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De Novo 和 In Silico 蛋白质设计中 I TASSER、trRosetta、UCSF Chimera、HADDOCK 服务器及 HEX loria 的应用

DOI：

10.3791/68003

⸱

2025年7月8日

 , 
1Facultad de Ciencias Naturales, Doctorado en Ciencias Biológicas, Campus Aeropuerto. Laboratorio de Biología Cuantitativa y Sistemas Complejos, Universidad Autónoma de Querétaro

本文内容

摘要

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蛋白质设计涉及氨基酸序列的构建以及特定基序的引入，以创造具有功能的变体。该方法对于开发抗菌肽（AMPs）以对抗抗生素耐药性病原体至关重要。本文介绍了一种利用多种生物信息学工具进行蛋白质构建的实验流程。

摘要

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蛋白质设计的前沿领域在于构建氨基酸序列，并将特定基序（如结合位点）整合到受体、离子通道或其他蛋白质中。该方法能够生产具有特定功能和用途的蛋白质变体。这些生物信息学资源的一个典型应用是改进抗菌肽（AMPs）或设计合成抗菌肽。这一发展具有重要意义，因为近年来新发疾病不断增加，这些疾病通常由难以根除且具有抗生素耐药性的病原体引起。这一趋势的后果包括全球动物物种的灭绝以及人类死亡。因此，快速合成新型且有效的抗菌肽至关重要。这些服务器和程序可促进针对这些病原体的疫苗、抗菌肽或有效治疗方法的快速开发。本研究的目的是介绍并提出一种从序列出发构建蛋白质的流程，并逐步阐明利用不同工具构建这些分子的过程。

引言

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动物疾病的发病率正在上升，这一现象受到气候变化的影响。全球气温升高导致微生物增殖以及机会性病原体出现，从而促使高致病性及耐药性疾病的发展1。气候变化影响土壤、水体、皮肤和肠道微生物组，导致动物生理机能和环境适应能力持续承受压力。研究表明，这种现象会削弱免疫反应，使动物更容易感染新出现的病原体，可能导致致命后果，甚至引发某些物种的灭绝2,3,4,5。一个典型的例子是白鼻综合征（WNS），该病由真菌Pseudogymnoascus destructans引起，影响冬眠中的蝙蝠。此类疾病及其他类似疾病直至2006年在美洲大陆发生大规模死亡事件后才被发现6。为减轻此类病原体造成的损害，研究人员已转向使用抗真菌药物（如伊曲康唑和酮康唑）以及益生菌，包括接种有益微生物Pseudomonas fluorescens7。另一种由真菌引起的疾病是Ophidiomyces ophiodiicola感染，该真菌可导致圈养和野生蛇类发生皮炎及多系统性疾病

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方案

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1. 在 Bd 中鉴定分子靶标序列

注意：序列中氨基酸的选择基于文献中的建议。关键氨基酸包括 K、W、G、A、V、I 和 L。有关应使用哪些程序的信息，请查阅材料表。

  1. 从 NCBI 数据库中获取目标序列。
    1. 访问美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
    2. 选择 所有数据库 并选择 核苷酸 作为搜索类别。
    3. 输入 Batrachochytrium dendrobatidis 在 搜索栏 按菌株和物种筛选结果。
    4. 下载 和 保存 在文本编辑器或FASTA格式中进行序列的进一步分析。

2. 使用 BLAST 或 SMART BLAST 分析序列

  1. 进行BLAST搜索。

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结果

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正在开发的序列采用以下公式：K(X)3KW(X)2K(X)2K，其中 (X) 可以是 G、A、V、I 或 L28。获得的搜索结果包含长度超过 300 个氨基酸的蛋白序列，这些序列因其为完整蛋白序列而非部分序列而被选中。需要注意的是，完整序列对于本研究至关重要。每种受体/膜通道的功能也通过序列信息或独立的数据库搜索进行了查询。获得的结果涵盖了多种类型的蛋白质；然而，并非所有这些蛋白质都适用于本实验方案。因此，选择集中于一种 Na/H 反向转运蛋白，因其在维持微生物细胞形态以及细胞处于环境变化（例如两栖动物从水生环境转移到陆生环境时皮肤所经历的变化）下的渗透调节中具有重要作用。

此类通道受到“攻击”或阻断后，会导致细胞内产生渗透压失衡，在高浓度情况下，真菌自身的内部机制无法修复这种失衡，从而导致细胞死亡（补充文件1：补充图S9、补充图S10 和 补充图S11）。此外，必须明确该特定蛋白质是否存在于其他微生物.......

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讨论

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用于蛋白质结构预测的生物信息学方法因其依赖于计算程序而存在固有局限性。这些程序试图逼近真实的蛋白质结构，但受限于温度、溶解度和溶剂存在等因素，可能无法完全模拟体内环境条件。此外，该方法依赖于通过多序列比对和 curated 数据库对关键保守蛋白质的准确识别，因此这些数据库的可靠性对于获得有意义的结果至关重要。

尽管存在局限性，但该方法在与病原体、受体或已结晶受体蛋白的现有序列数据结合使用时仍具有显著优势。引入天然或合成的抗菌物质，并可能对其进行修饰以增强其功效，从而提高了该方法的适用性。通过测序和实验验证可进一步增强结构模型的可靠性。为确保准确性，设计过程必须纳入经过验证的实验方案，合理选择氨基酸，并仔细考虑序列长度，因为过短或过长的序列均可能对可预测性和功能产生不利影响。

蛋白质序列的设计需要精确平衡净电荷、亲水性和疏水性，以实现稳定性和功能性。氨基酸的排列显著影响这些性质，进而影响溶解度、折叠过程以及与其他生物分子的相互作用。序列长度是另一个关键因素，过短的序列可能缺乏结构复杂性，而过长的序列则可能引入不必要的二级结构或折.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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Jimena R. Villarreal 是墨西哥克雷塔罗自治大学（UAQ）生物科学博士项目的一名博士生，并获得了墨西哥国家人文、科学和技术理事会（CONAHCyT）的奖学金资助（编号：1003112）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BLASTN/AN/A在线服务器
计算机AMDN/A操作系统：XP、W7、W8、W10、ubuntu、linux
HADDOCK 服务器BONVINLABN/A在线服务器
HEX 5.2BBSRC-INRIAN/A可下载-在线服务器
I-TASSERZHANG LABN/A可下载-在线服务器
MUSCLEN/AN/A在线服务器
NCBIN/AN/A在线服务器
PYMOLSCHRÖDINGERN/A可下载-XP、W7、W8、W10、W11、LINUX
SWISS-MODELBIOZENTRUMN/A在线服务器
trRosetta 服务器YANG LABN/A在线服务器
UCSF CHIMERARBVIN/A可下载-XP、W7、W8、W10、W11、LINUX

参考文献

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  1. McArthur, D. B. Emerging infectious diseases. Nurs Clin North Am. 54 (2), 297-311 (2019).
  2. Schilliger, L., Paillusseau, C., Francois, C., Bonwitt, J. Major emerging fungal diseases of reptiles and amphibians. Pathogens. 12 (3), 429(2023).
  3. Campbell, L. J., Garner, T. W. J., Hopkins, K., Grif....

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重印与许可

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标签

I TASSER trRosetta HADDOCK

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