从DNA/RNA杂交复合物中估算端粒重复序列包含RNA

摘要

本方案可实现从多种组织中分离DNA:RNA杂交体及其相关RNA（包括TERRA）。尽管我们的方法能够捕获部分杂交体相互作用，但仍需进一步的基因组定位分析以完成全基因组范围的全面表征。

摘要

含端粒重复序列的RNA（TERRA）是一种在高等真核生物所有端粒上转录产生的长链非编码RNA，其中仅有一部分分子可在端粒处形成稳定的DNA/RNA杂交体。本文详述了一种用于鉴定和纯化此类杂交体的分子实验方案。该简化方法可直接提取天然形成的DNA/RNA杂交相互作用 体内 并可应用于检测所有此类区域。通过尽量减少操作步骤，该技术在分离与DNA结合的RNA方面具有很高的效率，可用于估算 下游测序的可靠性和可重复性。异硫氰酸胍试剂用于全细胞裂解和均质化，以保持核酸（DNA和RNA）的完整性，特别是DNA/RNA杂交体。加入氯仿后通过离心引发相分离（形成三个明显层次）：下层为苯酚-氯仿相，中间相和上层水相。从细胞核和细胞质中释放的RNA保留在水相中，而高分子量DNA（包括DNA/RNA杂交区域）则被限制在中间相。通过加入异丙醇并进行离心，可回收水相（游离RNA）、中间相以及DNA，特别是DNA/RNA杂交体。为去除残留的微量蛋白质，样品需经蛋白酶K孵育处理。随后采用DNase处理、苯酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀及离心，以释放与DNA杂交的RNA。

引言

基因组转录会形成一种临时的杂合分子，称为R-loop，其结构为三链构型。这种结构包含DNA的非编码链和编码链，其中非编码链被与其互补的RNA形成的杂合体所置换¹。在基因组转录过程中，两条DNA链会以不同的速率产生大量非编码RNA。这些RNA大多数作为短寿命的中间产物存在，但部分在调控基因组生物学的调控网络中发挥关键作用，尤其是来源于端粒和着丝粒等非编码区域的RNA¹。基因组中DNA/RNA杂合体的分布也可能反映细胞在特定时间点的转录活性。

随着人们对非编码RNA调控功能的兴趣日益增长，研究者越来越希望追踪其转录过程及在基因组中的分布情况，尤其是以短暂存在的DNA/RNA杂交体形式出现的情况。为解决这一问题，我们开发了一种独立的检测方法，可用于检测稳定的DNA/RNA杂交体，适用于任何生物细胞或组织。该方法能够分离与DNA共纯化的互补RNA，随后通过PCR沉淀或测序进行分析。

细胞培养模型的研究表明，在DNA复制和转录过程中，由于拓扑、结构和杂交事件，可能发生复制应激、DNA损伤、复制叉碰撞以及RNA聚合酶II暂停。这些过程，特别是DNA双螺旋的解旋，会引入扭转应力，从而在转录过程中导致异常结构（如R-loop）的形成¹。

目前大多数R-loop数据均基于酵母或培养的癌细胞，依赖于DNA-RNA杂交特异性单克隆抗体S9.6获得。结构研究表明，S9.6抗体的抗原结合片段（Fab）可特异性结合一段13 bp的RNA-DNA杂交双链¹。基于抗体的R-loop检测方法主要识别在转录过程中富含鸟嘌呤区域形成的杂交体，这些区域更易发生RNA-DNA杂交。体外（in vitro）研究显示，若RNA在其5′端附近含有四个或更多连续的鸟嘌呤，则更易被S9.6抗体检测到，这与R-loop形成增加相关¹。多种酶类，如解旋酶、拓扑异构酶、RNase H1和RNase H2，有助于在转录过程中维持R-loop的平衡。R-loop稳态的破坏与基因组不稳定性增加相关，可能导致癌症和神经退行性疾病等疾病的发生²。

端粒曾被认为在转录上是沉默的，但现已发现其可转录生成一种长链非编码RNA，称为端粒重复序列包含RNA（Telomeric Repeat-Containing RNA, TERRA）³。这些转录本起源于端粒近端区域，包含端粒重复序列，在维持端粒稳态中发挥重要作用⁴。在本文中，“TERRA-杂交RNA”指通过DNase I处理从DNA/RNA杂交复合物中释放出的RNA分子，其被认为含有TERRA序列，依据为提取特性及引物特异性。

TERRA 转录沿从着丝粒到端粒的方向进行，其长度可变，范围从 100 bp 到 9 kb，大部分 TERRA 以游离 RNA 分子的形式存在于水相中。一小部分 TERRA 仍与 DNA 结合，并与癌症和衰老等关键生物学过程相关联^4,5TERRA 水平因端粒亚端区位点的不同而变化，并受到端粒异染色质状态的调控⁶细胞培养研究还表明，来自不同亚端粒区域的TERRA转录本在长度上具有异质性。在一些肿瘤来源的细胞培养研究中，研究人员发现20q亚端粒区域是TERRA转录本的主要来源，且该区域的CpG岛常发生甲基化。^7,8,9在小鼠中，18号染色体的端粒近端区域是TERRA转录的主要位点¹⁰,¹¹此外，研究显示，在胚胎细胞中起源于假常染色体端粒旁区域的PAR-TERRA转录本，其TERRA含量可比18号染色体高出多达200倍。^11,12.

TERRA 的转录受到 DNA 甲基化和组蛋白修饰的调控，例如 H3K9 和 H4K20 的三甲基化会抑制 TERRA 的转录，而组蛋白乙酰化则与 TERRA 转录呈正相关^6,13,14。TERRA 还可结合到端粒外区域，包括基因间区和内含子区域，表明其在基因组调控中具有更广泛的作用²。

此外，TERRA 的耗竭会导致大量基因的失调，尤其是其结合位点附近的基因，表明其在染色质和基因表达的表观遗传调控中具有重要作用²。TERRA 在缩短的端粒处积累，可促进基于同源重组（HR）的端粒延伸，从而有助于维持端粒长度稳态¹⁵,¹⁶。

为了研究TERRA及其他DNA/RNA杂交分子的作用，我们采用了一种专门设计用于分离稳定与DNA杂交的RNA分子的检测方法。简言之，首先分离细胞核，并用无DNase的RNase处理以去除未受保护的RNA。随后通过选择性DNase消化提取DNA/RNA杂交体，从而释放原本与DNA杂交的RNA。该组分被称为"DNA/RNA杂交体相关RNA"，随后对其进行RNA测序分析，并与通过标准苯酚-氯仿抽提获得的总可溶性RNA进行比较¹⁷。该方法使我们能够鉴定出端粒区和非端粒区的RNA-DNA杂交形成位点，并比较DNA结合型RNA与可溶性RNA群体的转录组特征。TERRA最初被认为仅仅是端粒转录的副产物，如今已被确认在端粒维持中具有双重作用，可影响端粒酶活性和同源重组，这两者对于端粒长度稳态至关重要。此外，检测技术的进步使我们能够更深入地理解RNA与DNA在整个基因组范围内的动态相互作用。这些知识为进一步探索DNA/RNA杂交体（如TERRA）在细胞过程中的作用及其与癌症和神经退行性疾病等疾病的潜在关联奠定了基础。该领域的持续研究必将加深我们对基因组调控及其在健康与疾病中意义的理解。

本研究中用于鉴定TERRA分子以及DNA/RNA杂交体的方法，是本文详述的经优化的硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方案。该方案旨在通过统一的工作流程，同时分离RNA-DNA/RNA杂交体、总RNA和基因组DNA。通过对经典的三相分离法进行策略性改进，本方案可选择性地将DNA/RNA杂交体保留在苯酚相界面处，从而最大限度减少其损失——这是传统提取技术固有的局限性。

传统上，DNA/RNA 杂交体的检测与分离依赖于 S9.6 单克隆抗体的免疫沉淀，该抗体可特异性识别 DNA/RNA 杂交结构^18,19。尽管基于 S9.6 的方法被广泛使用，但其应用可能受限于抗体的可及性、成本以及潜在的交叉反应性。相比之下，本方案提供了一种成本低廉且不依赖抗体的替代方法，可便捷地应用于细胞和组织来源的样本。

为进一步提高分离的DNA/RNA杂交体组分的纯度和结构完整性，我们采用了蛋白酶K介导的去蛋白化处理，随后进行DNase I消化。DNase I步骤可选择性地降解DNA/RNA杂交体中的DNA链，从而释放出杂交的RNA，以便后续分离及下游分子分析²⁰。该方法确保所获得的RNA分子特异性地来源于体内稳定与DNA杂交的RNA。由于本方案具有模块化设计和可扩展性，可广泛适用于多种生物学体系，为研究人员在各种实验系统中探究DNA/RNA杂交体生物学提供了强有力的工具。

方案

所有涉及动物的实验方案均经埃尔吉耶斯大学动物伦理委员会批准（许可证号 19-07-2019，决议号 19/127）。 Balb/c 本研究使用了小鼠：5只健康的雌性小鼠，6周龄（25 g），以及5只雄性小鼠，8周龄（30 g）。小鼠的饲养和处理均遵循《实验室动物护理原则》（欧洲规定）。本研究所用的血液样本来自13名健康对照受试者，样本源于先前一项研究项目，该项目已获得埃西耶斯大学人类伦理委员会的伦理批准（决议编号：17/002）。本实验方案的图示摘要如下所示 图1使用无RNase的材料并在所有步骤中采用无菌技术，以尽量减少RNA降解。

1. 小鼠饲养

1. 为确定安乐死所需适当的麻醉剂量，称量每只小鼠的体重，并通过腹腔注射给予每公斤体重60 mg的氯胺酮和每公斤体重10 mg的赛拉嗪。
2. 给予麻醉后，通过脚趾夹捏测试无肢足回缩反射以及对触觉刺激无反应来确认麻醉完全。确认麻醉成功后，采用颈椎脱臼法实施安乐死。

2. 人体样本

1. 在筛选参与者时，排除任何慢性疾病（如糖尿病、心血管疾病、高血压或癌症）、急性感染、自身免疫或炎症性疾病、神经或精神疾病史，以及近期使用处方药物的情况，以选择健康对照者¹⁷。
2. 使用2 mm环钻工具从每位志愿者膝后区（腘窝）采集皮肤活检样本。操作前皮下注射局部麻醉剂，并在无菌条件下进行所有活检操作。

3. 所有细胞类型的 DNA/RNA 杂交提取

1. 组织收集与裂解
   1. 每次提取使用500 µL的心脏血、完整的下丘脑-垂体复合体、完整的肾上腺或单只小鼠的收集精子样本。
   2. 将所有收集的样本转移至无菌的1.5 mL离心管中。每管加入500 µL苯酚。充分涡旋混匀血液样本。
      1. 对于组织样本，使用2 mm注射器彻底匀浆，直至无可见碎片残留。
   3. 将离心管置于冷却块上以保持样本完整性。
      注意：处理苯酚、氯仿和乙酸铵等危险试剂时，务必始终遵循实验室安全规范。
2. 相分离
   1. 每管加入180 µL氯仿，短暂涡旋混匀。将离心管置于冰上孵育15分钟，以实现相分离。
   2. 检查样本——确保水相清晰透明。若水相浑浊，需再次涡旋并放回冰上继续孵育5分钟。
   3. 在12,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。
3. RNA沉淀
   1. 小心将澄清的水相转移至置于冷却块上的新的无菌1.5 mL微量离心管中。
   2. 向水相中加入等体积（1:1）的异丙醇，短暂涡旋混匀后，在冰上孵育15分钟。
   3. 在12,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。
      注意：RNA沉淀应可见于管底。
4. 洗涤RNA沉淀
   1. 小心倒置离心管以弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
   2. 向沉淀中加入1.5 mL 70%乙醇。轻轻敲击离心管5秒以进行洗涤。
   3. 在7,500 × g、4 °C条件下离心5分钟。
   4. 倒置离心管以弃去上清液。重复乙醇洗涤2次（共洗涤3次）。
5. RNA纯化
   1. 最后一次乙醇洗涤后，倒置离心管，让残留乙醇自然风干或用移液器小心吸除。
   2. 向RNA沉淀中加入100 µL无RNase水，轻轻吹打或轻弹管壁，使RNA完全重悬。
      注意：为防止RNA降解，应始终将RNA样本置于冰上或冷藏架/冷却块上。
6. RNA定量与保存
   1. 将含有重悬RNA的离心管置于冰上。
   2. 使用分光光度计测定RNA浓度和纯度。记录260 nm处的吸光度（A260）以确定RNA浓度。通过计算A260/A280和A260/A230比值评估纯度。
   3. 仅使用A260/A280比值在1.9至2.1之间的RNA样本进行后续实验。
      注意：本研究中，典型的RNA浓度范围为100至180 ng/µL。
   4. 将RNA样本储存于−80 °C，直至进一步使用。
7. 蛋白质去除与DNA分离
   1. RNA提取完成后，保留苯酚提取步骤中的中间相。
      注意：此步骤是必要的，因为中间相含有DNA，可在苯酚添加和离心后进一步处理以进行DNA提取。
   2. 以中间相为起始材料，按照步骤3.2.1–3.4.1进行DNA提取。小心地将苯酚提取中的全部中间相（含DNA）转移至置于冷却架上的无菌1.5 mL微量离心管中。
   3. 蛋白消化：向离心管中加入0.5 mL裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0；100 mM EDTA；0.1% SDS；400 µg/mL蛋白酶K）。在56 °C孵育过夜以消化蛋白质。
   4. DNA的盐析沉淀
      1. 次日，向每个样本中加入100 µL 5 M乙酸铵并短暂混匀。在室温下以1,788 × g离心20分钟。
      2. 小心将澄清的水相转移至新的无菌1.5 mL微量离心管中。向水相中加入等体积的分子生物学级异丙醇（1:1比例），通过轻柔倒置混匀，然后在室温下以1,788 × g离心10分钟。弃去上清液，注意不要扰动DNA沉淀。
      3. 用1 mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀，然后在室温下以1,788 × g离心10分钟。
      4. 移除并弃去乙醇洗涤液，让DNA沉淀短暂风干。
      5. 用50 µL无核酸酶水重悬干燥的DNA沉淀。
8. 去除游离核酸以纯化DNA：
   1. 将溶解的DNA上样至DNA离心柱中。在15,000 × g下离心15秒，弃去穿流液。
   2. 用70%乙醇洗涤离心柱2次，每次在15,000 × g下离心1分钟。每次洗涤后弃去穿流液。
   3. 将离心柱转移至干净的1.5 mL收集管中。向柱基质中加入30 µL无核酸酶水，在室温下孵育5分钟，然后在15,000 × g下离心1分钟以洗脱DNA。
   4. 将洗脱的DNA置于冰上。将样本分装至两个离心管中：一份用于在4 °C保存DNA，另一份用于后续的DNA/RNA杂交体提取。
9. 与DNA结合的RNA提取（DNA/RNA杂交体）
   1. DNase处理
      1. 通过混合5 µL（15 U）DNase I和75 µL 10倍DNase消化缓冲液，配制DNase消化混合液。
      2. 向干燥的DNA沉淀中加入80 µL DNase混合液。在室温下孵育15分钟。
   2. 苯酚-氯仿提取
      1. 向样本中加入300 µL苯酚，在室温下孵育5分钟。
      2. 向混合物中加入180 µL氯仿，在室温下继续孵育5分钟。
      3. 在4 °C下以最大转速（例如15,000 × g）离心10分钟以分离相层。小心将上层水相（含RNA:DNA杂交体）转移至新离心管中。
10. DNA/RNA杂交体分离
    1. 完成从步骤3.3至3.5.2的DNA/RNA杂交体分离。
    2. 向水相中加入等体积（1:1）的异丙醇，短暂涡旋混匀后，在冰上孵育15分钟。
    3. 在12,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。观察管底的RNA沉淀。小心倒置离心管以弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
    4. 向沉淀中加入1.5 mL 70%乙醇。轻轻敲击离心管5秒以进行洗涤。在7,500 × g、4 °C条件下离心5分钟。倒置离心管以弃去上清液。重复乙醇洗涤2次（共洗涤3次）。
11. RNA纯化：
    1. 最后一次乙醇洗涤后，倒置离心管，让残留乙醇自然风干或用移液器小心吸除。
    2. 向DNA/RNA杂交体沉淀中加入30 µL无RNase水，轻轻吹打或轻弹管壁，使RNA完全重悬。
    3. 将DNA/RNA杂交体样本储存于−80 °C，直至进一步使用。

4. cDNA 合成

注意：使用无 RNase/DNase 的材料，并在整个操作过程中将样品置于冰上，以确保 RNA、cDNA 和 DNA 的完整性。

1. 对于每个样本，使用 6 µL（20 ng RNA；按步骤 3.6.5 中游离 RNA 或步骤 3.13.3 中 DNA/RNA 杂交 RNA 的方法分离得到）。将所需体积的 RNA 转移至已标记的 PCR 管中。
2. 根据试剂盒制造商的说明配制 cDNA 合成预混液。每个反应中，确保预混液包含逆转录酶、dNTPs、引物、缓冲液和 RNase 抑制剂。在 PCR 管中，将每反应 14 µL 预混液与 6 µL RNA 样本混合（每反应总体积为 20 µL）。设置至少一个无逆转录酶（-RT）对照，即在平行反应中不添加逆转录酶，其余成分与实验组相同，使用等量 RNA。
3. 使用 表 1 中指定的温度程序，在热循环仪中进行 cDNA 合成。
4. 用无核酸酶水将所得 cDNA 按 1:5 比例稀释，并于 −80 °C 保存，直至进行 qPCR 分析。

5. 通过定量PCR测定TERRA表达水平

1. 根据制造商说明书，使用基于SYBR Green的qPCR试剂盒配制qPCR反应体系。每个反应中加入1 µL SYBR Green预混液、0. µL TERRA正向引物（见表2）、0. µL TERRA反向引物（见b）以及 µL无核酸酶水。
2. 将16 µL反应混合液分装至96孔qPCR板的每一孔中。
3. 向每孔中加入4 µL稀释后的cDNA（来自步骤4.6），使最终反应体积为20 µL。
   注意：每个样本至少设置两个技术重复和两个生物学重复。设置无模板对照（NTC）以检测是否存在污染，并设置无逆转录酶对照以确保信号来源于RNA。
4. 按照表3中指定的温度程序进行qPCR扩增。
5. 采用2^-ΔΔCt法将TERRA表达水平归一化至β-Actin（看家基因）。

6. 端粒长度的测定

1. 准备用于端粒长度测量的qPCR反应体系²¹。每个反应中加入1 µL SYBR Green Master Mix、0. µL端粒正向引物（见表2）、0. µL端粒反向引物（见表2）以及 µL无核酸酶水。
2. 将16 µL端粒反应混合液分配至96孔qPCR板的每个孔中。
3. 向每孔加入4 µL基因组DNA（来自步骤3.10.5），最终反应体积为20 µL。
4. 根据仪器制造商指定的相应程序参数进行qPCR扩增（见表3）。
5. 同时，使用相同浓度和终体积设置单拷贝参考基因（36B4）的反应体系。
6. 通过合成端粒寡核苷酸（表2）的系列稀释液生成标准曲线，以估算相对丰度和扩增效率。未进行绝对定量。相对端粒长度采用ΔCt法计算T/S比值（端粒重复序列拷贝数与单拷贝基因拷贝数之比）²¹。

结果

在本研究中，我们定量并比较了多种小鼠组织（血液、精子、皮肤、下丘脑、垂体、肾上腺）以及人血液和皮肤样本中游离TERRA、DNA/RNA杂交TERRA和端粒长度的水平，以探讨其组织特异性动态及其与端粒生物学的关系。游离TERRA通过苯酚-氯仿抽提后的水相分离获得 （实验步骤 3.6.1–3.6.5），富集未与染色质或 DNA 结合的细胞质和核质 RNA，包括 TERRA 分子。杂交型 TERRA 是指在端粒处参与形成 DNA/RNA 杂交链的 TERRA，其在经 DNase I 处理后（实验步骤 3.11）从间期组分中分离，确保仅回收稳定结合于端粒 DNA 的 TERRA。

通过使用酶学对照（如用于杂交体的RNase H消化以及先前已验证的qPCR引物）验证了各组分的特异性。定量PCR分析显示，在小鼠组织中，游离TERRA水平在血液中最高，但无统计学显著性（3.42 ± 3.99，p > 0.05），而在皮肤、肾上...

讨论

本方案的一个核心优势在于能够从复杂的组织样本中逐步提取并区分游离型TERRA和DNA/RNA杂交型TERRA。关键步骤包括在苯酚-氯仿抽提过程中仔细分离水相与中间层组分，因为交叉污染可能干扰游离型与杂交型TERRA之间的区分。随后对中间层组分进行DNase I处理也至关重要：消化不足可能导致与DNA结合的RNA无法被有效释放，而过度消化则可能降解杂交分子。使用经过验证的、针对杂交体特异性的酶学对照（如RNase H处理）以及qPCR引物组，对于确认各组分的特异性并避免假象至关重要^22，23。通过qPCR准确测定端粒长度还依赖于所分离DNA的质量与纯度，并需精确归一化至单拷贝基因²⁴。

尽管本研究未包含S9.6抗体染色或RNase H消化等正交验证实验，但已有文献证实，DNA/RNA杂交体在酚-氯仿抽提过程中定位于间期，并对DNase I消化敏感¹⁹。因此，我们将DNase...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL PCR管	格雷纳	671201
15 mL Falcon 管	伊索拉布	078.02.001
2 mL 注射器	Hayat	N/A
96-孔板	格雷纳	50-720-3203
无水乙醇	默克	1070172511
乙酸铵	Sigma	238074-500G
cDNA合成试剂盒	罗氏	07 912 439 001
氯仿	默克	1024451000
DNAse I 试剂盒	Zymo	E1010
EDTA	Sigma	E9884-1KG
玻璃瓶	伊索拉布	LB.IS.061.01.901
量筒	伊索拉布	015.01.901
异硫氰酸胍	Sigma	G9277-100G
异丙醇	默克	1096342511
Light Cycler 480 II	罗氏	5015278001
微量离心管（1.5 mL）	Greiner	616201
微量移液器（10 µL	Gilson	FD10001
微量移液器（100 µL)	Gilson	FD10004
微量移液器（1000 µL	Gilson	FD10003
微量移液器（2 µL	Gilson	GFAM00064
Nanodrop	岛津	C101-E112
PBS片剂	Sigma	P4417-50TAB
PCR仪	Sensoquest	T3-0140
PGL3 Basic 载体	Promega	#212936
移液器吸头（10 µL, 200 µL，1000 µL	格雷纳	772352
塑料培养皿	格雷纳	627102
蛋白酶K	Sigma	P6556-10MG
SDS	Sigma	8170342500
血清移液管	Greiner	760107
离心	Gilson	PMC880
Sybr Green Master	罗氏	4707516001
恒温混匀仪	Eppendorf	#5355
Trizma 碱	Sigma	1503-1KG
Trizol	伯乐（Bio-Rad）	7326890
Unimax 1010 DT 摇床	Heidolph	543-12310-00-6
涡旋混合	Heidolph	541-10000-00-1
Zymo-Spin I 离心柱	Zymo	C1003-50