分离、固定及通过流式细胞术表征幼年金头鲷头肾白细胞

摘要

本文描述了从黑鲷头肾中提取的白细胞的分离与固定方法，并通过流式细胞术评估其活力。本研究有助于实验方案的标准化，能够在不损害样品质量的前提下处理更多数量的样品，从而推动鱼类免疫学知识的进步。

摘要

免疫对于生物体的生理调节至关重要，是抵御病原体和环境应激的主要防御机制。免疫细胞的分离与分析为了解机体对外界压力的免疫应答提供了关键见解。然而，对于诸如海洋鱼类等研究较少的物种，缺乏统一的实验方案常常导致技术和分析上的挑战，从而阻碍数据的解读以及对物种特异性免疫反应的深入理解。本研究旨在建立一种基于流式细胞术的优化分析流程，用于表征并测定幼年大西洋鲷（Sparus aurata）头肾（硬骨鱼类主要的造血器官）中白细胞的活力状态。该流程首先通过汉克斯平衡盐溶液（Hanks' balanced salt solution）进行组织匀浆以分离白细胞，随后采用优化的Percoll密度梯度离心法，确保获得高回收率的白细胞，并最大限度减少红细胞污染，从而满足后续高效流式细胞术分析的要求。此外，本研究应用了一种新型细胞活性染料技术（LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit），根据荧光染色模式区分活细胞与死细胞。细胞固定采用3.7%甲醛处理，以保持细胞形态、活性及染色效率。流式细胞术成功鉴定了三种主要的白细胞群体：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。该方法不仅可用于细胞活力检测，还可实现细胞类型的准确区分。流式细胞术方案的改进推动了鱼类免疫学的发展，提高了免疫细胞分析的准确性与效率。此外，由于该方案允许细胞固定后进行后续分析，显著减少了免疫评估所需的时间和工作量，因此在多个研究领域中均具有重要的科研与应用价值。

引言

免疫在生物体的生理调节中起着核心作用，是抵御多种病原体和环境应激因素的主要防御机制¹。与其他脊椎动物一样，鱼类拥有复杂、动态且协调的免疫系统，对其整体健康和生存至关重要¹。

硬骨鱼类具有先天性和适应性免疫系统，二者协同作用以识别、应对并中和有害入侵者²。先天性免疫系统作为第一道防线，对病原体提供即时且非特异性的反应²，而适应性免疫系统则随着时间推移逐步发展，提供更特异的免疫应答，使鱼类能够识别特定病原体并建立免疫记忆³。鱼类的免疫系统依赖于特化的初级淋巴器官（即胸腺和头肾）以及次级淋巴器官（如脾脏和黏膜相关淋巴组织（MALT））来支持免疫防御并维持整体健康⁴。头肾是硬骨鱼类主要的造血器官，在免疫细胞（包括白细胞）的发育与成熟过程中发挥关键作用⁵。

近年来，在研究多种鱼类的免疫反应方面已取得显著进展²。其中一个关键研究领域是了解白细胞群体及其活性。白细胞也称为白血球，通常分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞，在鱼类的免疫防御中发挥着至关重要的作用。白细....

方案

本方案必须由具备动物实验认证资格的研究人员（欧盟职能A类和B类）执行。所有与动物操作和样本采集相关的程序均须遵守ARRIVE指南（动物研究：in vivo 实验报告规范），并符合欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）推荐的动物护理与使用伦理标准。本研究严格遵循上述所有标准以及葡萄牙实验动物科学相关法律法规（欧盟指令2010/63；第113/2013号法令）。本研究已获得葡萄牙海洋与大气研究所（IPMA）动物福利与伦理委员会（ORBEA，项目编号：LABVIVOS-002-AquaClimAdapt）批准，并由国家活体动物使用主管机构——食品与兽医总局（DGAV）监督，伦理许可编号为20596/25-S。

1. 研究模型与生物体的维持

注意：本研究专为平均体重为 30.0 ± 5.0 g、总长度为 12.0 ± 2.0 cm 的幼年黑鲷（Sparus aurata）设计。该方法可能不直接适用于其他鱼类物种，因为不同物种具有独特的生理和免疫学特征，可能影响白细胞的分离、细胞固定及活力评估。对于其他物种，可能需要对该实验方案进行调整，建议开展预实验以优化每种目标物种的实验条件。

1. 鱼类适应环境（检疫期）
   1. 将鱼类均匀分配至大容量水族箱中（例如，两个总容量各为660 L的水族箱——参见补充图1）。
      注....

结果

图6展示了代表性的流式细胞术数据，显示了从幼年金头鲷（Sparus aurata）头肾中分离的白细胞群体及其细胞活力，所用方法为本研究中描述的实验方案。该图比较了两个样本：一个是细胞活力较高的样本，其中鱼类处于最佳培养条件（图6A）；另一个是细胞活力较低的样本，其中细胞经历了热应激处理（图6B）。

在两个样本中，本方法均有效鉴定了三种主要的白细胞群体：淋巴细胞（LY）、单核细胞（MO）和粒细胞（GR）。这些群体根据细胞大小和复杂性的差异进行区分，该差异由前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）图示出。前向散射（FSC-A）反映细胞的相对大小，而侧向散射（SSC-A）反映细胞内部的复杂性或颗粒度，从而实现各群体的清晰分离。在最佳条件下（

讨论

本研究开发的方法代表了鱼类免疫学研究的重要进展，有望加深对鱼类免疫反应的理解，并促进海洋资源的可持续利用。S. aurata 是鲷科一种具有重要价值的海洋鱼类，因其生态和经济意义，以及在生理学、免疫学、毒理学和水产养殖等多个研究领域的实验室研究适用性，成为理想的模式生物²⁰。使用 S. aurata 的主要优势之一是其在实验室中易于操作和饲养，且已有成熟的养殖方案，可确保实验条件的一致性和可重复性²¹。此外，该物种具有较强的环境适应能力（即对温度和盐度波动等多种环境条件具有高度耐受性），使其成为改进养殖技术及评估环境因素对海洋生物影响研究的理想对象²²。由于 S. aurata 的免疫系统已得到充分表征，且基因组数据可及，因此有助于揭示鱼类免疫反应、病原体抗性、疫苗有效性及整体健康状况²⁰。鉴于其在水产养殖业以及南欧人群饮食习惯中的重要地位，对该物种的研究可直接影响养殖实践，提高其产量和可持续性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气石	N/A	N/A
水产饲料	SPAROS, Lda., Portugal	N/A	高品质饲料
自动细胞计数设备	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE自动细胞计数器（NanoEnteK）
自动水冷系统	佛山市唯诺制冷设备有限公司，中国	N/A
生物球 1.5" 水族池过滤器	TMC Iberia, Portugal	N/A
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, Germany	A7906
桶（3 L）	N/A	N/A	用于准备和实施安乐死
桶（5 L）	N/A	N/A	用于运输动物
细胞筛	Jetbiofil, 中国	CSS-013-100	细胞筛，100 μm 尼龙网，无菌，黄色
离心机	Fisher Scientific, Germany	N/A	accuSpin Micro 17 R
氨（NH₄⁺/NH₃）比色检测试剂盒	Tropic Marin, USA	N/A
硝酸盐（NO₃⁻）比色检测试剂盒	Tropic Marin, USA	N/A
亚硝酸盐（NO₂⁻）比色检测试剂盒	Tropic Marin, USA	N/A
计算机	N/A	N/A	用于获取和分析流式细胞仪所得数据
计算机化控制系统（Profilux）	GHL, Germany	N/A	ProfiLux 3 Outdoor
去离子水	N/A	N/A	用于清洁流式细胞仪
密度梯度介质：Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Germany	17-0891-01
电子天平	KERN & Sohn GmbH, Germany	N/A	KERN EMS 300-3
70%乙醇	Millipore, Supelco, Portugal	EX0281	用于保持工作区清洁
EVE细胞计数载片	NanoEnteK, Korea	N/A
Falcon管（15 mL）	pluriSelect生命科学，德国	05-00002-01	无菌
滤袋	TMC Iberia, Portugal	N/A	400微米
过滤海绵	N/A	N/A
流式细胞仪	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune流式细胞仪
FlowJo v10.8.1 软件	BD Life Sciences	N/A
37%甲醛	Sigma-Aldrich, Germany	8.18708
玻璃棉	N/A	N/A
Hanks'平衡盐溶液	Merck生命科学S.L, 葡萄牙	H6648	改良型，含碳酸氢钠，不含酚红、氯化钙和硫酸镁，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养
LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒	Life Technologies Europe, Netherlands	L10119	近红外荧光反应性染料 + DMSO
主水泵	EHEIM, Germany		Universal 1200
微量离心管（2 mL）	BRAND, Merck, Germany	Z628034	无菌
移液器吸头	Sartorius, Germany	790010, 790200, 791000	适用于Sartorius，1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
移液器	Sartorius, Germany	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µL, 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL
小型细胞筛	pluriSelect生命科学全球总部，德国	43-10100-50	PluriStrainer 100 µm 尼龙网，无菌
多参数测量仪	WTW, Germany		Multi 3420 SET G + IDS数字电导池（TetraCon 925）+ 光学IDS溶氧传感器（FDO 925）+ IDS pH电极（SenTix 940）
巴斯德移液管（1 mL, 5 mL）	Humeau Expert du laboratoire, France	248295	无菌
培养皿	Sarstedt, Germany	82.1194.500	60 x 15 mm，聚苯乙烯，无菌
pH计	Hanna Instruments Inc., Romania		HANNA HI2211
聚苯乙烯圆底Falcon管（5 mL）	Fisher Scientific, Germany	14-959-2A	无菌
便携式精密温度计	Ebro Electronic, Germany	N/A	TFX 430
蛋白质分离器	Mantis	N/A	Tornado 120
质控微球/性能测试微球	Thermofisher Scientific, USA	N/A
隔离箱	N/A	N/A	总容积为660 L的水箱
矩形玻璃水箱/水族箱	N/A	N/A	总容积为200 L的水箱
冰箱	N/A	N/A	用于在4 °C下储存样品
30 cm直尺	N/A	N/A	用于测量鱼的体长
碳酸氢钠	Honeywell Fluka, Germany	31437	碳酸氢钠（NaHCO₃）
氯化钠	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
无菌解剖工具	N/A	N/A	（例如手术刀、剪刀、尖头镊子、解剖盘/板）
浸入式数字加热器	TMC Iberia, Portugal		300 W，V2Therm数字加热器
1 mL注射器	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	无菌，HSW Soft-Ject注射器 用于研磨头肾
温度传感器	GHL, Germany		PT 1000
三卡因（MS-222）	ThermoFisher Scientific, Germany	118000500	3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，98%（C₁₀H₁₅NO₅S）
紫外线水体灭菌器	EHEIM, Germany	5305010	ClearUVC-36
水浴锅	Fisher Scientific, Germany	N/A	Fisherbrand IsotempTM（货号 U01318）
防水灯具	N/A	N/A