使用 U2 OS 细胞培养物进行活细胞荧光显微镜检查的电穿孔流式细胞术方案

摘要

电穿孔是指使用脉冲电场 （PEF） 在细胞培养物中产生瞬时孔，以引入分子货物。该技术最近已广泛用于研究和临床环境。在这里，我们描述了使用最近开发的“电穿孔流式细胞术系统”进行活细胞荧光显微镜检查的电穿孔技术。

摘要

脉冲电场 （PEF） 在医学研究和临床应用中具有广泛的应用。一个关键的研究领域集中在电穿孔（可逆或不可逆）上。几十年来，可逆电穿孔一直用于通过细胞膜（如质粒 DNA）转移分子，通常称为基因电转移 （GET）。相反，不可逆电穿孔已成为癌症治疗中的一种流行技术，通过使用 PEF 永久破裂细胞来提供无毒替代方案。这可以与各种类型的药物或试剂结合使用，以增强被称为电化学疗法 （ECT） 的效果。然而，尽管在实际应用中取得了广泛的成功，但仍需要进一步的支持技术和研究来改进当前的技术。为了解决这个问题，开发了一种电穿孔流式细胞术系统来支持活细胞 PEF 实验，并能够进行长期荧光显微镜检查。这与稳定表达的 FUCCI （CA） 5 U2-OS 细胞系相结合，用于评估响应 PEF 暴露的细胞周期变化。在此过程中，实现了长达 30 小时的延时显微镜检查，提供了基于 FUCCI（CA）5 报告基因的细胞活性的实时变化。因此，相特异性变化可定量用于下游分析。

引言

脉冲电场 （PEF） 已发展成为生物学和临床应用中各种应用的常用工具¹。这些可以大致按电穿孔 （EP） 和电刺激 （ES） 分类。电穿孔有两个子场，称为可逆电穿孔和不可逆电穿孔。几十年来，可逆电穿孔 （RE） 一直被用作将分子货物（如质粒 DNA）转移到各种类型细胞（如哺乳动物、细菌和酵母细胞）中的有效工具²。最近，不可逆电穿孔 （IRE） 作为当前癌症治疗的无毒替代品越来越受到重视³。一个新兴的子领域被称为脉冲场消融术 （PFA），它侧重于非热组织去除，特别是用于治疗某些心功能障碍⁴。与药物和其他试剂联合使用，这导致了电化学疗法 （ECT） 的发展。然而，目前对 PEF 治疗的理解被临床应用所超越⁵。在这里，我们介绍了一种用于研究电化学疗法的电穿孔细胞术系统。细胞周期是细胞活力的关键指标，变化可以识别相位特异性效应。通过开发这些工具，可以更快地调整方案，为更广泛的癌症提供更有效的治疗方法。

我们的定制电细胞仪系统（图 1）包括一个带有铝制平行板电极和盖玻片底部的腔室，以及一个简单的指数衰减脉冲发生器。该腔室由 3D 打印腔室构成，#1.5 盖玻片底部由医用级压敏胶固定。电极由粘性铝膜形成，该铝膜放置在腔室内置的支架上，提供两个相距 0.4 cm 的平行电极。这是商用电极的常见配置，并提供了可以快速适应当前协议的稳健设计。该腔室可以安装在专为 25 mm x 55 mm 载玻片设计的环境外壳内，这也是商业显微镜供应商支持的常见载玻片格式。脉冲发生器提供高达 330 V 的指数衰减脉冲，可实现广泛的实验，包括可逆和不可逆的电穿孔。

为了研究 PEF 对细胞周期的影响，我们使用了表达荧光泛素化细胞周期指示剂 （CA）5 （FUCCI（CA）5） 的转基因人骨肉瘤细胞系 （U2 OS），一种荧光活细胞周期报告基因构建体。该系统引入了 Geminin 和 Cdt1 的两种荧光截短形式，它们在细胞周期中以特定速率产生和回收。此外，在实验过程中，可以使用稳定表达的 FUCCI（CA）5 系 U2-OS 细胞直接监测细胞凋亡。在细胞周期中，报告基因在每个阶段都可预测地运作，因为这些阶段的产生和降解速率与细胞中自然表达的功能版本相同。当细胞凋亡发生时，这个周期被打乱，细胞周期迅速关闭。通常，这将在视觉上表现为细胞周期内的荧光老化，然后是细胞核的显著形态变化，由于报告基因定位于细胞核⁶，这一点清晰可见。这允许随着时间的推移目视识别单个细胞中的每个阶段（图 2）。可逆电穿孔导致细胞内条件发生变化，并选择 180 V 指数衰减脉冲进行研究。选择该脉冲是为了尽可能限制细胞死亡，同时确保大多数人群的电穿孔。这是根据先前对 6 种哺乳动物细胞系的最佳电穿孔脉冲参数的研究确定的。180 V 脉冲的能量密度略低于最佳转染参数，在高孔隙率下提供更好的细胞活力⁷。使用胸苷双阻滞在有和没有 PEF 应用的胸苷双阻滞中研究脉冲的影响（图 3）。结果表明，与对照组相比，S 和 G2 的平均长度减少。这表明 S 期对 PEF 暴露敏感，导致细胞周期更快。这表明电穿孔细胞术系统能够将 PEF 的递送与长期活细胞成像相结合，以研究细胞周期。虽然我们使用该平台来观察细胞在细胞周期中响应 PEF 的进程，但这是研究 PEF 和细胞培养的各种应用和条件的有用工具。

方案

1. 细胞培养制备

1. 使用以下参数使用可逆电穿孔制备稳定线：100 μL 重悬的 U2 OS 细胞（6 ×^{10 6} 个细胞/mL），在 0.4 cm 比色皿中加入 5 μg 质粒 DNA，并使用 180 V 方波脉冲 10 ms。
2. 使用任何合适的 3D 打印机和生物相容性塑料（如聚乳酸 （PLA））对定制腔室设计进行 D 打印（参见 补充文件 1）。使用乙醇 （70%） 对完成的腔室进行消毒，并在使用前储存在无菌容器中。
3. 在 10 cm 板中培养 U2-OS FUCCI（CA）5 细胞，其中含有 10% 胎牛血清和 1% PenStrep 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）-高葡萄糖，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
4. 当培养物达到 80% 汇合时，吸出培养基，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞培养物，并使用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶解离细胞 1.5 分钟。
5. 通过将细胞培养物重悬于 5 mL DMEM-High Glucose（含有 10% FBS 和 1% PenStrep）中来中和胰蛋白酶。
6. 从重悬的细胞培养物中，获得 100 μL 样品，并将其置于底部玻璃盖玻片上的电穿孔细胞术系统腔室中。引入样品后，确保腔室达到 30% 汇合度。如果样品在孵育前似乎过度汇合，请吸出样品并降低样品体积。
7. 缓慢地将 4 mL DMEM-High Glucose（含有 10% FBS 和 1% PenStrep）添加到腔室的远端，防止液体冲出样品。
8. 将标准显微镜载玻片放在腔室顶部，并将腔室在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 24 小时，确保培养物完全粘附在腔室底部。或者，使用 Hoechst 33342 （1 μg/mL） 对细胞核进行染色，以便于下游细胞定量和细胞凋亡。在延时显微镜检查前 30 分钟进行染色。

2. 显微镜准备

1. 首先，打开具有环境控制和腔室的倒置荧光显微镜，在进行电穿孔之前使条件稳定下来。
   注：任何具有可接受 25 mm x 55 mm x 16 mm 腔室载玻片的环境系统的倒置荧光显微镜。该设计最初设计用于参考的倒置显微镜（参见 材料表）和相应的环境系统。
   由于金属膨胀，载物台的加热会导致图像漂移。
2. 当环境系统达到最佳温度时，使用合适的电缆将数字万用表连接到脉冲发生器电容器和高压开关。要遵循此协议，请使用“鳄鱼”夹电缆，以便与电穿孔室一起快速组装和拆卸。
3. 接下来，选择 20 倍放大倍率 并使用显微镜的软件，确保选择 FITC （GFP） 和 A594 （TexRed/mCherry） 通道（可选，Hoechst 33342 的 DAPI 通道） 对应于 FUCCI（CA）5 系统中的两种荧光蛋白。使用 低曝光设置 （通常为 <0.05 秒）以避免长时间延时损坏照片。
4. 通过在开始延时拍摄之前拍摄测试图像来优化图像焦点和质量。
   注意：荧光的亮度应仅与颜色可视化所需的亮度相同。
5. 对延时进行编程，每 10 分钟捕获 3 - 6 个视点，持续 24 小时 ，以在每次延时摄影中获得大量细胞周期数据，同时减轻光损伤。
   注意：时间长短可能因细胞活动的时间尺度而异。
6. 确保为 A594 通道启用自动对焦，以便在延时摄影期间跟踪细胞培养物获得最佳结果。
7. 将软件保持待机模式，直到执行电穿孔。脉冲传输后，立即激活延时摄影，以确保尽可能高的数据准确性。

3. 电穿孔

1. 将电穿孔细胞术室放入具有适当环境室的显微镜中。在电穿孔之前，保持腔室关闭，让环境系统运行，以确保细胞周期不受影响。
2. 将数字万用表连接到脉冲发生器，并通过打开环境室，使用鳄鱼夹电缆将脉冲发生器连接到腔室电极。
3. 将脉冲发生器中的电容器充电至 180 V，然后快速将脉冲放电到腔室中，直到数字万用表读数为 0 V。
4. 尽快拆下腔室的电气连接并盖上盖子，以确保适当的培养条件。
5. 显微镜环境系统就位后立即激活延时摄影。

4. 延时数据采集

1. 延时摄影完成后，使用显微镜软件根据在延时摄影长度内捕获的图像将延时摄影保存为单个视频。在此阶段提高视觉质量以协助手动量化。
   注意：可以选择任何帧速率;但是，6 帧/秒可提供中等重播速度，视频时间为 1 秒，实时时间为 1 小时。
2. 准备好延时视频后，通过观察 FITC 和 A594 信号的变化来跟踪细胞阶段随时间的变化

结果

使用 FUCCI 系统（图 2），通过测量细胞由于蛋白质表达和未二岵素化而表达每种颜色的时间长度来获得视觉细胞周期数据。根据非同步和同步实验的结果（图 3），很明显 S 期 PEF 暴露上调了细胞周期。平均相长的减少证明了这一点，表明细胞周期更快。此外，它还证明了胸苷对细胞周期的长期影响。与非同步种群相比，同步种群的对照数据显示更长的平均细胞周期。相反，在 S 期同步群体脉冲后，平均细胞周期长度与未同步对照相当。

图 1：电穿孔流式细胞术系统概述和显微镜设置。 该图概述了电穿孔细胞术系统的组件，包括在带有环境室的倒置荧...

讨论

如果作正确，可以在长达 24 小时的时间内量化大量单细胞的细胞周期期数据。该方案产生的细胞周期数据与 FAC 等替代方法相当。这是一种常用的方法，细胞在细胞周期中会变得荧光标记。孵育至少 24 小时后，它们按荧光强度排序，与特定阶段⁸ 中的种群数量相关。使用这种方法的先前研究表明，U2 OS 细胞在大约 23-24 小时内完成其细胞周期⁹。这与使用 FUCCI（CA）5 系统的结果一致，并表明当前方案能够复制与传统细胞周期报告技术相似的准确性。

尽管该协议概述了 U 2 OS 细胞的使用，但 FUCCI（CA）5 构建体代表了用于许多其他细胞系的强大工具。根据各种可用数据，PEF 实验代表了该工具的一个有前途的应用。首先，该协议允许研究大群体动力学和细胞周期活性的变化。因此，还可以根据正常增殖细胞培养物中细胞周期是否进展来间接监测代谢活性¹⁰。这些数据可以通过允许活细胞显...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腔室载玻片（3D 打印/组装）	N/A	N/A
培养板 （10 cm）	Sarstedt	83.3902
Delta Vision	Olympus	N/A	也可以使用其他型号的显微镜。确保载物台和环境系统能够容纳电穿孔室载玻片（55 mm x
DMEM –高葡萄糖	Gibco	11965092
胎牛血清	赛默飞世尔	A5256701
i3 MK3S 3D 打印机	Prusa	N/A	可以使用可以使用 STL 文件的替代打印机型号。
笔链球菌	ThermoFisher	15070063
磷酸盐缓冲盐水	Gibco	10010031
tFUCCI（CA）5	Addgene	153521
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	9002-07-07
U2-OS 细胞系	ATCC	HTB-96