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方法文章

De Novo 和 In Silico 蛋白质设计中 I TASSER、trRosetta、UCSF Chimera、HADDOCK 服务器及 HEX loria 的应用

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DOI：

10.3791/68003

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2025年7月8日

 , 
1Facultad de Ciencias Naturales, Doctorado en Ciencias Biológicas, Campus Aeropuerto. Laboratorio de Biología Cuantitativa y Sistemas Complejos, Universidad Autónoma de Querétaro

本文内容

摘要

蛋白质设计涉及氨基酸序列的构建以及特定基序的引入，以创造具有功能的变体。该方法对于开发抗菌肽（AMPs）以对抗抗生素耐药性病原体至关重要。本文介绍了一种利用多种生物信息学工具进行蛋白质构建的实验流程。

摘要

蛋白质设计的前沿领域在于构建氨基酸序列，并将特定基序（如结合位点）整合到受体、离子通道或其他蛋白质中。该方法能够生产具有特定功能和用途的蛋白质变体。这些生物信息学资源的一个典型应用是改进抗菌肽（AMPs）或设计合成抗菌肽。这一发展具有重要意义，因为近年来新发疾病不断增加，这些疾病通常由难以根除且具有抗生素耐药性的病原体引起。这一趋势的后果包括全球动物物种的灭绝以及人类死亡。因此，快速合成新型且有效的抗菌肽至关重要。这些服务器和程序可促进针对这些病原体的疫苗、抗菌肽或有效治疗方法的快速开发。本研究的目的是介绍并提出一种从序列出发构建蛋白质的流程，并逐步阐明利用不同工具构建这些分子的过程。

引言

动物疾病的发病率正在上升，这一现象受到气候变化的影响。全球气温升高导致微生物增殖以及机会性病原体出现，从而促使高致病性及耐药性疾病的发展1。气候变化影响土壤、水体、皮肤和肠道微生物组，导致动物生理机能和环境适应能力持续承受压力。研究表明，这种现象会削弱免疫反应，使动物更容易感染新出现的病原体，可能导致致命后果，甚至引发某些物种的灭绝2,3,4,5。一个典型的例子是白鼻综合征（WNS），该病由真菌Pseudogymnoascus destructans引起，影响冬眠中的蝙蝠。此类疾病及其他类似疾病直至2006年在美洲大陆发生大规模死亡事件后才被发现6。为减轻此类病原体造成的损害，研究人员已转向使用抗真菌药物（如伊曲康唑和酮康唑）以及益生菌，包括接种有益微生物Pseudomonas fluorescens7。另一种由真菌引起的疾病是Ophidiomyces ophiodiicola感染，该真菌可导致圈养和野生蛇类发生皮炎及多系统性疾病4,8。

这些研究强调了提高对野生动物真菌病认知与理解的必要性，以便迅速实施切实可行的解决方案。已有报道显示两栖动物中存在真菌感染，其中一种广泛存在的病原体是水生真菌Batrachochytrium dendrobatidis（Bd），该病原体可引发壶菌病。该疾病可在易感动物中引起严重的皮肤病变，并破坏皮肤的正常功能，可能导致死亡9。自20世纪以来，该病原体已广泛传播，导致90种两栖动物灭绝。由于防控此类感染并寻找有效治疗方法需综合考虑多种生态、生理、微生物组及其他因素，因此其高发态势构成了重大挑战10。

已有充分文献记载，病原微生物能够通过基因编码迅速进化出耐药机制，例如产生用于排出药物和抗生素的外排泵11。此外，这些微生物还被发现会改变膜脂质组成，以对抗特定分子的作用12。蛋白质序列研究领域已引起广泛关注，尤其是在其整合至治疗策略以及蛋白质结构模型构建方面的应用。这些模型旨在蛋白质合成开始之前优化实验室的时间与资源利用13。在此类情况下，预防感染是一项复杂的任务，涉及多种生态、生理及微生物组因素14。该方法有助于更有效地管理实验室的时间与资源，同时凸显了该任务的复杂性。

为了提高现有化合物的实际应用潜力，并创造具有更大应用前景的新化合物，必须整合化学、分子生物学、物理学和编程等多个学科的专业知识。为此，目前已有一些可用的工具，包括用于蛋白质结构预测的 I-TASSER（迭代 threading 组装优化）15,16 和 trRosetta17,18（基于变换约束 Rosetta 的蛋白质结构预测），以及用于分子对接和 PDB 文件编辑的 UCSF Chimera（加州大学旧金山分校开发的用于探索性研究与分析的可视化系统）19 和 HEX loria（一种交互式蛋白质对接与分子叠加程序）20。

I-TASSER 是一个可自动预测蛋白质结构与功能的在线服务器。该程序可通过网页浏览器访问，也可下载使用。在提交页面，用户可以输入 FASTA 格式的序列，或下载 .txt 格式的存档文件。服务器的处理过程包括识别具有一定同源性的结构模板，该过程如 Local Meta-Threading Server LOMETS20,21,22,23,24,25 所述。服务器在处理百万级潜在结果后，将启动过滤流程，并根据均方根偏差（RMSD）、TM 值（用于评估两个模型之间结构相似性的指标）以及 C-score（用于评估蛋白质结构模型置信度的指标）来选择片段。用户可根据程序提供的预设参数自定义结果，或根据其特定的序列或结构预期输入自定义数值20,21,22,23,24,25。

trRosetta 是一种高效的蛋白质结构预测程序。在该服务器上，用户可以以压缩文件、TXT、FASTA、序列输入或多重序列比对（MSA）格式提交序列。该程序允许用户选择使用模板，或执行 trRosetta-single 进行序列折叠。这些服务器利用深度学习网络生成结构预测。序列预测过程首先进行接触图和距离图的预测，随后为最终模型筛选出前五个最佳模板，并通过能量最小化步骤实现折叠与结构优化17。

高模糊性蛋白质-蛋白质对接（HADDOCK） 服务器是一种计算工具，可实现两个或多个PDB文件的柔性对接，适用于蛋白质、多肽、配体和受体结构。该服务器采用一种整合了AIRs（模糊相互作用限制）的方法，在对接过程中编码来自预测或已知蛋白质的信息。AIRs包含氨基酸限制，将其分类为被动或主动氨基酸。其中，主动氨基酸的引入尤为重要，因为它们提示了蛋白质受体之间可能的结合或相互作用位点。该程序的设计将溶剂可及性纳入模型中26。

HEX Loria 是一个在线交互式服务器，可促进蛋白质复合物和分子对接的分析。该服务器能够读取以蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）格式存储的坐标文件，并利用 NVIDIA 或 CUDA 图形处理器快速执行对接计算。该程序最多可生成 1,000 次对接预测，并采用相关傅里叶变换法确定两个分子的整体取向27。HEX Loria 的界面设计友好，研究人员可轻松上传其蛋白质结构并配置对接模拟参数。该服务器利用 NVIDIA 或 CUDA 图形处理单元的能力，显著缩短了计算时间，使研究人员能够更高效地获得结果。此外，HEX Loria 提供多种对接结果可视化选项，使用户能够深入分析预测的蛋白质-蛋白质相互作用。

使用UCSF Chimera对于确保研究结果的准确性至关重要。本实验方案的执行需预先安装该软件，并将使用以下功能：原子间距离测量及其他多种分析任务。该软件具备标注、着色、表面渲染以及以JPG或PNG格式导出图像等功能。通过添加标签和颜色，有助于识别受体与设计的抗菌蛋白之间具有高接触概率的氨基酸残基，同时还能精确测量这些氨基酸之间的距离。

本方案旨在为日益严重的两栖动物健康问题寻找替代治疗方案。壶菌病是一种皮肤真菌感染，在两栖动物发育的各个阶段均有发现。这些动物的主要感染源是其通常栖息并进行多种活动的水体。开发有效的抗真菌剂需要确定至少三个分子靶点：通过电荷与细胞壁相互作用、与质膜结合，最后在膜水平上与壶菌（Bd）中起关键作用的受体蛋白结合并发生相互作用。

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方案

1. 在 Bd 中鉴定分子靶标序列

注意：序列中氨基酸的选择基于文献中的建议。关键氨基酸包括 K、W、G、A、V、I 和 L。有关应使用哪些程序的信息，请查阅材料表。

  1. 从 NCBI 数据库中获取目标序列。
    1. 访问美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
    2. 选择 所有数据库 并选择 核苷酸 作为搜索类别。
    3. 输入 Batrachochytrium dendrobatidis 在 搜索栏 按菌株和物种筛选结果。
    4. 下载 和 保存 在文本编辑器或FASTA格式中进行序列的进一步分析。

2. 使用 BLAST 或 SMART BLAST 分析序列

  1. 进行BLAST搜索。
    1. 打开网页浏览器，访问BLAST（基本局部比对搜索工具）。
    2. 选择 Protein BLAST，以将查询序列与蛋白质数据库进行比对 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。  
  2. 验证靶标特异性。
    1. 确保所选的分子靶标在其他物种中不存在。如果该靶标出现在多个物种中，请重复序列筛选，直至确认其特异性（见 图1）。
      注意：此步骤可确保无非预期的次要分子靶标干扰 AMP 或抗真菌蛋白的功能
  3. 检查蛋白质序列中的同源性。
    1. 验证设计的氨基酸序列在其他物种中不与同源蛋白相匹配。
      注意：此步骤可确认抗真菌功能仅针对预期靶标

3. 设计抗菌蛋白序列

注意：氨基酸组成和序列应根据目标蛋白功能（特别是抗真菌活性）进行定制。所设计的序列应编码对Bd具有抗真菌作用的蛋白质。可通过Antifp预测服务器验证此设计28。

  1. 文献综述与序列设计
    1. 全面查阅近期文献，以确定壶菌（Bd）的关键特征及潜在的抗菌机制。
      注：既往研究报道了多种动物和微生物合成的抗Bd抗菌肽（AMPs）。Shai公式29为设计合成抗真菌肽提供了框架。应采用该方法优化蛋白序列，以实现最强的抗真菌活性。

4. 使用 I-TASSER 预测三维结构

注意：本方案适用于分子靶标和设计的抗菌序列。

  1. 如需访问和提交序列，请访问用于蛋白质结构与功能预测的 I-TASSER 服务器 https://zhanggroup.org/I-TASSER/ 。
  2. 注册时使用机构邮箱，以获取工具访问所需的用户名和密码。
  3. 提交分子靶标或设计的序列，支持 FASTA 格式、.txt 文件，或直接复制粘贴至输入框中。
  4. 为该序列指定一个唯一名称。
  5. 点击 提交，程序将开始分析序列，并显示预计处理时间。
    注意：请暂停本实验方案，直至收到结果。对于小分子蛋白质（≤50 个氨基酸），处理时间通常为 24 至 72 小时；对于大分子蛋白质（最多可达 3,000 个氨基酸），所需时间可能更长。
    工具选择建议：对于小分子蛋白质（如设计的抗菌肽），建议使用 I-TASSER；对于大分子蛋白质，建议使用 trRosetta，该工具针对复杂结构建模进行了优化。

使用 trRosetta 预测 3D 结构

  1. 访问 trRosetta 网络服务器： https://yanglab.qd.sdu.edu.cn/trRosetta/。
  2. 输入 目标受体序列，格式为 FASTA、.txt 或 MSA，或直接将序列粘贴至服务器中。
  3. 为 结构预测的蛋白质指定一个名称。
  4. 点击 提交，并确保已选择排除模板的选项。选择 trRosettaX-single homologs 以启动预测过程。
    注意：在收到结果前暂停本实验方案。
  5. 等待 提交成功后收到的确认邮件。
  6. 分析 预测结果。
    1. 确认 TM-score 是衡量模型质量的指标。
    2. 检查每个氨基酸的接触图、距离图，以及 α 和 β 碳原子在 ω（omega）、θ（theta）和 φ（phi）角度的旋转图。
  7. 下载 ZIP 格式的结果文件用于进一步分析。

6. 分子对接与相互作用分析（使用 HADDOCK）

  1. 访问 HADDOCK 分子对接服务器： https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/。
  2. 注册 一个使用机构邮箱的账户，确认账户并登录。
  3. 返回首页，选择 新建任务，并 开始 提交。
  4. 在 HADDOCK 提交页面上，填写 所需信息：任务名称、分子数量 （本例中为 2）。选择 全部。
  5. 上传 用于对接的分子。上传受体和配体的 PDB 结构。两者均选择 蛋白-配体对接。
  6. 重复 配体提交的步骤，选择 所有链，其余设置保持默认。
  7. 点击 下一步 进入后续提交步骤。
    注：在第 1 和第 2 部分中，添加参与受体-配体相互作用的氨基酸列表，并将其标记为活性残基。被动残基保持预定义状态。活性位点即为相互作用位点，必须根据设计蛋白的特性及受体蛋白暴露的氨基酸来选择。
  8. 完成设置并运行对接流程。
    1. 点击 下一步 以保持默认对接参数不变。
    2. 点击 提交 以开始处理。
      注：预计处理时间为 24 至 72 小时。
  9. 查看 对接结果。
    1. 服务器会自动筛选并排序最佳对接结果。使用结构可视化软件（例如 PyMOL 或 UCSF Chimera）分析氨基酸相互作用。
  10. 下载 最终对接结构的 PDB 格式文件以供进一步研究。
    注：请参见 补充文件 1：补充图 S1、补充图 S2、补充图 S3、补充图 S4 和 补充图 S5。

7. 测量距离（可选）[参见补充文件1：补充图S6、补充图S7和补充图S8。]

  1. 分析使用结构可视化程序（PDB）进行分子对接的结果。在UCSF Chimera中打开分子对接PDB文件，评估结构接近性及潜在结合位点（测量距离）。
  2. 双击Chimera图标以打开PDB文件。选择文件，打开，然后在文档目录窗口中选择一个文件。
  3. 识别原子。进入操作，原子/键，并选择显示。
  4. 选择最靠近配体和受体的原子。使用Ctrl+单击选择原子1，使用Ctrl+Shift+单击选择原子2。
  5. 进入工具，结构分析，然后选择距离。
  6. 点击创建（确认原子选择）。窗口将显示原子1和原子2对应的氨基酸及其位置。
    注意：距离列显示的是原子之间的角度。
  7. 下载该表格并保存至本地计算机。
    注意：更多信息请参见补充文件1。

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结果

正在开发的序列采用以下公式：K(X)3KW(X)2K(X)2K，其中(X)可以是G、A、V、I或L28。获得的搜索结果包含长度超过300个氨基酸的蛋白序列，这些序列因其为完整蛋白序列（而非部分序列）而被选中。需要注意的是，完整序列对于本研究至关重要。每种受体/膜通道的功能也通过序列信息或独立的数据库搜索进行了查询。获得的结果涵盖了多种类型的蛋白质；然而，并非所有这些蛋白质都适用于本实验方案。因此，最终选择聚焦于Na/H逆向转运蛋白，因其在维持微生物细胞形态以及细胞处于环境变化（例如两栖动物从水生环境转移到陆生环境时皮肤所经历的变化）下的渗透调节中具有重要作用。

此类通道受到“攻击”或阻断后，会导致细胞内产生渗透压失衡，在高浓度条件下，真菌自身的内部机制无法修复这种失衡，从而导致细胞死亡（补充文件1：补充图S9、补充图S10 和 补充图S11）。此外，必须明确该特定蛋白质是否存在于其他微生物中。为此，应进...

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讨论

用于蛋白质结构预测的生物信息学方法因其依赖于计算程序而存在固有局限性。这些程序试图逼近真实的蛋白质结构，但受限于温度、溶解度和溶剂存在等因素，可能无法完全模拟体内环境条件。此外，该方法依赖于通过多序列比对和 curated 数据库对关键保守蛋白质的准确识别，因此这些数据库的可靠性对于获得有意义的结果至关重要。

尽管存在局限性，但该方法在与病原体、受体或已结晶受体蛋白的现有序列数据结合使用时仍具有显著优势。引入天然或合成的抗菌物质，并可能对其进行修饰以增强其功效，从而提高了该方法的适用性。通过测序和实验验证可进一步增强结构模型的可靠性。为确保准确性，设计过程必须纳入经过验证的实验方案，合理选择氨基酸，并仔细考虑序列长度，因为过短或过长的序列均可能对可预测性和功能产生不利影响。

蛋白质序列的设计需要精确平衡净电荷、亲水性和疏水性，以实现稳定性和功能性。氨基酸的排列显著影响这些性质，进而影响溶解度、折叠过程以及与其他生物分子的相互作用。序列长度是另一个关键因素，过短的序列可能缺乏结构复杂性，而过长的序列则可能引入不必要的二级结构或折...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

Jimena R. Villarreal 是墨西哥克雷塔罗自治大学（UAQ）生物科学博士项目的一名博士生，并获得了墨西哥国家人文、科学和技术理事会（CONAHCyT）的奖学金资助（编号：1003112）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BLASTN/AN/A在线服务器
计算机AMDN/A操作系统：XP、W7、W8、W10、ubuntu、linux
HADDOCK 服务器BONVINLABN/A在线服务器
HEX 5.2BBSRC-INRIAN/A可下载-在线服务器
I-TASSERZHANG LABN/A可下载-在线服务器
MUSCLEN/AN/A在线服务器
NCBIN/AN/A在线服务器
PYMOLSCHRÖDINGERN/A可下载-XP、W7、W8、W10、W11、LINUX
SWISS-MODELBIOZENTRUMN/A在线服务器
trRosetta 服务器YANG LABN/A在线服务器
UCSF CHIMERARBVIN/A可下载-XP、W7、W8、W10、W11、LINUX

参考文献

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