富血小板血浆（PRP）用于治疗马匹肌肉骨骼系统疾病。不同的制备技术所获得的PRP中血小板和白细胞浓度各不相同。本文介绍一种从马血液中获取PRP的方法。
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摘要
摘要
富血小板血浆（PRP）被广泛用作治疗马匹慢性肌肉骨骼疾病的常规手段，例如骨关节炎、肌腱病和韧带病。这种疗效源于该骨科生物制剂激活后释放的高浓度生长因子和抗炎性细胞因子，无论其为内源性或外源性激活。尽管其应用日益普及，目前仍明显缺乏展示如何在马匹中制备PRP技术的教学视频。
本研究探讨了一种通过双离心管法从马匹中获取富血小板血浆（PRP）的方法。采集六匹马的全血至含柠檬酸钠的采血管中，先后在120 × g 条件下离心5分钟，再在240 × g 条件下离心5分钟。PRP中平均血小板浓度为360.95 ± 56.31 × 103/µL，平均白细胞浓度为3.05 ± 1.53 × 103/µL。PRP中血小板计数是全血的2.41倍，而白细胞浓度则为全血的0.44倍。PRP中血小板的回收效率为17%，白细胞的回收效率为3.1%。PRP中转化生长因子β1和血小板源性生长因子BB的平均浓度分别为2601.82（95%置信区间（CI）：2358.88–2844.76）pg/mL和1208.05（95% CI：1051.09–1365.02）pg/mL。结果表明，该方法操作简便、成本低廉，可高效且可重复地制备PRP，适用于马匹临床实践。
引言
富血小板血浆（PRP）是一种常用的骨科生物制剂，常用于治疗马匹慢性肌肉骨骼疾病，如肌腱病、韧带病、骨关节炎和蹄叶炎1,2,3。它在肢体创伤和眼表疾病治疗中也具有疗效4,5。其应用原理主要基于血小板释放的高浓度生长因子（GFs）6。白细胞也通过释放调节性及抗炎性细胞因子发挥作用7。例如转化生长因子β1（TGF-β1）和血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）等生长因子具有显著的合成代谢、促增殖、促血管生成及抗炎作用8。在内源性或外源性激活后，PRP可聚合形成富血小板凝胶，促进细胞迁移、锚定和分化6,9。因此，PRP不仅作为生长因子和细胞因子的载体，更是一种复杂的活性支架结构10。
目前有多种系统用于对人类和马匹中使用的富血小板血浆（PRP）产品进行分类6,11,12。其中最简单且最常用的系统是根据白细胞浓度对这些血液成分进行分类11,12。根据该分类方法，与马全血中的水平相比，白细胞浓度较低或可忽略不计、血小板浓度为低至中等水平的PRP产品被称为纯富血小板血浆（P-PRP）6,11,12。相反，白细胞浓度为可检测至高水平、血小板浓度为中等至高水平的PRP产品则被称为富含白细胞和血小板的血浆（L-PRP）6,11,12。
P-PRP 产品通常通过管对管离心法获得，即在含有抗凝剂（如柠檬酸钠以及柠檬酸盐、磷酸盐和葡萄糖）的试管中采集马的全血13。血液需经过两次离心，以将血小板与其他成分分离14。相比之下，L-PRP 产品主要使用为人类血液设计的半自动化试剂盒制备，其中一些试剂盒已验证可用于马6,15。这些半自动化试剂盒通常需要专用离心机，成本较高16，并且可能存在无菌操作方面的顾虑，从而在临床环境中增加实际使用的复杂性17。此外，这些试剂盒可能导致白细胞或红细胞过度浓缩，这在某些临床情况下可能产生不利影响18。例如，白细胞计数升高可能引发过度炎症反应，而红细胞过多可能干扰愈合过程，或导致组织刺激或排斥等并发症15；然而，一种常用的马源性 L-PRP 制备方法是基于重力沉降的流程，无需使用专用设备19。
鉴于这些局限性，开发更简单且更具成本效益的PRP制备替代方法显得尤为必要。各种 体外 研究表明，骨骼肌肉系统疾病的实验模型以及马匹的观察结果均证实，富血小板血浆（P-PRP）和白细胞富集型富血小板血浆（L-PRP）产品对经治疗的细胞和组织均具有有益作用1,2,20这些产品可促进愈合、减轻炎症并增强组织再生6然而，选择使用P-PRP或L-PRP治疗马匹可能受到技术和经济因素的影响。
根据作者所述，目前尚无已发表的研究对从马血液中获取富血小板血浆（PRP）产品的广泛验证的逐步操作流程进行完整描述和全面演示。本文概述了从马安全采集全血并制备适用于实验和临床应用的PRP产品所需的操作步骤。同时，通过血小板和白细胞的定量分析，以及对其治疗作用至关重要的TGF-β1和PDGF-BB浓度的测定，对这种骨科生物制剂进行了验证。本研究通过标准化制备流程并验证产品的有效性，旨在为马科临床 practitioners 提供一种可靠且易于实施的方法，以确保PRP制备过程的可重复性与精确性。
尽管用于制备马PRP的二次离心法最早由Argüelles等人于2006年描述14，但本视频首次完整展示了该实验方案。本视频旨在为马科临床 practitioners 提供一种实用资源，帮助那些因技术条件有限和预算受限而无法使用更复杂且昂贵的PRP试剂盒来治疗患有肌肉骨骼系统疾病的马匹的兽医。
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方案
本研究遵循哥伦比亚马尼萨莱斯考卡大学兽医教学医院关于马匹富血小板血浆（PRP）制备与使用的内部操作规程进行。由于数据来源于本机构临床治疗的跛行马匹，本研究无需经过内部动物护理委员会审批。本方案的建立采用了6匹哥伦比亚克里奥尔马（3匹母马和3匹骟马）的数据，平均年龄为7.4（± 2.6）岁。马主已被告知研究性质，并签署了知情同意书。纳入研究的所有马匹除正在治疗的肌肉骨骼问题外，临床上均健康。仅纳入基础血小板计数高于100 × 103/mL全血的动物。需要注意的是，血小板浓度较低的马匹可能被视为血小板减少症14。此外，这些动物的血液学计数、肝脏和肾脏临床生化指标以及尿液分析结果均处于马属动物正常范围内。
1. 马匹固定与皮肤消毒
- 为了保障马匹和兽医的安全，应将马（Eqcus caballus）稳妥地固定在临床检查通道中，或使用缰绳进行约束（图1A），具体方式取决于动物的行为表现。随后，使用电动剃刀在颈部一侧中段、颈静脉上方区域剃除一块 5 cm × 5 cm 的毛发。
注意：部分马主可能不希望剃除毛发。已有研究表明，在穿刺部位剃除毛发对于预防富血小板血浆（P-PRP）的细菌污染并无必要21。因此，是否执行此步骤由兽医自行决定。 - 使用非无菌纱布和手套，对颈静脉剃毛区域及其周围至少 10 cm 范围进行初步的非无菌皮肤准备，持续约 3 分钟。将数块浸有消毒泡沫的纱布以环形方式涂抹于该区域（图1B）。
- 使用无菌手套及浸有消毒剂的无菌纱布，对穿刺部位进行无菌处理。以环形手法擦拭颈部皮肤，持续约 5 分钟。最后用浸有 95% 乙醇的无菌纱布清洁该区域。
2. 无菌采血
- 将16个已用95%乙醇浸湿的纱布清洁过的4.5 mL枸橼酸钠试管放入洁净的塑料架中。用95%乙醇浸润真空采血管的橡胶帽，特别是针头连接处的凹槽。
注意：通常需要八支4.5 mL枸橼酸钠试管以获得2.5 mL富血小板血浆（PRP）。具体使用试管数量取决于所治疗的软组织或特定关节。 - 无菌操作下将蝶形针插入已消毒的颈静脉部位（图2A），并将4.5 mL枸橼酸钠试管连接至采血器（图2B）。轻轻摇动试管后置于塑料架中。
注意：一支4.5 mL枸橼酸钠试管用于自动化血常规检测，并在高速离心后制备血浆。该血浆随后作为阴性对照，用于与PRP进行生长因子和细胞因子富集程度的比较。
3. 富血小板血浆的制备
- 将含有全血的4.5 mL枸橼酸钠试管放入台式离心机的四孔摆动转子中，倾斜角度为90°。在室温下以120 × g离心5分钟。离心后，将含有枸橼酸抗凝血的4.5 mL试管以及另外两个10 mL普通试管置于试管架中，并将试管架放置于II级生物安全柜内操作者非优势手一侧，置于无菌、不透水的铺巾上。
注意：有研究提示，在PRP制备过程中，II级生物安全柜并非必不可少，以防止细菌污染21。相反，PRP可在无气流和灰尘的洁净室内制备。在此情况下，可将血样试管架放置于覆盖有无菌、不透水铺巾的桌面上。 - 第一次离心：佩戴口罩和无菌手套，将一支连接无菌针头（21 G 5/8"）的10 mL无菌鲁尔注射器放置于生物安全柜内操作者优势手一侧。
注意：从此时起，操作者优势手始终维持无菌状态，而枸橼酸钠试管的橡胶帽应使用非优势手摘除。 - 将无菌针头插入每支已离心的枸橼酸抗凝血试管中，针尖位于白膜层上方3 mm处（图3A），轻柔吸取50%的血浆部分，避免液体湍流和血液吸入。当从四支4.5 mL试管中共吸取10 mL血浆后，将其分装至5–10 mL无菌普通试管中（图3B）。
注意：使用非优势手取下这些试管的橡胶帽，并将其放置于铺巾上的无菌区域或手持，以避免细菌污染。 - 第二次离心：重新用橡胶塞封闭试管，将其以平衡状态放入台式离心机的四孔摆动转子中，倾斜角度为90°，在室温下以240 × g离心5分钟。
注意：相对离心力（RCF或g）的选择基于一项开创性研究14，该研究首次描述了从马血中获取PRP的方法。此外，其他研究者已对该方法的可重复性进行了评估22。 - 将试管放回试管架中，并将其置于II级生物安全柜内非优势手一侧，放置于先前铺设的无菌、不透水铺巾上方。
- 使用非优势手取下橡胶帽，使用连接18 G、90 mm脊髓穿刺针的10 mL无菌鲁尔注射器，用无菌优势手缓慢吸取前75%的血浆（图3C）。弃去该注射器，或将其保留用于其他实验或临床用途，因其内含血小板贫乏血浆（PPP）。随后，将先前使用的无菌脊髓穿刺针连接至5 mL或10 mL无菌鲁尔注射器，吸取5–10 mL无菌普通试管中剩余的25%血浆。该部分称为P-PRP（图3D）。
注意：在某些临床和实验条件下，可取0.5–1 mL PRP样本用于自动化血细胞分析，随后通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测生长因子（TGF-β1和PDGF-BB）。这些介质的测定可在P-PRP经钙盐或凝血酶激活后3小时进行23，或在通过温度变化或添加非离子型去污剂诱导细胞损伤后进行24。 - 用一小块带附着无菌针头或帽的不透水无菌铺巾包裹含有PRP的无菌鲁尔注射器，以防止该骨科生物制品受到细菌污染（图4A）。
注意：应按照本方案第1节所述，对拟治疗马匹的解剖结构进行无菌注射前准备。应充分保定并镇静马匹，以减轻不适并确保马匹和兽医人员的安全。PRP制品应使用无菌手套和针头操作，是否激活可根据操作者的偏好决定（图4B）。
4. 统计学分析
- 采集全血和富血小板血浆（PRP）中的血小板和白细胞计数数据。使用 Kolmogorov-Smirnov 检验评估数据的正态性。若数据呈正态分布（P > 0.05），则采用 t 检验对细胞数据进行比较和分析；若血小板和白细胞浓度数据非正态分布（P < 0.05），则采用 Wilcoxon 检验进行比较和分析。
- 根据以下公式计算 P-PRP 中血小板和白细胞的富集效率25：
血小板回收效率 =
× 100
白细胞回收效率 =
× 100 - 采集血浆（阴性对照）、PRP 上清液（经葡萄糖酸钙激活 3 小时后）以及通过加入非离子型去垢剂溶液获得的 PRP 裂解物中 TGF-β1 和 PDGF-BB 的浓度数据。
- 采用广义线性混合模型比较血浆、PRP 上清液与 PRP 裂解物之间的生长因子浓度。若存在显著统计学差异，则进行 Tukey 事后检验。
- 所有检验中，以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
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结果
PRP 中的平均血小板计数（血小板 × 103/µL）显著高于全血（p < 0.001）。相比之下，PRP 中的平均白细胞浓度（白细胞 × 103/µL）显著低于全血（p < 0.001）（表 1）。具体而言，PRP 中的血小板计数比全血高 2.41 倍，而 PRP 中的白细胞浓度则低 0.44 倍。PRP 中血小板的回收效率为 17%，而白细胞的回收效率为 3.1%。
血浆、PRP 上清液和 PRP 裂解液之间的 TGF-β1 浓度差异具有显著性（p < 0.001），其中 PRP 裂解液的浓度最高，其次为 PRP 上清液，血浆最低（图 5A）。另一方面，PRP 上清液和 PRP 裂解液中的 PDGF-BB 浓度均显著高于血浆（p < 0.001）（图 5B）。
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讨论
在人类医学和兽医学中，使用PRP治疗慢性肌肉骨骼系统疾病的应用日益增多1,8,26,27。然而，PRP在实验和临床应用中的一个主要批评是缺乏关于制备这些血液成分所采用技术与方案的基本数据28。此外，对于最终PRP产品的细胞组成——特别是血小板和白细胞的浓度——以及生长因子含量，目前仍缺乏足够的信息28,29。
在此背景下，我们介绍一种用于制备经验证的马源PRP产品的简单方案，该方案已在体外in vitro30,31,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢哥伦比亚卡爾達斯大學（Universidad de Caldas）研究與研究生副校長辦公室為發表本文提供的財政支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 普通静脉采血管 | BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA | Ref 366430 | 此仅为示例，也可使用其他品牌的采血管。 |
| 4.5 mL 枸橼酸钠试管（105 M/3.2%） | BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA | 107451 | 此仅为示例，也可使用其他品牌的试管。 |
| 台式离心机 | Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Germany | 可使用其他型号的台式离心机。 | |
| 蝶形针头（21 G × 0.75 in.），带 12 in. 延长管及预装持针器 | Safety-Lok 血液采集套装，BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA | Ref 367296 | 此仅为示例，也可使用其他品牌的蝶形针头。 |
| 2.3–4% 氯己定泡沫溶液 | 此类产品的品牌或商品名可能因国家而异。 | ||
| II 级生物安全柜 | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA | 可使用其他型号的 II 级生物安全柜 | |
| ELISA 酶标仪 | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| 95% 乙醇 | 此类产品的品牌或商品名可能因国家而异。 | ||
| 人 PDGF-BB DuoSet ELISA 试剂盒 | R&D Systems, Inc, McKinley Place, MN, USA | DY220 | |
| 人 TGF-beta 1 DuoSet ELISA 试剂盒 | R&D Systems, Inc, McKinley Place, MN, USA | DY240 | |
| 4–10% 聚维酮碘泡沫溶液 | 此类产品的品牌或商品名可能因国家而异。 | ||
| SPSS 25.0 软件 | IBM Corp, SPSS, NY, USA | ||
| 无菌鲁尔接头注射器（多种规格） | Discardit 注射器，BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA | 此仅为示例，也可使用其他品牌的注射器。 | |
| 无菌脊髓穿刺针（18 G × 90 mm） | BD Quincke 脊髓穿刺针，Franklin Lakes, NJ, USA | 此仅为示例，也可使用其他品牌的脊髓穿刺针。 |
参考文献
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