需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

分离原代人近端小管上皮细胞及其在构建肾脏近端小管微生理模型中的应用

1.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67997

⸱

2025年5月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, University of Washington, 2Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Washington, 3Kidney Research Institute, Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Washington, 4Barbara T. Murphy Division of Nephrology, Samuel Bronfman Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种优化的方案，用于处理完整的人类肾脏，以分离和培养原代肾近端小管上皮细胞，并将这些细胞应用于一种三维微流控微生理系统平台，以模拟肾近端小管的功能。

摘要

肾脏疾病影响全球超过8.5亿人，其中包括3700万美国人。风险因素包括 慢性肾病的成因包括环境因素、遗传易感性、共存的医学状况以及急性肾损伤病史。这些因素通常需要数月甚至数年才会发展成疾病，从而增加了对疾病病因学和病理生理学进行纵向研究的复杂性。为了加深对疾病机制的理解并提高药物研发中的肾毒性预测能力，亟需更先进的肾脏模型。肾脏中的近端小管上皮细胞（PTECs）在异源物质和毒素清除以及重要营养物质的重吸收过程中发挥着关键作用。我们先前已证明，利用分离得到的原代PTECs构建三维（3D）微生理系统（MPS）平台，可用于研究肾脏药物相互作用、评估化合物的肾毒性，并预测药物清除率。本文中，我们介绍了从完整的人类肾脏中分离和培养原代PTECs的实验方案，以及将其接种至模拟肾脏生理环境的3D MPS平台中的操作流程 体内 肾脏生理学。该方案支持在MPS装置中对近端肾小管上皮细胞的活力、生理形态以及关键转运蛋白的功能极化进行长达6个月的长期研究。

引言

肾脏在清除和排出体内多种外源性物质、毒素以及内源性化合物方面发挥着关键作用。这一过程通过滤过血液以清除代谢废物，同时调节电解质平衡、体液容量和酸碱度来实现。每个人类肾脏包含约一百万个肾单位，肾单位是肾脏的结构和功能基本单位1。在这些肾单位中，近端小管内的特化上皮细胞，即近端小管上皮细胞（PTECs），负责重吸收葡萄糖、氨基酸和离子等重要分子，同时也将药物底物和潜在有毒物质分泌至尿液中2,3,4。在某些情况下，PTECs还可将尿液中的化合物重新吸收回血液4。由于PTECs在药物与毒素相互作用中具有关键作用，因此从人肾脏分离获得的原代PTECs为研究肾脏药物-药物相互作用（DDIs）以及评估化合物的肾毒性提供了重要的研究工具。

药物诱导的肾毒性是一个重要的临床挑战，因其可导致急性肾损伤和慢性肾病5因此，深入了解肾近端小管的生理学特性对于准确预测和表征药物及毒素的肾毒性潜力至关重要。传统的 体外 模型，包括永生化肾细胞系（例如 RPTEC-TERT1、HK-2），在模拟人近端小管的复杂结构和功能方面存在局限性6，其运作方式 在动态层流（低雷诺数）和均匀的细胞外基质（ECM）条件下 体内7,8此外，传统的二维（2D）模型常因这些蛋白的快速降解和内化，无法有效表达主要的肾转运蛋白（如有机阴离子转运蛋白1和3（OAT1和OAT3）、有机阳离子转运蛋白2（OCT2））6,9,10,11动物模型虽然具有一定的参考价值，但可能无法完全模拟人类的肾脏生理，并且由于不同物种在转运蛋白表达和活性方面的差异，其研究结果往往缺乏可转化性。12例如，mOct1 在小鼠近端肾小管上皮细胞中呈基底外侧表达，而在人类中，肾脏内 OCT1 膜蛋白的表达则无法检测到13,14.

微生理系统（MPS）和器官芯片技术的进步使研究人员能够开发 体外 高度模拟人类器官三维（3D）结构和动态流体流动条件的模型15我们课题组先前已对两种带有近端肾小管上皮细胞（PTECs）的MPS模型进行了表征16,17，并利用这些模型开展毒性研究18,19,20 并准确预测药物的体内分布21使用原代PTEC在这些模型中具有显著优势，因其能够保留所观察到的功能特性 体内.

本文介绍了从经联合器官共享网络（UNOS）批准的器官获取组织获得的已故供体完整人肾中分离人肾近端小管上皮细胞（PTEC）的操作方案，并将培养的人PTEC应用于微生理系统（MPS）平台的方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有工作均遵循华盛顿大学的人体组织处理指南进行。合适的供体需满足以下要求：冷缺血时间（CIT）少于36小时，无已知的肾脏疾病、透析史或其他任何医学状况（例如1型或2型糖尿病、乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、病毒性/细菌性脑膜炎、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染、梅毒、败血症或新型冠状病毒肺炎（Covid-19））。本研究中使用的人全肾通过经联合国器官获取组织（UNOS）批准的器官获取组织（OPO）获得。

1. 生物安全柜准备

  1. 用70%乙醇喷洒超净台表面。对生物安全柜内的所有表面和物品进行去污，以创造无菌环境。
  2. 铺上蓝色吸水垫。所有组织操作均应在这些垫子上进行。
  3. 确保生物安全柜内已备齐所需设备并经过适当灭菌处理（剃刀刀片、刻度移液管吸头、刻度移液管枪、100 µm细胞筛、p1000吸头、1000 µL微量移液器、15 cm圆形培养皿和锥形管）。

2. 肾脏预处理准备

  1. 通过将 0.75 mg/mL 胶原酶 IV 和 0.75 mg/mL 分散酶 II 加入含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，制备肾脏消化液。使用 0.2 µm 无菌膜滤器过滤该溶液。
    注意：对于一个完整的人类成年肾脏，大约需要 14 个 50-mL 锥形管，每管含有约 35 mL 消化液（总计 500 mL）。
  2. 通过将 4.425 g 无葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）/F12 粉末、0.5 g D-葡萄糖粉末、0.6 g 碳酸氢钠粉末、5 mL 100 倍胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂（含 1000 mg/L 胰岛素、550 mg/L 转铁蛋白和 0.67 mg/L 亚硒酸钠）、0.5 mL 50 µM 氢化可的松以及 5 mL 100 倍抗生素-抗真菌素溶液（含 10000 单位/mL 青霉素 G 钠、10000 µg/mL 硫酸链霉素和 25 µg/mL 两性霉素 B 的 0.85% 生理盐水中）加入 500 mL 无菌高压灭菌的超纯水（I 型）中，制备 PTEC 培养基。使用 0.2 µm 无菌膜滤器过滤培养基。解冻胎牛血清（FBS），并在 14 个 50 mL 锥形管中每管分装 10 mL。
  3. 准备并标记另一组 50-mL 锥形管。在此步骤中，确保共有 3 组各 14 个 50 mL 管。
  4. 将轨道摇床预热至 37 °C。

3. 从整个肾脏中分离近端肾小管上皮细胞（PTECs）

  1. 采用无菌操作技术，将装有组织样本的运输容器放入生物安全柜中。从包装盒中取出袋子，并用70%乙醇喷洒外部，然后放入生物安全柜内。
  2. 将肾脏置于一个直径15 cm的圆形培养皿中。吸除或弃去残留的培养基。
  3. 使用无菌剃刀片去除周围脂肪和肾包膜。轻轻划开肾包膜，沿中心制造一条切口。
  4. 用镊子剥离肾包膜，并使用剃刀片切除附着在肾脏上的任何脂肪组织。将包膜和脂肪组织弃入另一个15 cm培养皿中。
  5. 分离皮质（约1 cm厚）与髓质。弃去髓质。
    注：与髓质相比，皮质呈较浅的棕黄色。
  6. 使用剃刀片将组织切成<1 cm3的小块，直至形成类似浆状的外观。
  7. 向培养皿中加入少量肾脏消化缓冲液，然后将浆状物转移至第一组含有35 mL肾脏消化液的50 mL离心管中。均匀分配，每管总体积不得超过45 mL。
  8. 将所有离心管转移至37 °C振荡摇床，以最高转速孵育30分钟（确保离心管不会脱落）。孵育后，用70%乙醇喷洒管体，再将其移回生物安全柜中。
  9. 倒置离心管以混匀内容物，并让较大的组织碎片沉降至管底。尽可能多地将上清液转移至含有10 mL胎牛血清（FBS）的50 mL尖底离心管中，避免转移完整组织。 均匀分配，每管总体积不得超过45 mL。
  10. 以200 g离心7分钟。离心后，用70%乙醇喷洒管体，再将离心管移回生物安全柜中。
  11. 小心吸除上清液。每管加入10 mL PTEC培养基，重悬沉淀。
  12. 将所得细胞悬液通过100 µm细胞滤网过滤至新的50 mL尖底离心管中。
  13. 将所得细胞滤液以400 g离心5分钟。离心后，用70%乙醇喷洒管体，再将离心管移回生物安全柜中。
  14. 用5 mL DPBS洗涤沉淀。使用P1000移液器枪头重悬沉淀。
  15. 以400 g离心5分钟。离心后，用70%乙醇喷洒管体，将离心管移回生物安全柜中，然后吸除上清液。
  16. 重复步骤3.15两次，共洗涤三次。随后，用15 mL PTEC培养基重悬细胞沉淀，并将细胞接种于无菌的T-75细胞培养瓶中。
  17. 正确标记培养瓶，并将细胞置于37 °C、5% CO2的无菌培养箱中培养。首次更换培养基前，让PTEC在培养箱中静置培养48小时。

4. 培养基更换

  1. 吸去培养瓶中的培养基。
  2. 用 5 mL 预热的 DPBS 洗涤细胞。
  3. 向 T-25 培养瓶中加入 5 mL 预热的 PTEC 培养基。
  4. 将培养瓶放回培养箱中。
  5. 每 48 小时更换一次培养基，直至培养瓶中的细胞融合度达到至少 70%，用于传代或实验使用。

5. 肾小管上皮细胞传代

  1. 从培养瓶中吸除培养基。向每个T-25培养瓶中加入5 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育1至2分钟，以进行胰蛋白酶消化。
  2. 待细胞脱落后，加入5 mL预热的特异性胰蛋白酶抑制剂溶液以中和胰蛋白酶活性。
  3. 轻轻吹打5次，使仍附着在培养瓶上的细胞完全脱落。随后将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在400 g 条件下离心5分钟。
  4. 吸除上清液。
    注意：如需冻存近端肾小管上皮细胞（PTECs），可在此处暂停，并转入相应的冻存操作流程。
  5. 每管中加入14 mL PTEC培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移至T-75培养瓶中（每瓶对应一管）。
  6. 进行T形摇动，使细胞在培养瓶内均匀分布。定期观察细胞状态，并每48小时更换一次培养基。

6. 肾小管上皮细胞的冷冻保存

  1. 步骤 5.6 之后，将每管 15 mL 圆底管中的细胞沉淀用 2 mL 含 10% DMSO 和 90% 低葡萄糖 PTEC 培养基重悬，并将 1 mL 转移至一个冻存管中。
  2. 将冻存管放入可实现温度控制冷冻的细胞冻存盒中，置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻 24 小时。在 -80 °C 冷冻 24 小时后，将冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。

7. 解冻PTEC

  1. 将冻存管从 -80 °C 转移至 37 °C 水浴中解冻。切勿在室温（RT）下解冻。当冻存管部分解冻后（应仍可见一小块冰晶），将 1 mL 细胞悬液加入含有 10 mL 预热 PTEC 培养基的 15 mL 锥形管中。
  2. 在 400 g 条件下离心细胞悬液 5 分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于 5 mL 预热的低糖 PTEC 培养基中。
  3. 将 5 mL 细胞悬液转移至 T-25 培养瓶中，进行 T 形振荡以使细胞均匀分布。此后，按照第 4 节进行培养基更换。

8. 使用 I 型胶原蛋白基质包被 MPS 装置

  1. 从MPS装置中吸除PBS，并将装置从包装中取出。使用医用擦拭巾将装置擦干，并根据需要进行标记。
  2. 将MPS装置放入一个15 cm的圆形培养皿中，并置于4 °C冰箱中备用。在培养皿底部放置医用擦拭巾，以防止MPS装置表面产生冷凝水。
  3. 将配有22 G鲁尔锁式钝头针的1 mL注射器置于-20 °C冰箱中保存，直至用于I型胶原蛋白注射。
  4. 每需填充四个MPS装置，准备一个15 mL锥形离心管并置于冰上。每个15 mL锥形离心管对应使用一支带钝头针的1 mL注射器。
  5. 在生物安全柜内采用无菌操作技术，打开MPS装置上的所有端口。确保每个螺钉阀顶部的狭缝与端口垂直对齐。
  6. 使用1 mL注射器/钝头针组件，分别向端口#1、#3和#6注入1 mL乙醇，冲洗ECM腔室。随后吸出乙醇，并使其完全挥发（至少30秒），以防止乙醇从端口#2、#4和#5渗入MPS装置内部。
  7. 将MPS装置重新放回4 °C冰箱中，并将PTEC培养基、M199培养基和1 N NaOH置于冰上保存。
  8. 根据表1计算约四个MPS装置所需的1 mL I型胶原混合液的基质组成（按需调整比例）。在生物安全柜内，按上述计算量依次加入PTEC培养基、M199培养基和1 N NaOH，混匀后将所有离心管置于冰上保存。
  9. 使用1 mL注射器小心地将I型胶原原液加入预混液中。通过反复吹打混匀胶原混合液，直至溶液呈现稳定的鲑鱼橙粉色。
  10. 短暂离心以使溶液完全沉降至管底。确保溶液中无气泡存在。
  11. 将预冷的配有22 G鲁尔锁式钝头针的1 mL注射器及MPS装置放入生物安全柜内的冰上。用预冷的1 mL注射器吸取胶原混合液，操作过程中务必完全避免产生气泡。
  12. 缓慢而轻柔地将胶原溶液注入已冷却装置的端口#1、#3和#6。将装置垂直放置，端口朝下，以便气泡从端口#2、#4和#5向上逸出。
    注意：当端口#2、#4和#5处出现胶原混合液小滴时，表明腔室已完全填充并被均匀包被。
  13. 移除注射器并将其放回置于冰上的15 mL离心管中。旋转端口#2、#4和#5的螺钉阀以密封已填充的芯片，并将芯片置于4 °C的培养皿中静置30分钟。
  14. 30分钟后，以无菌操作方式将芯片连同培养皿转移至生物安全柜中，并将芯片均匀、独立地铺开，使其温度均匀回升。
  15. 在每个培养皿中放入一张湿润的医用擦拭巾（防止I型胶原基质干燥并从MPS装置壁上剥离），并用半透明柔性密封膜封口。在室温下静置过夜，使胶原充分聚合。

9. 在MPS装置中以IV型胶原蛋白作为细胞外基质构建管状腔

  1. 通过用超纯水（一级水）和纯乙醇冲洗C-flex管路对管路进行灭菌，然后对整段管路进行高压灭菌。
  2. 在生物安全柜中，打开装有I型胶原的MPS装置的所有端口（旋塞阀应垂直于端口），并拔出从端口#1、#3和#6伸出的金属丝，以形成管状腔体。
  3. 将金属接头插入端口#1、#3和#6中。
  4. 在PTEC培养基中配制10 mL浓度为5 µg/mL的IV型胶原溶液。
  5. 将24英寸长的无菌C-flex管路分别套在从端口#1、#3和#6伸出的金属钝端上。
  6. 用22-G鲁尔锁式钝头针头装填1 mL注射器，并吸入0.5 mL的IV型胶原溶液。
  7. 将装有溶液的注射器安装到注射泵上，并将端口#1的管路连接至注射器。对端口#3和#6重复此步骤。
  8. 使用注射泵以10 µL/min的流速将IV型胶原溶液注入MPS端口，持续30分钟。灌注完成后，将装置置于37 °C培养箱中过夜，使胶原凝固，次日即可使用。
    注意：IV型胶原包被的MPS装置可在4 °C下保存最多1周。

10. 在 MPS 装置中接种原代 PTEC

  1. 在显微镜下检查MPS装置，确保管腔已正确形成。
  2. 将一支预先灭菌的5 mL注射器（带22 G针头）插入含有5 mL乙醇的15 mL离心管中。
  3. 按照步骤5.1至5.3，从T-25培养瓶中获取PTEC细胞沉淀，并转移至15 mL锥形管中。向细胞沉淀中加入80 µL PTEC培养基，轻轻重悬细胞。
  4. 将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
  5. 将装有MPS装置的培养皿从培养箱中取出，放入生物安全柜中。关闭第2、4、5号端口，并将螺杆阀水平旋紧至端口位置。
  6. 轻轻弹击含有PTEC细胞的离心管以重悬细胞。用细胞悬液充满注射器，将针头插入距离螺杆阀端口最远的进样口。
  7. 缓慢推动注射器活塞以注入细胞。注射后在显微镜下观察细胞流动情况。
    注意：细胞应通过管腔移动。若未在管腔中观察到细胞，请检查针头是否牢固插入进样口，必要时重新插入。一支满载细胞的注射器可填充装置上的全部三个管腔。
  8. 继续通过其余两个端口进行细胞注射。注射完成后，关闭第2、4、5号端口，并将MPS装置放回37 °C培养箱中。保持培养皿水平，防止细胞因重力作用移出管腔。
  9. 对于其他MPS装置，注射器排空后需用乙醇清洗，再用DPBS冲洗，然后吸取细胞悬液。
  10. 让MPS装置静置过夜，避免扰动。
  11. 次日，将MPS装置连接至注射泵系统。
  12. 在生物安全柜内，用PTEC培养基填充5 mL注射器，然后将带有24英寸C-flex管路的22 G鲁尔锁扣钝头针连接至注射器。
  13. 将装有PTEC培养基的注射器放入注射泵中，启动灌注以排除管路中的气泡。
  14. 将已排气的管路连接至第1、3、6号端口，并将螺杆阀转至垂直位置，以启动培养基流动。
  15. 将注射泵流速设定为0.5 µL/min。将装有MPS装置的培养皿放回37 °C培养箱中，在持续灌注培养基的条件下培养5至7天，使细胞形成管状结构，之后即可开始实验。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

原代近端肾小管上皮细胞在二维培养中随时间推移的形态学特征与汇合状态
从肾皮质分离后，PTECs需在首次换液前至少静置培养48小时。细胞接种培养约一周后，培养瓶中应出现多个具有均一上皮样、鹅卵石状形态的小细胞群（图1A、B）。根据来自不同供体的PTECs生长速度差异，通常在培养10天左右时，细胞汇合度应达到约50%–60%（平均情况）（图1C）。培养约14天后，细胞应达到完全汇合状态（图1D），此时可用于传代、冻存或接种至MPS装置中。平均而言，一个完整的人类肾脏可提供足量PTECs填满14个T-75培养瓶。为防止污染，在培养期间必须采用无菌操作技术，并在培养基中添加抗生素。

将PTEC注入MPS装置
在MPS装置包被I型和IV型胶原蛋白后，即可用于以三维形式培养PTEC。如...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

MPS 或器官芯片技术提供了一种高度相关的 体外 一种可重现人体生理关键特征的平台，从而减少药物开发和毒理学评估中对动物模型的依赖。近期，美国食品药品管理局现代化法案 2.0 版（2022 年）已允许在新药临床试验申请中纳入膜片钳系统（MPS）等替代方法29. 本方案详细描述了从人供体皮质组织中分离近端肾小管上皮细胞（PTECs）并将其用于微生理系统（MPS）平台的标准操作流程，旨在模拟人近端肾小管功能，并评估外源性物质引起的肾毒性反应图2).

维持高PTEC存活率的一个重要因素是尽量缩短热缺血时间（WIT）。我们建议使用WIT小于1小时的肾脏。虽然冷缺血时间（CIT）小于24小时最为理想，但在肾脏供体有限的情况下，CIT最长可耐受至36小时。另一个关键步骤是正确的组织处理，包括去除外层膜结构、内脏脂肪，并将皮质与髓质充分分离，以最大限度提高PTEC纯度。我们发现，使用胶原酶IV和分散酶联合消化，而非仅使用胶原酶I10

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明他们与本研究无任何利益冲突或相关财务披露。

致谢

本工作的部分研究得到了美国国家航空航天局（NASA）合同80ARC023CA001、国家转化科学促进中心（NCATS）（U2CTR004867、UH3TR000504、UG3TR002158）、NCATS与太空科学促进中心（CASIS）联合资助（UG3TR002178）、国家环境卫生科学研究所（NIEHS）（P30ES00703）、国家普通医学科学研究所（T32GM007750）、西北肾脏中心向肾脏研究所提供的无限制捐赠，以及华盛顿大学药学院（Ji-Ping Wang奖和Bradley奖学金）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 鲁尔锁接头尖端注射器贝克顿·迪金森309628
1.5 mL 微型离心管CELLTREAT 科学产品229442
15 mL 无菌圆锥形聚丙烯试管Fisher Scientific14-959-53A
3D微生理装置NortisTCC-001
5 mL鲁尔锁扣式针筒尖端贝克顿，迪金森309646
50 mL 无菌圆锥形聚丙烯管Fisher Scientific12-565-271
抗生素-抗真菌素（100x）ThermoFisher Scientific15240062
IV型胶原酶，粉末状ThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-葡萄糖MilliporeSigmaG8270
明确的胰蛋白酶抑制剂ThermoFisher ScientificR007100
二甲基亚砜，生物试剂，Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II，粉末赛默飞世尔科技17105041
杜尔贝科’DMEM/F-12（无葡萄糖）美国生物生命科学D9807-02
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），含钙、镁ThermoFisher Scientific14040117
胎牛血清（FBS），优级ThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 优良实验室操作（GLP）移液器套装ThermoFisher Scientific05-719-511移液管
Fisherbrand SureOne Micropoint 吸头，通用型，非滤芯式Fisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
新鲜完整的人体肾脏诺瓦比奥시스https://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/人类肾脏通过Novabiosis获取，这是一家经UNOS批准的器官获取组织（OPO）
加湿培养箱（37 °C 和 5% CO2)Fisher Scientific51033556
氢化可的松MilliporeSigmaH0888
旋转振荡培养箱Avantor12620-946
胰岛素-转铁蛋白-硒（100倍浓度）（ITS-G）ThermoFisher Scientific41400045
内螺纹低温冻存管康宁430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
鲁尔接头（钝头针），22 G × 0.5 英寸Instech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199，Earle's 盐溶液（10倍浓缩）ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 小型台式离心机ThermoFisher Scientific75007210
金属连接器（钝头）Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty 冷冻容器ThermoFisher Scientific5100-0036
尼康Eclipse Ti-S显微镜尼康仪器https://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/原始模型已停用 
Nunc 未处理培养瓶，T-25赛默飞世尔科技169900
Nunc 未处理培养瓶，T-75ThermoFisher Scientific156800
移液管，10 mL，刻度，0.1 mL，无菌Greiner Bio-One607180
硅胶管，C-flex 管（内径：0.020"，OD：0.083")Cole-Parmer06422-00
单刃剃须刀片（无菌）BiosealKI-205/50
碳酸氢钠默克生命科学S6297
氢氧化钠MilliporeSigmaS8045
带PES膜的无菌一次性滤器单元ThermoFisher Scientific567-0020
组织培养处理培养皿，150 mm  x 20 毫米 透气盖Genesee Scientific25-203
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红ThermoFisher Scientific25300054
I型胶原蛋白，大鼠尾部Corning354236
IV型胶原蛋白，小鼠Corning354233

参考文献

  1. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  2. Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational study. BMC Nephrol. 21, 108(2020).
  3. Wang, K., Kestenbaum, B. Proximal tubular secretory clearance. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (8), 1291-1296 (2018).
  4. Yin, J., Wang, J. Renal drug transporters and their significance in drug-drug interactions. Acta Pharm Sin B. 6 (5), 363-373 (2016).
  5. Connor, S., Roberts, R. A., Tong, W. Drug-induced kidney injury: challenges and opportunities. Toxicol Res (Camb). 13 (4), tfae119(2024).
  6. Meijer, T., et al. Characterization of organic anion and cation transport in three human renal proximal tubular epithelial models. Cells. 13 (12), 1008(2024).
  7. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 97, 4-27 (2016).
  8. Miceli, C., et al. Fluid flow-induced shear stress controls the metabolism of proximal tubule kidney epithelial cells through primary cilium-dependent lipophagy and mitochondria biogenesis. Autophagy. 16 (12), 2287-2288 (2020).
  9. Tsang, Y. P., Hao, T., Mao, Q., Kelly, E. J., Unadkat, J. D. Dysregulation of the mRNA expression of human renal drug transporters by proinflammatory cytokines in primary human proximal tubular epithelial cells. Pharmaceutics. 16 (2), 285(2024).
  10. Bajaj, P., et al. Freshly isolated primary human proximal tubule cells as an in vitro model for the detection of renal tubular toxicity. Toxicology. 442, 152535(2020).
  11. Brown, C. D. A., et al. Characterisation of human tubular cell monolayers as a model of proximal tubular xenobiotic handling. Toxicol Appl Pharmacol. 233 (3), 428-438 (2008).
  12. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28 (10), 2432-2438 (2013).
  13. Morse, B. L., et al. Pharmacokinetics of organic cation transporter 1 (OCT1) substrates in Oct1/2 knockout mice and species difference in hepatic OCT1-mediated uptake. Drug Metab Dispos. 48 (2), 93-105 (2020).
  14. Samodelov, S. L., Kullak-Ublick, G. A., Gai, Z., Visentin, M. Organic cation transporters in human physiology, pharmacology, and toxicology. Int J Mol Sci. 21 (21), 7890(2020).
  15. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  16. Weber, E. J., et al. Development of a microphysiological model of human kidney proximal tubule function. Kidney Int. 90 (3), 627-637 (2016).
  17. Chapron, A., et al. An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion. ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).
  18. Adler, M., et al. A quantitative approach to screen for nephrotoxic compounds in vitro. J Am Soc Nephrol. 27 (4), 1015-1028 (2016).
  19. Chang, S., et al. Human liver-kidney model elucidates the mechanisms of aristolochic acid nephrotoxicity. JCI Insight. 2 (22), e95978(2017).
  20. Weber, E. J., et al. Human kidney on a chip assessment of polymyxin antibiotic nephrotoxicity. JCI Insight. 3 (24), e123673(2018).
  21. Imaoka, T., et al. Bridging the gap between in silico and in vivo by modeling opioid disposition in a kidney proximal tubule microphysiological system. Sci Rep. 11 (1), 21356(2021).
  22. Van Ness, K. P., Chang, S., Weber, E. J., Zumpano, D., Eaton, D. L., Kelly, E. J. Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity. Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).
  23. Lidberg, K. A., et al. Serum protein exposure activates a core regulatory program driving human proximal tubule injury. J Am Soc Nephrol. 33 (5), 949-965 (2022).
  24. Sakolish, C., et al. Technology transfer of the microphysiological systems: a case study of the human proximal tubule tissue chip. Sci Rep. 8 (1), 14882(2018).
  25. Hart, A., et al. Identification of prognostic biomarkers for antibiotic associated nephrotoxicity in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 23 (2), 293-299 (2024).
  26. Lidberg, K. A., et al. Antisense oligonucleotide development for the selective modulation of CYP3A5 in renal disease. Sci Rep. 11 (1), 4722(2021).
  27. Imaoka, T., et al. Microphysiological system modeling of ochratoxin A-associated nephrotoxicity. Toxicology. 444, 152582(2020).
  28. Chapron, B. D., et al. Reevaluating the role of megalin in renal vitamin D homeostasis using a human cellderived microphysiological system. ALTEX. 35 (4), 504-515 (2018).
  29. Adashi, E. Y., O'Mahony, D. P., Cohen, I. G. The FDA modernization act 2.0: drug testing in animals is rendered optional. Am J Med. 136 (9), 853-854 (2023).
  30. Qi, W., Johnson, D. W., Vesey, D. A., Pollock, C. A., Chen, X. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (methods in renal research). Nephrology. 12 (2), 155-159 (2007).
  31. Mihevc, M., Petreski, T., Maver, U., Bevc, S. Renal proximal tubular epithelial cells: review of isolation, characterization, and culturing techniques. Mol Biol Rep. 47 (12), 9865-9882 (2020).
  32. Shaver, C. M., et al. Cellfree hemoglobin augments acute kidney injury during experimental sepsis. Am J Physiol Renal Physiol. 317 (4), F922-F929 (2019).
  33. Sbarbati, R. Separation of human endothelial cells from fibroblasts by centrifugation in Percoll gradients. Biosci Rep. 5 (6), 469-472 (1985).
  34. Horn, P., et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 10 (7), 676-685 (2008).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

近端小管细胞肾脏微生理模型肾细胞分离原代上皮细胞三维MPS平台肾毒性预测药物转运评估细胞培养技术胰蛋白酶消化细胞冻存
分离原代人近端小管上皮细胞及其在构建肾脏近端小管微生理模型中的应用
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。