从DNA/RNA杂交复合物中估算端粒重复序列包含RNA

摘要

本方案可实现从多种组织中分离DNA:RNA杂交体及其相关RNA（包括TERRA）。尽管我们的方法能够捕获部分杂交体相互作用，但仍需进一步的基因组定位分析以完成全基因组范围的全面表征。

摘要

含端粒重复序列的RNA（TERRA）是一种在高等真核生物所有端粒上转录产生的长链非编码RNA，其中仅有一部分分子可在端粒处形成稳定的DNA/RNA杂交体。本文详述了一种用于鉴定和纯化此类杂交体的分子实验方案。该简化方法可直接提取天然形成的DNA/RNA杂交相互作用 体内 并可应用于检测所有此类区域。通过尽量减少操作步骤，该技术在分离与DNA结合的RNA方面具有很高的效率，可用于估算 下游测序的可靠性和可重复性。异硫氰酸胍试剂用于全细胞裂解和均质化，以保持核酸（DNA和RNA）的完整性，特别是DNA/RNA杂交体。加入氯仿后通过离心引发相分离（形成三个明显层次）：下层为苯酚-氯仿相，中间相和上层水相。从细胞核和细胞质中释放的RNA保留在水相中，而高分子量DNA（包括DNA/RNA杂交区域）则被限制在中间相。通过加入异丙醇并进行离心，可回收水相（游离RNA）、中间相以及DNA，特别是DNA/RNA杂交体。为去除残留的微量蛋白质，样品需经蛋白酶K孵育处理。随后采用DNase处理、苯酚/氯仿抽提、异丙醇沉淀及离心，以释放与DNA杂交的RNA。

引言

基因组转录会形成一种临时的杂合分子，称为R-loop，其结构为三链构型。这种结构包含DNA的非编码链和编码链，其中非编码链被与其互补的RNA形成的杂合体所置换¹。在基因组转录过程中，两条DNA链会以不同的速率产生大量非编码RNA。这些RNA大多数作为短寿命的中间产物存在，但部分在调控基因组生物学的调控网络中发挥关键作用，尤其是来源于端粒和着丝粒等非编码区域的RNA¹。基因组中DNA/RNA杂合体的分布也可能反映细胞在特定时间点的转录活性。

随着人们对非编码RNA调控功能的兴趣日益增长，研究者越来越希望追踪其转录过程及在基因组中的分布情况，尤其是以短暂存在的DNA/RNA杂交体形式出现的情况。为解决这一问题，我们开发了一种独立的检测方法，可用于检测稳定的DNA/RNA杂交体，适用于任何生物细胞或组织。该方法能够分离与DNA共纯化的互补RNA，随后通过PCR沉淀或测序进行分析。

细胞培养模型的研究表明，在DNA复制和转录过程中，由于拓扑、结构和杂交事件，可能发生复制应激、DNA损伤、复制叉碰撞以及RNA聚合酶II暂停。这些过程，特别是DNA双螺旋的解旋，会引入扭转应力，从而在转录过程中导致异常结构（如R-loop）的形成¹。

目....

方案

所有涉及动物的实验方案均经埃尔吉耶斯大学动物伦理委员会批准（许可证号 19-07-2019，决议号 19/127）。 Balb/c 本研究使用了小鼠：5只健康的雌性小鼠，6周龄（25 g），以及5只雄性小鼠，8周龄（30 g）。小鼠的饲养和处理均遵循《实验室动物护理原则》（欧洲规定）。本研究所用的血液样本来自13名健康对照受试者，样本源于先前一项研究项目，该项目已获得埃西耶斯大学人类伦理委员会的伦理批准（决议编号：17/002）。本实验方案的图示摘要如下所示 图1使用无RNase的材料并在所有步骤中采用无菌技术，以尽量减少RNA降解。

1. 小鼠饲养

1. 为确定安乐死所需适当的麻醉剂量，称量每只小鼠的体重，并通过腹腔注射给予每公斤体重60 mg的氯胺酮和每公斤体重10 mg的赛拉嗪。
2. 给予麻醉后，通过脚趾夹捏测试无肢足回缩反射以及对触觉刺激无反应来确认麻醉完全。确认麻醉成功后，采用颈椎脱臼法实施安乐死。

2. 人体样本

1. 在筛选参与者时，排除任何慢性疾病（如糖尿病、心血管疾病、高血压或癌症）、急性感染、自身免疫或炎症性疾病、神经或精神疾病史，以及近期使用处方药物的情况，以选择健康对照者¹⁷。
2. 使用2 m....

结果

在本研究中，我们定量并比较了多种小鼠组织（血液、精子、皮肤、下丘脑、垂体、肾上腺）以及人血液和皮肤样本中游离TERRA、DNA/RNA杂交TERRA和端粒长度的水平，以探讨其组织特异性动态及其与端粒生物学的关系。游离TERRA通过苯酚-氯仿抽提后的水相分离获得 （实验步骤 3.6.1–3.6.5），富集未与染色质或 DNA 结合的细胞质和核质 RNA，包括 TERRA 分子。杂交型 TERRA 是指在端粒处参与形成 DNA/RNA 杂交链的 TERRA，其在经 DNase I 处理后（实验步骤 3.11）从间期组分中分离，确保仅回收稳定结合于端粒 DNA 的 TERRA。

通过使用酶学对照（如用于杂交体的RNase H消化以及先前已验证的qPCR引物）验证了各组分的特异性。定量PCR分析显示，在小鼠组织中，游离TERRA水平在血液中最高，但无统计学显著性（3.42 ± 3.99，p > 0.05），而在皮肤、肾上.......

讨论

本方案的一个核心优势在于能够从复杂的组织样本中逐步提取并区分游离型TERRA和DNA/RNA杂交型TERRA。关键步骤包括在苯酚-氯仿抽提过程中仔细分离水相与中间层组分，因为交叉污染可能干扰游离型与杂交型TERRA之间的区分。随后对中间层组分进行DNase I处理也至关重要：消化不足可能导致与DNA结合的RNA无法被有效释放，而过度消化则可能降解杂交分子。使用经过验证的、针对杂交体特异性的酶学对照（如RNase H处理）以及qPCR引物组，对于确认各组分的特异性并避免假象至关重要^22，23。通过qPCR准确测定端粒长度还依赖于所分离DNA的质量与纯度，并需精确归一化至单拷贝基因²⁴。

尽管本研究未包含S9.6抗体染色或RNase H消化等正交验证实验，但已有文献证实，DNA/RNA杂交体在酚-氯仿抽提过程中定位于间期，并对DNase I消化敏感¹⁹。因此，我们将DNase.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 mL PCR管	格雷纳	671201
15 mL Falcon 管	伊索拉布	078.02.001
2 mL 注射器	Hayat	N/A
96-孔板	格雷纳	50-720-3203
无水乙醇	默克	1070172511
乙酸铵	Sigma	238074-500G
cDNA合成试剂盒	罗氏	07 912 439 001
氯仿	默克	1024451000
DNAse I 试剂盒	Zymo	E1010
EDTA	Sigma	E9884-1KG
玻璃瓶	伊索拉布	LB.IS.061.01.901
量筒	伊索拉布	015.01.901
异硫氰酸胍	Sigma	G9277-100G
异丙醇	默克	1096342511
Light Cycler 480 II	罗氏	5015278001
微量离心管（1.5 mL）	Greiner	616201
微量移液器（10 µL	Gilson	FD10001
微量移液器（100 µL)	Gilson	FD10004
微量移液器（1000 µL	Gilson	FD10003
微量移液器（2 µL	Gilson	GFAM00064
Nanodrop	岛津	C101-E112
PBS片剂	Sigma	P4417-50TAB
PCR仪	Sensoquest	T3-0140
PGL3 Basic 载体	Promega	#212936
移液器吸头（10 µL, 200 µL，1000 µL	格雷纳	772352
塑料培养皿	格雷纳	627102
蛋白酶K	Sigma	P6556-10MG
SDS	Sigma	8170342500
血清移液管	Greiner	760107
离心	Gilson	PMC880
Sybr Green Master	罗氏	4707516001
恒温混匀仪	Eppendorf	#5355
Trizma 碱	Sigma	1503-1KG
Trizol	伯乐（Bio-Rad）	7326890
Unimax 1010 DT 摇床	Heidolph	543-12310-00-6
涡旋混合	Heidolph	541-10000-00-1
Zymo-Spin I 离心柱	Zymo	C1003-50