片分析^7,10。为了辅助观察和区分血细胞，常使用Wright、May-Grünwald-Giemsa和Hemacolor等染色试剂盒^7,12。然而，这些人工细胞计数技术繁琐、耗时，且容易引入人为误差^8,10。常见的误差来源包括血液混合或稀释不充分、染色问题以及血细胞计数板加样不当，这些因素均可能导致细胞计数结果不准确¹²。此外，人工血液学分析需要操作者具备较高的专业水平和丰富经验，以确保结果的可靠性和可重复性⁷。随着对精确高效诊断工具需求的不断增长，开发能够深入理解鱼类群体免疫状态的创新方法，已成为推动该领域发展的重要步骤。

流式细胞术已成为该领域的一项强大工具，可高通量、定量地分析白细胞群体和细胞活力⁸这项现代诊断技术能够以极高的精确度对混合群体中的单个细胞进行快速检测、计数和表征¹³此外，流式细胞术可对表型和功能特征进行同步多参数测量。尽管该技术已广泛应用于人类临床和兽医学领域，但在鱼类白细胞研究中的应用仍非常有限⁸. 尽管已针对不同鱼类物种开展了一些研究^{1,6,8,13,14,15,16,17}，仍需解决若干关键挑战。其中一项主要挑战是在分析过程中必须获得从外周血或淋巴组织（如头肾）中提取的活体白细胞悬液¹白细胞分离 由于硬骨鱼类具有一个独特的特征——存在有核红细胞，因此常常难以进行分析。红细胞的意外污染会因其大小、卵圆形形态以及细胞核的存在而干扰白细胞的分析¹因此，必须从白细胞悬液中去除红细胞，以获得高纯度的白细胞，并通过流式细胞术分析白细胞的表型和功能特性。在哺乳动物中，白细胞分离通常采用红细胞渗透性裂解法或利用Ficoll或Percoll进行密度梯度离心分离。¹然而，由于海洋鱼类和淡水鱼类的红细胞具有细胞核，无法被有效裂解，因此渗透裂解法对这两类鱼类均无效¹相反，密度梯度分离法更适用于鱼类，因其能有效维持细胞在长时间内的稳定性¹尽管一些研究已成功从幼鱼中分离出白细胞，但大多数研究仍主要集中于成年群体¹⁷然而，生命早期阶段不仅更容易暴发疾病，而且个体体型更小，使得取样过程更加复杂和困难。另一个局限性在于，现有方法通常一次只能处理有限数量的样本或重复组，因为白细胞活性的评估需要立即进行样本处理。样本处理的延迟会不利地影响细胞活性，从而进一步增加取样过程的复杂性，并可能危及整个研究工作。

据我们所知，目前尚未有已发表的方法能够成功固定白细胞，以用于后续的流式细胞术活力分析。本研究具有开创性意义，建立了一种高效分离欧洲南部国家主要养殖鱼类——幼年大西洋鲷（Sparus aurata）头肾中白细胞的方法，该方法采用Percoll密度梯度离心技术。我们还提出了一种改进的基于染色的技术，可在通过流式细胞术鉴定主要白细胞群体（淋巴细胞、单核细胞和粒细胞）的同时，区分活细胞与死细胞。改进后的实验流程包含细胞固定步骤，使得细胞活力分析可在操作后长达一个月内进行。该流式细胞术方案的实施有望显著减少免疫评估通常所需的时间和工作量，因此对水产养殖领域的科研及实际应用均具有重要价值。该方法的应用优势在于可处理大量样本、保存细胞，并允许在后续时间点进行流式细胞术分析。因此，该方法有助于深入理解鱼类免疫机制，以及不同环境或实验条件对细胞活力的影响。此外，该细胞活力检测方法可与特定免疫细胞群体的多参数表型及功能特征分析相结合。这一综合策略能够更全面地分析多种免疫学参数，将其直接关联至相应的细胞类型，从而更清晰地揭示免疫应答机制。这些发现有望推动更有效策略的制定，包括改进水产养殖中的疾病管理方法。

方案

本方案必须由具备动物实验资质的研究人员（欧盟职能A和B）执行。所有涉及动物操作和样本采集的程序均须遵守ARRIVE指南（动物研究：in vivo 实验报告规范），并符合欧洲实验动物科学联合会（FELASA）推荐的动物护理与使用伦理标准。本研究严格遵循上述所有标准以及葡萄牙实验动物科学相关法律法规（欧盟指令2010/63；第113/2013号法令）。本研究已获得葡萄牙海洋与大气研究所（IPMA）动物福利与伦理委员会（ORBEA，项目编号：LABVIVOS-002-AquaClimAdapt）批准，并由国家活体动物使用主管机构——食品与兽医总局（DGAV）监督，伦理许可编号为20596/25-S。

1. 研究模型与生物体的维持

注意：本研究专为平均体重为 30.0 ± 5.0 g、体长为 12.0 ± 2.0 cm 的幼年黑鲷（Sparus aurata）设计。该方法可能不直接适用于其他鱼类物种，因为不同物种具有独特的生理和免疫学特征，可能影响白细胞的分离、细胞固定及活力评估。对于其他物种，可能需要对该方案进行调整，建议开展预实验以优化每种目标物种的实验条件。

1. 鱼类适应环境（检疫期）
   1. 将鱼类均匀分配至大容量水族箱中（例如，两个总容量各为660 L的水族箱——参见补充图1）。
      注意：所使用的水族箱可属于循环水养殖系统（Recirculating Aquaculture System, RAS），该系统可高效利用水资源并更好地控制水质。在RAS中，水在系统内持续循环和处理，为鱼类提供稳定且受控的环境。这种设置有助于维持鱼类健康和生长的最佳条件，确保实验期间鱼类分布均匀并最小化应激。
   2. 维持最佳的非生物条件。
      1. 在模拟其自然栖息地的条件下将鱼类隔离饲养3周：
         温度：20.0 ± 0.5 °C；
         溶解氧：7.2 ± 0.2 mg/L；
         盐度：35.0 ± 0.5 ‰；
         pH值：8.0 ± 0.1 单位；
         光周期：14小时光照/10小时黑暗。
         注意：不同鱼类物种的理想维持条件可能有所不同。其他物种可能具有不同的需求，因此重要的是根据目标物种的具体需要调整这些条件，以确保生物体的健康与福利。此外，海水温度和光周期会随季节变化，因此在实验室中模拟自然条件时应考虑季节性变化。
2. 启动实验研究。
   1. 根据每个案例研究的实验设计确定所需水族箱数量和鱼类数量。
   2. 检疫期结束后，将鱼类转移至独立的RAS系统中（参见补充图2）。
      1. 为每个系统配备蛋白质分离器以去除水中过量的有机化合物；物理过滤装置（滤袋[400 µm]、滤棉和玻璃棉）；生物过滤装置（生物球[1.5"]、紫外线水体灭菌器和浸没式气石）；自动海水制冷系统和浸没式数字加热器，两者均连接至带有温度传感器的计算机控制系统（ProfiLux），用于调节各水族箱的温度；每个水族箱中设置浸没式气石以控制溶解氧。
   3. 在开始实验前，让鱼类在新系统中适应2周。
   4. 执行日常维护
      1. 清除每个培养水族箱中的鱼类粪便，并进行25%的海水更换。
      2. 使用便携式精密温度计测量温度。
      3. 使用多参数测量仪监测其他海水非生物参数（盐度、溶解氧和pH值）。
      4. 根据需要调整海水非生物参数，以确保整个实验期间的稳定性。
         注意：实验系统中的非生物条件可能因各案例研究的具体要求而异。例如，若研究旨在模拟季节变化或海洋热浪，则应相应调整温度和光周期以模仿自然季节变化。同样，若研究聚焦于模拟缺氧条件或海洋酸化，则应对海水中的氧气水平和pH值进行调整。这可确保实验条件尽可能真实且相关，从而提高研究结果的有效性和适用性。
      5. 评估鱼类的健康状况和福利，按照步骤1.2.4.6–1.2.4.8所述识别并处理应激或疾病的迹象。
      6. 观察异常行为，如游动紊乱、食欲减退、嗜睡、攻击性或孤立行为。
      7. 检查疾病征兆，包括病变、溃疡、变色、鳍条紧闭、过多黏液或鳃部快速运动。
      8. 记录所有观察结果，注明日期及所采取的措施。
   5. 进行每周水质检测。
      1. 使用比色法检测氨（NH₃/NH₄）、亚硝酸盐（NO₂^-）和硝酸盐（NO₃^-）水平。
         注意：确保所有这些参数均低于可检测水平。若浓度超过限值，应额外换水、增加曝气或调整过滤系统。
   6. 投喂并监测鱼类营养状况。
      1. 提供高质量饲料，满足幼鱼特定的营养需求（参见补充表1中饲料详细成分示例）。
         注意：确保水产饲料颗粒大小（2–3 mm）适合幼鱼，便于摄食和消化。
      2. 将投喂量调整为鱼类平均体重的每日2%。
      3. 每天人工投喂两次——上午一次，下午一次（设定固定时间以维持稳定的投喂规律）。

2. 鱼类取样、安乐死、解剖及头肾采集

1. 从鱼缸中取样鱼类。
   1. 从鱼缸中随机选取鱼类，以避免取样偏差。
   2. 使用网具将鱼轻轻转移至装有鱼缸水的临时暂养容器中。
      注意：尽量减少操作时间，以降低鱼类应激反应。
2. 配制安乐死溶液。
   1. 选择合适的容器（例如，3 L 桶），用于盛放鱼类。
   2. 将适量的三卡因甲磺酸盐（Tricaine, MS-222）溶解于海水中，使终浓度达到 200–300 mg/L¹⁸（注意：参见 补充表 2 和 补充文件 1）。
   3. 用碳酸氢钠将溶液缓冲至 pH 7.2–7.5。
3. 施用安乐死溶液。
   1. 将鱼置于安乐死溶液中至少 10 分钟，或直至观察到鳃盖运动停止且反射消失（通过检查对外界刺激无反应来确认安乐死完成）。
   2. 记录鱼的体重（g）和全长（cm）。
4. 进行鱼类解剖。
   注意：为确保最佳样品质量和细胞活性，解剖过程应尽快完成，理想情况下在安乐死后 5 分钟内完成。
   1. 使用空调将实验室温度维持在 19 °C，以减少取样和处理过程中的温度波动。
   2. 对解剖工具进行灭菌（尽可能使用高压灭菌法处理金属器械），并用 70% 乙醇设置洁净的工作区域（注意：参见 补充表 2）。
   3. 将已安乐死的鱼侧放于无菌解剖托盘上，头部朝向非惯用手一侧。
   4. 使用解剖刀，从泄殖腔（肛门）开始沿腹侧中线小心切开，向上延伸至鳃部。
      注意：切开时注意深度，避免损伤内部器官。
   5. 使用解剖剪小心扩大切口，暴露内部器官。轻轻掀开体壁瓣，以清晰观察内部解剖结构。
   6. 定位头肾：头肾位于鳃部后方，靠近体腔前背侧区域，并沿体腔顶部延伸，位于脊柱下方。
      注意：与周围组织相比，头肾通常颜色较深（图 1）。
   7. 小心清除周围的脂肪组织和结缔组织，以更清楚地观察头肾。
      注意：此步骤需精细操作，避免损伤头肾。
   8. 使用尖头镊子和剪刀，小心提起头肾，并在其周围进行精确剪切，使其与周围组织分离。
      注意：操作时应轻柔，防止组织损伤。在一条体重约 30 g 的鱼中，头肾重量通常为 20–30 mg。
   9. 立即将切除的器官放入置于无菌培养皿中的细胞筛（100 µm 尼龙网）中，以确保无菌并便于后续处理。
      注意：自此步骤起，所有操作应尽快完成（5 分钟内），以维持细胞活性。为保持样品低温，后续操作应将培养皿置于盛有冰块的容器上，并用铝箔覆盖。

图1：头肾的位置：（A）示意图显示头肾通常位于鳃后方，并沿体腔前背侧分布；（B）海鲷头肾的代表性图像，突出其颜色较周围组织更深。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 头肾白细胞的分离（图2）

图 2： 头肾白细胞分离的示意图说明。该实验方案包括多个步骤：首先对组织进行匀浆，随后进行密度梯度离心，收集白细胞环，洗涤白细胞环，最后重悬细胞并调整细胞浓度。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 匀浆组织。
   1. 在无菌培养皿中加入 2 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）。
   2. 确保细胞筛网（100 µm 尼龙筛网）与 HBSS 接触，但不要完全浸没。
   3. 使用注射器的推杆在细胞筛网上研磨头肾组织。施加轻柔压力，使组织碎片通过尼龙筛网，形成单细胞悬液。
      注意：若处理多个样品，含有细胞悬液的培养皿可在 4 °C 冰箱中短暂保存数分钟，直至进行下一步操作。该细胞悬液将用于白细胞的分离。
2. 进行密度梯度离心。
   1. 配制密度为 1.077 g/mL、渗透压为 353 mOsm/kg、pH 为 7.4 的密度梯度介质溶液（见补充文件 1）。
      注意：不同鱼类物种的渗透压可能存在差异，因此必须根据各物种的具体需求调整密度梯度介质溶液的渗透压。
   2. 在 5 mL 聚苯乙烯圆底离心管中，小心加入 600 µL 密度梯度介质溶液。
   3. 取细胞悬液（2 mL），缓慢加入含有密度梯度介质的离心管中。第一滴至关重要——需极其轻柔地加入，以避免破坏密度梯度介质的分层。
      注意：应保持 3:10 的比例（密度梯度介质 : 细胞悬液）。使用无菌 1 mL 巴斯德移液管进行精确且轻柔的加样。确保移液管尖端接触管壁，以防止扰动密度梯度介质层。避免将样品与密度梯度介质混合。
   4. 将离心管在 4 °C 条件下以 400 x g 离心 45 分钟，并关闭刹车，以确保分层在过程中保持完整。
      注意：离心后应可见清晰的分层。白细胞将在密度梯度介质与细胞碎片沉淀之间的界面处形成环状层（图 3）。

图3： 白细胞在密度梯度介质与细胞碎片沉淀物之间的界面处形成环状层。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 收集白细胞环。
   1. 使用无菌巴斯德吸管，轻轻吸取白细胞环（约100 µL），并转移至一个2 mL微量离心管中。
      注意：操作时应避免显著扰动各层，以防污染。如果白细胞环中可见碎片或深色悬浮物，建议将收集的白细胞悬液通过一个新的微型细胞筛网（100 µm），以确保纯度。将微型细胞筛网置于2 mL微量离心管上方，轻轻将白细胞悬液经筛网过滤转移。
4. 洗涤白细胞环。
   1. 向含有白细胞环的微量离心管中加入HBSS，直至总体积达到2 mL，并轻轻重悬细胞。
      注意：将离心管置于装有冰块并用铝箔包裹的容器中，以保持样本低温。确保离心管不与冰块直接接触。在整个洗涤过程中维持此冷却条件。
   2. 在4 °C条件下，以400 × g离心10分钟（可开启刹车）。
   3. 离心后，小心弃去上清液，保留管底的沉淀（可能几乎不可见）。
   4. 重复洗涤步骤（加入HBSS、重悬、离心并弃去上清液），直至沉淀中无杂质。
5. 重悬并调整细胞浓度。
   1. 在用于洗涤的同一2 mL微量离心管中，用1 mL HBSS重悬细胞。
   2. 将细胞浓度调整至每毫升1 × 10⁴ 至 1 × 10⁶ 个细胞。若初始沉淀量较大，可能需要额外HBSS稀释至目标浓度范围。根据细胞计数结果，将细胞悬液转移至15 mL管中，并按需添加更多HBSS。
      注意：建议使用自动细胞计数仪以加快操作进程。

4. 白细胞的染色与固定（图4）

注意：LIVE/DEAD 可固定死细胞染色试剂盒提供了一种改进的方法，可用于通过流式细胞术评估固定后细胞的活力。该检测利用一种可与细胞内胺基发生反应的荧光活性染料。当细胞膜受损时，染料可穿透细胞，与细胞内部及细胞表面的游离胺基结合，从而产生强烈的荧光染色；而在活细胞中，仅有细胞表面的胺基可与染料反应，因此染色较弱。使用甲醛固定后，染色强度得以保持，同时甲醛还可防止微生物生长，从而保存样本。LIVE/DEAD 可固定死细胞染色试剂盒的组成完全相同，仅荧光染料不同——可选蓝色、紫色、水蓝色、黄色、绿色、红色、远红或近红外（红外）染料。本研究中采用了近红外荧光活性染料。此外，该单色检测方法可在多色实验中同时平行检测其他参数。

1. 准备染料。
   1. 将试剂恢复至室温（RT）：在打开瓶盖前，先将一管荧光活性染料和一管无水二甲基亚砜（DMSO）放置至室温。
   2. 重悬染料：向含有活性染料的管中加入 50 µL DMSO。充分混匀，确保染料完全溶解。
   3. 重悬后的染料溶液应尽快使用，最好在数小时内用完。
      注：每个试剂盒包含五支独立包装的活性染料，足以染色至少 40 个细胞样本。然而，染料经重悬后在 DMSO 溶液中相对不稳定，尤其在接触湿气时。未使用的部分可于 ≤-20 °C 避光、防潮保存，最长不超过 2 周。
2. 染色并固定细胞。
   注：适用于细胞染色的缓冲液包括 Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）、磷酸盐缓冲液（PBS）和 Dulbecco's PBS（D-PBS），前提是这些缓冲液不含牛血清白蛋白或血清等外源性蛋白质。使用氨基反应性染料时，应避免使用 Tris 缓冲液以及含叠氮化钠或外源性蛋白的溶液进行细胞重悬和洗涤。本研究中选用 HBSS，因其离子组成均衡，有助于维持渗透压平衡，并在染色过程中为细胞提供必要的离子和葡萄糖，以支持细胞代谢和活性。此外，HBSS 不含外源性蛋白，可防止干扰活性染料反应，确保细胞活性评估的准确性。
   1. 将细胞计数后，用 HBSS 调整细胞密度至每毫升 1 × 10⁶ 个细胞，取 1 mL 此细胞悬液转移至 2 mL 微量离心管中。
      1. 每天至少对一个样本诱导细胞死亡，作为对照，用于设定活细胞与死细胞之间的荧光强度阈值。按以下方式在微量离心管中准备样本：
         管 1：活细胞 — 未染色
         管 2：活细胞 — 已染色
         管 3：死细胞 — 未染色
         管 4：死细胞 — 已染色
         注：这四支管仅需在每次实验中为单一样本设置一次作为对照。其余样本只需准备两支管（管 1：样本 — 未染色；管 2：样本 — 已染色），即可获得关于活细胞和死细胞的信息。
   2. 细胞死亡阳性对照：将标记为“死细胞未染色”（管 3）和“死细胞已染色”（管 4）的管置于 50 °C 水浴中 7 分钟，通过热处理诱导细胞死亡。
   3. 细胞染色：向管 2 和管 4（需染色的管）中的 1 mL 细胞悬液加入 1 µL 重悬后的荧光活性染料（来自步骤 4.1.2），充分混匀。
   4. 在室温下避光孵育 30 分钟。
      注：若无需固定，则可跳过以下步骤 4.2.5–4.2.7。改为用含 1% 牛血清白蛋白的 1 mL HBSS 洗涤细胞两次（见补充文件 1），然后重悬于 1 mL 含 1% 牛血清白蛋白的 HBSS 中。应尽快在流式细胞仪上进行分析；否则，由于细胞未固定，其活性可能受到影响。
   5. 用 1 mL HBSS 洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于 900 µL HBSS 中。
   6. 加入 100 µL 37% 甲醛（注意，见补充表 2）。
   7. 在室温下孵育 15 分钟。
   8. 用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1 mL HBSS 洗涤两次，然后将细胞重悬于 1 mL 含 1% BSA 的 HBSS 中。
   9. 将样本置于 4 °C 冰箱中保存。固定后应在 1 个月内完成细胞分析。
   10. 使用适当的激发和检测通道，通过流式细胞术分析固定后的细胞悬液。
       注：正确的激发和检测通道可能因所用仪器不同而有所差异（见补充表 3）。

图4： 白细胞染色与固定的示意图说明。 请点击此处查看此图的放大版本。

5. 流式细胞术

1. 获取数据。
   注意：流式细胞仪的操作步骤可能因所使用的具体仪器型号而异。本研究中使用 Attune NTx 流式细胞仪获取数据。
   1. 运行样本。
   2. 将样本管放入样本进样口。
   3. 按下“开始”按钮启动采集，待事件速率（事件数/秒）稳定后，点击“记录”。
   4. 为确保分析的可靠性，每个样本在单细胞门（singlets gate）中至少记录 10,000 个事件。
   5. 保存每个样本的所有数据，并备份至外部硬盘或云存储设备。
2. 分析数据。
   注意：流式细胞术分析可使用多种软件。本研究采用 FlowJo v10.8.1¹⁹ 进行数据分析。
   1. 加载数据文件：启动流式细胞分析软件，上传实验中获得的 .fcs 文件。
   2. 可视化数据（图 5A）：绘制前向散射光（FSC-A）（XX）与侧向散射光（SSC-A）（YY）的散点图，以评估细胞大小和颗粒度。
      注意：该图常用于根据散射特性识别细胞群体并排除碎片。
   3. 单细胞门控与多聚体排除（图 5B）：使用前向散射光面积（FSC-A）与前向散射光高度（FSC-H）的散点图排除多聚体。绘制门控区域，包含图中对齐分布的事件（单细胞），排除未对齐的事件（多聚体）。若样本中存在 FSC 信号极低的事件，可通过不在单细胞门中包含这些事件的方式将其排除，仅保留单细胞。
   4. 识别白细胞群体（图 5C）：根据 FSC-A/SSC-A 的分布特征区分三种白细胞群体：FSC-A^high/SSC-A^high 为粒细胞，FSC-A^medium/SSC-A^medium 为单核细胞，FSC-A^low/SSC-A^low 为淋巴细胞。
   5. 活率门控（图 5D）：在相应的荧光通道（NIR，RL3-A）设置活率染料染色的阈值。根据 LIVE/DEAD 可固定死细胞染料的染色强度区分活细胞与死细胞：染色弱的细胞定义为活细胞，染色强的细胞定义为死细胞。
   6. 群体统计：查看软件提供的统计数据，包括各门控内的总事件数（细胞数）以及总细胞和门控细胞的百分比。
   7. 导出数据：将数据导出至电子表格，并使用适当的统计软件（GraphPad Prism 或 R）进行进一步的统计分析。
      注意：分析方法的选择取决于研究的具体目标。

图 5：头肾细胞活力评估的流式细胞术设门策略：（A）显示所有采集事件的 FSC-A/SSC-A 散点图。（B）基于前向散射（FSC-A）与前向散射（FSC-H）图中线性关系定义单细胞区域，以排除多重事件。（C）在排除多重事件后，基于 FSC-A/SSC-A 定义的三个主要细胞群。（D）显示活/死细胞活力染料染色的直方图。为设定区分活细胞与死细胞的阈值，白细胞经轻微热激处理（50 °C，7 分钟）后，用活力染料染色。染色强度高且呈阳性（++）的细胞为死细胞，染色强度低且呈阳性（+-）的细胞为活细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

图6 展示了采用本研究所述方案从幼年金色鲷（Sparus aurata）头肾中分离的白细胞群体及其细胞活力的代表性流式细胞术数据。该图比较了两个样本：一个为高细胞活力样本，其中鱼类处于最佳培养条件（图6A）；另一个为低细胞活力样本，其中细胞经历了热应激处理（图6B）。

在两个样本中，本方法均有效鉴定了三种主要的白细胞群体：淋巴细胞（LY）、单核细胞（MO）和粒细胞（GR）。这些群体根据细胞大小和复杂性的差异进行区分，该差异由前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）图示出。前向散射（FSC-A）反映细胞的相对大小，而侧向散射（SSC-A）反映细胞内部的复杂性或颗粒度，从而实现各群体的清晰分离。在最佳条件下（图6A...

讨论

本研究开发的方法代表了鱼类免疫学研究的重要进展，有望加深对鱼类免疫反应的理解，并促进海洋资源的可持续利用。S. aurata 是鲷科一种具有重要价值的海洋鱼类，因其生态和经济意义，以及在生理学、免疫学、毒理学和水产养殖等多个研究领域的实验室研究适用性，成为理想的模式生物²⁰。使用 S. aurata 的主要优势之一是其在实验室中易于操作和饲养，且已有成熟的养殖方案，可确保实验条件的一致性和可重复性²¹。此外，该物种具有较强的环境适应能力（即对温度和盐度波动等多种环境条件具有高度耐受性），使其成为改进养殖技术及评估环境因素对海洋生物影响研究的理想对象²²。由于 S. aurata 的免疫系统已得到充分表征，且基因组数据可及，因此有助于揭示鱼类免疫反应、病原体抗性、疫苗有效性及整体健康状况²⁰。鉴于其在水产养殖业以及南欧人群饮食习惯中的重要地位，对该物种的研究可直接影响养殖实践，提高其产量和可持续性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气石	N/A	N/A
水产饲料	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	高品质饲料
自动细胞计数设备	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE自动细胞计数器（NanoEnteK）
自动水冷系统	佛山市唯诺制冷设备有限公司，中国	N/A
生物球 1.5" 水族池过滤器	TMC Iberia, Portugal	N/A
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
桶（3 L）	N/A	N/A	用于准备和实施安乐死
桶（5 L）	N/A	N/A	用于运输动物
细胞筛	Jetbiofil, 中国	CSS-013-100	细胞筛，100 μm 尼龙网，无菌，黄色
离心机	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
氨（NH₄⁺/NH₃）比色检测试剂盒	Tropic Marin, USA	N/A
硝酸盐（NO₃⁻）比色检测试剂盒	Tropic Marin, USA	N/A
亚硝酸盐（NO₂⁻）比色检测试剂盒	Tropic Marin, USA	N/A
计算机	N/A	N/A	用于获取和分析流式细胞仪所得数据
计算机化控制系统（Profilux）	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
去离子水	N/A	N/A	用于清洁流式细胞仪
密度梯度介质：Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
电子天平	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
70%乙醇	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	用于保持工作区清洁
EVE细胞计数载片	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon管（15 mL）	pluriSelect生命科学，德国	05-00002-01	无菌
滤袋	TMC Iberia, Portugal	N/A	400微米
过滤海绵	N/A	N/A
流式细胞仪	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune流式细胞仪
FlowJo v10.8.1 软件	BD Life Sciences	N/A
37%甲醛	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
玻璃棉	N/A	N/A
Hanks'平衡盐溶液	Merck生命科学S.L, 葡萄牙	H6648	改良型，含碳酸氢钠，不含酚红、氯化钙和硫酸镁，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养
LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	近红外荧光反应性染料 + DMSO
主水泵	EHEIM, Germany		Universal 1200
微量离心管（2 mL）	BRAND, Merck, Germany	Z628034	无菌
移液器吸头	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	适用于Sartorius，1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
移液器	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
小型细胞筛	pluriSelect生命科学全球总部，德国	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm 尼龙网，无菌
多参数测量仪	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS数字电导池（TetraCon 925）+ 光学IDS溶氧传感器（FDO 925）+ IDS pH电极（SenTix 940）
巴斯德移液管（1 mL, 5 mL）	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	无菌
培养皿	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm，聚苯乙烯，无菌
pH计	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
聚苯乙烯圆底Falcon管（5 mL）	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	无菌
便携式精密温度计	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
蛋白质分离器	Mantis	N/A	Tornado 120
质控微球/性能测试微球	Thermofisher Scientific, USA	N/A
隔离箱	N/A	N/A	总容积为660 L的水箱
矩形玻璃水箱/水族箱	N/A	N/A	总容积为200 L的水箱
冰箱	N/A	N/A	用于在4 °C下储存样品
30 cm直尺	N/A	N/A	用于测量鱼的体长
碳酸氢钠	Honeywell Fluka, Germany	31437	碳酸氢钠（NaHCO₃）
氯化钠	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
无菌解剖工具	N/A	N/A	（例如手术刀、剪刀、尖头镊子、解剖盘/板）
浸入式数字加热器	TMC Iberia, Portugal		300 W，V2Therm数字加热器
1 mL注射器	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	无菌，HSW Soft-Ject注射器 用于研磨头肾
温度传感器	GHL, Germany		PT 1000
三卡因（MS-222）	ThermoFisher Scientific, Germany	118000500	3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，98%（C₁₀H₁₅NO₅S）
紫外线水体灭菌器	EHEIM, Germany	5305010	ClearUVC-36
水浴锅	Fisher Scientific, Germany	N/A	Fisherbrand IsotempTM（货号 U01318）
防水灯具	N/A	N/A