我们提出了一种优化的方案，用于处理完整的人类肾脏，以分离和培养原代肾近端小管上皮细胞，并将这些细胞应用于一种三维微流控微生理系统平台，以模拟肾近端小管的功能。
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方法文章
分离原代人近端小管上皮细胞及其在构建肾脏近端小管微生理模型中的应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肾脏疾病影响全球超过8.5亿人，其中包括3700万美国人。风险因素包括 慢性肾病的成因包括环境因素、遗传易感性、共存的医学状况以及急性肾损伤病史。这些因素通常需要数月甚至数年才会发展成疾病，从而增加了对疾病病因学和病理生理学进行纵向研究的复杂性。为了加深对疾病机制的理解并提高药物研发中的肾毒性预测能力，亟需更先进的肾脏模型。肾脏中的近端小管上皮细胞（PTECs）在异源物质和毒素清除以及重要营养物质的重吸收过程中发挥着关键作用。我们先前已证明，利用分离得到的原代PTECs构建三维（3D）微生理系统（MPS）平台，可用于研究肾脏药物相互作用、评估化合物的肾毒性，并预测药物清除率。本文中，我们介绍了从完整的人类肾脏中分离和培养原代PTECs的实验方案，以及将其接种至模拟肾脏生理环境的3D MPS平台中的操作流程 体内 肾脏生理学。该方案支持在MPS装置中对近端肾小管上皮细胞的活力、生理形态以及关键转运蛋白的功能极化进行长达6个月的长期研究。
引言
肾脏在清除和排出体内多种外源性物质、毒素以及内源性化合物方面发挥着关键作用。这一过程通过滤过血液以清除代谢废物，同时调节电解质平衡、体液容量和酸碱度来实现。每个人类肾脏包含约一百万个肾单位，肾单位是肾脏的结构和功能基本单位1。在这些肾单位中，近端小管内的特化上皮细胞，即近端小管上皮细胞（PTECs），负责重吸收葡萄糖、氨基酸和离子等重要分子，同时也将药物底物和潜在有毒物质分泌至尿液中2,3,4。在某些情况下，PTECs还可将尿液中的化合物重新吸收回血液4。由于PTECs在药物与毒素相互作用中具有关键作用，因此从人肾脏分离获得的原代PTECs为研究肾脏药物-药物相互作用（DDIs）以及评估化合物的肾毒性提供了重要的研究工具。
药物诱导的肾毒性是一个重要的临床挑战，因其可导致急性肾损伤和慢性肾病5因此，深入了解肾近端小管的生理学特性对于准确预测和表征药物及毒素的肾毒性潜力至关重要。传统的 体外 模型，包括永生化肾细胞系（例如 RPTEC-TERT1、HK-2），在模拟人近端小管的复杂结构和功能方面存在局限性
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方案
所有工作均遵循华盛顿大学的人体组织处理指南进行。合适的供体需满足以下要求：冷缺血时间（CIT）少于36小时，无已知的肾脏疾病、透析史或其他任何医学状况（例如1型或2型糖尿病、乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、病毒性/细菌性脑膜炎、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染、梅毒、败血症或新型冠状病毒肺炎（Covid-19））。本研究中使用的人全肾通过经联合国器官获取组织（UNOS）批准的器官获取组织（OPO）获得。
1. 生物安全柜准备
- 用70%乙醇喷洒超净台表面。对生物安全柜内的所有表面和物品进行去污，以创造无菌环境。
- 铺上蓝色吸水垫。所有组织操作均应在这些垫子上进行。
- 确保生物安全柜内已备齐所需设备并经过适当灭菌处理（剃刀刀片、刻度移液管吸头、刻度移液管枪、100 µm细胞筛、p1000吸头、1000 µL微量移液器、15 cm圆形培养皿和锥形管）。
2. 肾脏预处理准备
- 通过将 0.75 mg/mL 胶原酶 IV 和 0.75 mg/mL 分散酶 II 加入含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，制备肾脏消化液。使用 0.2 µm 无菌膜滤器过滤该溶液。
注意：对于一个完整的人类成年肾脏，大约需要 14 个 5....
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结果
原代近端肾小管上皮细胞在二维培养中随时间推移的形态学特征与汇合状态
从肾皮质分离后，PTECs需在首次换液前至少静置培养48小时。细胞接种培养约一周后，培养瓶中应出现多个具有均一上皮样、鹅卵石状形态的小细胞群（图1A、B）。根据来自不同供体的PTECs生长速度差异，通常在培养10天左右时，细胞汇合度应达到约50%–60%（平均情况）（图1C）。培养约14天后，细胞应达到完全汇合状态（图1D），此时可用于传代、冻存或接种至MPS装置中。平均而言，一个完整的人类肾脏可提供足量PTECs填满14个T-75培养瓶。为防止污染，在培养期间必须采用无菌操作技术，并在培养基中添加抗生素。
将PTEC注入MPS装置
在MPS装置包被I型和IV型胶原蛋白后，即可用于以三维形式培养PTEC。如.......
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讨论
MPS 或器官芯片技术提供了一种高度相关的 体外 一种可重现人体生理关键特征的平台，从而减少药物开发和毒理学评估中对动物模型的依赖。近期，美国食品药品管理局现代化法案 2.0 版（2022 年）已允许在新药临床试验申请中纳入膜片钳系统（MPS）等替代方法29. 本方案详细描述了从人供体皮质组织中分离近端肾小管上皮细胞（PTECs）并将其用于微生理系统（MPS）平台的标准操作流程，旨在模拟人近端肾小管功能，并评估外源性物质引起的肾毒性反应图2).
维持高PTEC存活率的一个重要因素是尽量缩短热缺血时间（WIT）。我们建议使用WIT小于1小时的肾脏。虽然冷缺血时间（CIT）小于24小时最为理想，但在肾脏供体有限的情况下，CIT最长可耐受至36小时。另一个关键步骤是正确的组织处理，包括去除外层膜结构、内脏脂肪，并将皮质与髓质充分分离，以最大限度提高PTEC纯度。我们发现，使用胶原酶IV和分散酶联合消化，而非仅使用胶原酶I10
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披露
作者声明他们与本研究无任何利益冲突或相关财务披露。
致谢
本工作的部分研究得到了美国国家航空航天局（NASA）合同80ARC023CA001、国家转化科学促进中心（NCATS）（U2CTR004867、UH3TR000504、UG3TR002158）、NCATS与太空科学促进中心（CASIS）联合资助（UG3TR002178）、国家环境卫生科学研究所（NIEHS）（P30ES00703）、国家普通医学科学研究所（T32GM007750）、西北肾脏中心向肾脏研究所提供的无限制捐赠，以及华盛顿大学药学院（Ji-Ping Wang奖和Bradley奖学金）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 鲁尔锁接头尖端注射器 | 贝克顿·迪金森 | 309628 | |
| 1.5 mL 微型离心管 | CELLTREAT 科学产品 | 229442 | |
| 15 mL 无菌圆锥形聚丙烯试管 | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 3D微生理装置 | Nortis | TCC-001 | |
| 5 mL鲁尔锁扣式针筒尖端 | 贝克顿，迪金森 | 309646 | |
| 50 mL 无菌圆锥形聚丙烯管 | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 抗生素-抗真菌素（100x） | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| IV型胶原酶，粉末状 | ThermoFisher Scientific | 17104019 | |
| D-(+)-葡萄糖 | MilliporeSigma | G8270 | |
| 明确的胰蛋白酶抑制剂 | ThermoFisher Scientific | R007100 | |
| 二甲基亚砜，生物试剂，Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher Scientific | J66650-AK | |
| Dispase II，粉末 | 赛默飞世尔科技 | 17105041 | |
| 杜尔贝科’DMEM/F-12（无葡萄糖） | 美国生物生命科学 | D9807-02 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），含钙、镁 | ThermoFisher Scientific | 14040117 | |
| 胎牛血清（FBS），优级 | ThermoFisher Scientific | A5670701 | |
| Finnpipette F2 优良实验室操作（GLP）移液器套装 | ThermoFisher Scientific | 05-719-511 | 移液管 |
| Fisherbrand SureOne Micropoint 吸头，通用型，非滤芯式 | Fisher Scientific | 02707407, 02707410, 02707438 | |
| 新鲜完整的人体肾脏 | 诺瓦比奥시스 | https://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/ | 人类肾脏通过Novabiosis获取，这是一家经UNOS批准的器官获取组织（OPO） |
| 加湿培养箱（37 °C 和 5% CO2) | Fisher Scientific | 51033556 | |
| 氢化可的松 | MilliporeSigma | H0888 | |
| 旋转振荡培养箱 | Avantor | 12620-946 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（100倍浓度）（ITS-G） | ThermoFisher Scientific | 41400045 | |
| 内螺纹低温冻存管 | 康宁 | 430487 | |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| 鲁尔接头（钝头针），22 G × 0.5 英寸 | Instech Laboratories, Inc. | LS22 | |
| Medium 199，Earle's 盐溶液（10倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | 21180021 | |
| Megafuge 8 小型台式离心机 | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| 金属连接器（钝头） | Instech Laboratories, Inc. | SC 20/15 | |
| Mr. Frosty 冷冻容器 | ThermoFisher Scientific | 5100-0036 | |
| 尼康Eclipse Ti-S显微镜 | 尼康仪器 | https://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/ | 原始模型已停用 |
| Nunc 未处理培养瓶，T-25 | 赛默飞世尔科技 | 169900 | |
| Nunc 未处理培养瓶，T-75 | ThermoFisher Scientific | 156800 | |
| 移液管，10 mL，刻度，0.1 mL，无菌 | Greiner Bio-One | 607180 | |
| 硅胶管，C-flex 管（内径：0.020"，OD：0.083") | Cole-Parmer | 06422-00 | |
| 单刃剃须刀片（无菌） | Bioseal | KI-205/50 | |
| 碳酸氢钠 | 默克生命科学 | S6297 | |
| 氢氧化钠 | MilliporeSigma | S8045 | |
| 带PES膜的无菌一次性滤器单元 | ThermoFisher Scientific | 567-0020 | |
| 组织培养处理培养皿，150 mm x 20 毫米 透气盖 | Genesee Scientific | 25-203 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红 | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| I型胶原蛋白，大鼠尾部 | Corning | 354236 | |
| IV型胶原蛋白，小鼠 | Corning | 354233 |
参考文献
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational stu....
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