电穿孔是利用脉冲电场（PEFs）在细胞培养物中形成瞬时孔隙，以导入分子货物的技术。该技术近年来已在研究和临床领域得到广泛应用。本文中，我们描述了使用近期开发的“电穿孔细胞分析系统”进行活细胞荧光显微镜观察的电穿孔技术。
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摘要
摘要
脉冲电场（PEFs）在医学研究和临床应用中具有广泛的应用。一个关键的研究领域集中在电穿孔（可逆或不可逆）上。可逆电穿孔已被用于通过细胞膜转运分子数十年，例如质粒DNA的导入，通常称为基因电转移（GET）。相反，不可逆电穿孔已成为癌症治疗中的一种流行技术，通过使用PEFs永久性地破坏细胞，提供了一种无毒的替代方法。该技术可与多种药物或试剂联合使用以增强效果，这种联合方法被称为电化学治疗（ECT）。然而，尽管在实际应用中取得了广泛成功，仍需要进一步的技术支持和研究来改进现有技术。为解决这一问题，开发了一种电穿孔流式细胞分析系统，以支持活细胞PEF实验，并能够进行长期荧光显微镜观察。该系统结合稳定表达FUCCI(CA)5的U2-OS细胞系，用于评估细胞周期在PEF暴露后的变化。通过该方法，实现了长达30小时的时间序列显微成像，基于FUCCI(CA)5报告系统提供了细胞活动的实时变化。因此，可对特定细胞周期阶段的变化进行量化，用于后续分析。
引言
脉冲电场（PEFs）已逐渐成为生物学和临床应用中多种用途的常用工具1。这些应用大致可分为电穿孔（EP）和电刺激（ES）两类。电穿孔包含两个子领域，即可逆电穿孔和不可逆电穿孔。可逆电穿孔（RE）数十年来一直被用作将分子物质（如质粒DNA）有效导入多种类型细胞（包括哺乳动物细胞、细菌和酵母细胞）的工具2。近年来，不可逆电穿孔（IRE）作为一种无毒的替代方案，在癌症治疗中的重要性日益凸显3。一个新兴的子领域被称为脉冲电场消融（PFA），其重点在于非热性组织去除，尤其用于治疗某些心脏功能障碍4。 与药物及其他试剂联合使用，这推动了电化学治疗（ECT）的发展。然而，当前对PEF治疗机制的理解已落后于其临床应用的发展5。本文介绍了一种用于研究电化学治疗的电穿孔流式分析系统。细胞周期是细胞活力的关键指标，其变化可识别特定阶段的影响效应。通过开发此类工具，可加快实验方案的优化，从而为更广泛的癌症类型提供更有效的治疗策略。
我们定制的电细胞分析系统（图1）包括一个带有铝制平行板电极和盖玻片底部的腔室，以及一个简单的指数衰减脉冲发生器。该腔室由3D打印部件构成，并使用医用级压敏胶将#1.5盖玻片底部固定。电极由粘附在腔室内部支撑结构上的铝箔膜构成，形成两个相距0.4 cm的平行电极。这种结构是商用电极的常见配置，具有坚固的设计，可快速适配现有实验方案。该腔室可适配专为25 mm × 55 mm载玻片设计的环境培养仓，而此载玻片尺寸也是商业显微镜供应商普遍支持的标准规格。脉冲发生器可提供高达330 V的指数衰减脉冲，支持开展多种实验，包括可逆和不可逆电穿孔。
为了研究脉冲电场（PEFs）对细胞周期的影响，我们使用了一种转基因的人类骨肉瘤细胞系（U2 OS），该细胞系表达荧光泛素化细胞周期指示剂（CA）5（FUCCI(CA)5），这是一种荧光活细胞周期报告系统。该系统引入了两种荧光标记的截短形式的Geminin和Cdt1蛋白，它们在细胞周期中以特定速率生成并被降解。此外，可通过稳定表达FUCCI(CA)5的U2-OS细胞系在实验过程中直接监测凋亡过程。在细胞周期中，由于这些报告蛋白的生成与降解速率与其在细胞内天然表达的功能性蛋白相同，因此报告系统的运行具有可预测性。当发生细胞凋亡时，该周期会被打断，细胞周期迅速停止。通常，这在视觉上表现为细胞周期相关荧光信号的停滞，随后细胞核出现显著的形态学变化，而由于报告蛋白定位于细胞核，这些变化清晰可见6。这使得能够随时间对单个细胞中各个细胞周期时相进行可视化识别（图2）。可逆性电穿孔会改变细胞内环境，因此我们选择180 V的指数衰减脉冲进行研究。该脉冲参数旨在尽可能减少细胞死亡，同时确保群体中大多数细胞发生电穿孔。该参数是基于先前针对六种哺乳动物细胞系最佳电穿孔脉冲参数的研究确定的。180 V脉冲的能量密度略低于最佳转染参数，可在实现高效穿孔的同时提供更好的细胞存活率7。我们研究了该脉冲对未同步细胞以及通过胸苷双阻断法同步于S期的细胞的影响，分别在有无PEF处理的条件下进行实验（图3）。结果表明，与对照组相比，S期和G2期的平均持续时间缩短。这表明S期对PEF暴露较为敏感，导致细胞周期进程加快。该结果证明，电穿孔流式分析系统能够将PEF递送与长期活细胞成像相结合，用于细胞周期研究。尽管本研究利用该平台观察了细胞在PEF作用下通过细胞周期的进程，但该系统也可作为研究PEF在细胞培养中多种应用与条件下的有效工具。
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方案
1. 细胞培养准备
- 使用可逆电穿孔法制备稳定细胞系，参数如下：将重悬的U2 OS细胞（100 µL，浓度为6 × 106 个细胞/mL）与5 µg质粒DNA混合，加入0.4 cm的电穿孔杯中，施加180 V方波脉冲，持续10 ms。
- 使用任意合适的3D打印机及生物相容性塑料（如聚乳酸，PLA）打印定制腔室设计（参见补充文件1）。使用70%乙醇对完成的腔室进行消毒，并在使用前储存于无菌容器中。
- 将U2-OS FUCCI(CA)5细胞接种于10 cm培养皿中，加入10 mL含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM-高糖），在37 °C、5% CO2条件下培养。
- 当细胞融合度达到80%时，吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1.5分钟以解离细胞。
- 通过加入5 mL含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM-高糖培养基重悬细胞，以中和胰蛋白酶活性。
- 从重悬的细胞悬液中取100 µL样品，置于电穿孔流式检测系统底部的玻璃盖玻片上的腔室内。确保加样后腔室的细胞融合度约为30%。若加样后细胞密度过高，在孵育前应吸除样品并减少加样体积。
- 缓慢地从腔室远端加入4 mL含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM-高糖培养基，避免液体流动将样品冲出。
- 将标准显微镜载玻片盖在腔室上方，于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，确保细胞完全贴壁。可选步骤：在进行延时显微成像前30分钟，使用Hoechst 33342（1 µg/mL）对细胞核进行染色，以便于后续细胞定量分析及凋亡检测。
2. 显微镜准备
- 首先，开启带有环境控制功能和培养腔的倒置荧光显微镜，并在进行电穿孔前让环境条件稳定下来。
注意：可使用任何能够容纳 25 mm x 55 mm x 16 mm 腔室载玻片的带环境控制系统的倒置荧光显微镜。该设计最初是为所引用的倒置显微镜（见材料表）及其配套的环境控制系统而设计的。
载物台加热可能因金属膨胀而导致图像漂移。 - 当环境系统正在达到最佳温度时，使用合适的电缆将数字万用表连接至脉冲发生器的电容器和高压开关。为遵循本方案，使用"鳄鱼夹"电缆，以便与电穿孔腔室快速组装和拆卸。
- 接下来，选择20倍放大倍数，并通过显微镜软件确保已选中与FUCCI(CA)5系统中两种荧光蛋白相对应的FITC (GFP)和A594 (TexRed/mCherry)通道（可选DAPI通道用于Hoechst 33342）。使用低曝光设置（通常<0.05 s），以避免长时间延时成像过程中的光损伤。
- 在开始延时成像前，拍摄测试图像以优化图像的焦距和质量。
注意：荧光亮度仅需满足颜色可视化所需即可。 - 设置延时成像程序，每10分钟采集3–6个视野，持续24小时，以在每次延时成像中获得大量的细胞周期数据，同时减轻光损伤。
注意：成像时长可根据细胞活动的时间尺度进行调整。 - 为在延时成像期间获得最佳的细胞培养追踪效果，请确保已为A594通道启用自动对焦功能。
- 在电穿孔完成前，保持软件处于待机模式。一旦施加电脉冲，立即启动延时成像程序，以确保数据的最高准确性。
3. 电穿孔
- 将电穿孔细胞计数室放入配备适当环境控制室的显微镜中。在进行电穿孔前，保持环境控制室关闭并运行环境控制系统，以确保细胞周期不受影响。
- 将数字万用表连接至脉冲发生器，并通过打开环境控制室，使用鳄鱼夹电缆将脉冲发生器连接到计数室的电极上。
- 将脉冲发生器中的电容器充电至 180 V，并迅速将脉冲放电至计数室，直至数字万用表读数为 0 伏特。
- 移除与计数室连接的电极导线，并尽快重新盖上盖子，以确保培养条件正常。
- 一旦显微镜环境系统就位，立即启动延时成像。
4. 时间序列数据采集
- 完成延时拍摄后，使用显微镜软件将延时拍摄期间采集的图像合成为单个视频。在此阶段优化视频的视觉质量，以辅助手动定量分析。
注意：可选择任意帧率；然而，6帧/秒可提供适中的回放速度，视频每1秒对应1小时的实际时间。 - 准备好数码延时视频后，通过观察FITC和A594信号的变化，随时间追踪细胞各阶段的动态过程
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结果
利用FUCCI系统（图2），通过测量细胞因蛋白表达和去泛素化而呈现每种颜色的时间长度，获得了可视化的细胞周期数据。根据非同步化和同步化实验的结果（图3），S期脉冲电场（PEF）暴露显著上调了细胞周期进程，表现为各周期时相平均持续时间缩短，提示细胞周期加快。此外，实验还揭示了胸腺嘧啶对细胞周期的长期影响。同步化群体的对照数据显示，其平均细胞周期长度较非同步化群体更长；而S期同步化群体经脉冲处理后，其平均细胞周期长度与非同步化对照组相当。
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讨论
若操作正确，该方法可对大量单个细胞在长达24小时的时间内进行细胞周期时相数据的定量分析。本方案获得的细胞周期数据与FACs等其他方法相当。这是一种常用的方法，细胞在通过细胞周期的过程中会带上荧光标记。在孵育至少24小时后，根据荧光强度对细胞进行分选，荧光强度与处于特定周期时相的细胞群体数量相关8。先前使用该方法的研究表明，U2 OS细胞的细胞周期持续时间约为23–24小时9。这一结果与使用FUCCI(CA)5系统获得的数据一致，表明本实验方案能够达到与传统细胞周期报告技术相似的准确性。
尽管本方案概述了U2 OS细胞的使用，但FUCCI(CA)5构建体也可作为多种其他细胞系的有力工具。根据现有数据，PEF实验是该工具的一个有前景的应用方向。本方案主要可用于研究大群体细胞的动力学特征以及细胞周期活性的差异。因此，在正常增殖的细胞培养中，还可基于细胞周期是否持续进展，间接监测细胞的代谢活性10。这些数据通过将活细胞显微成像与PEF递送相结合，可...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们感谢Gupta实验室和Rackus团队成员在实验室内外提供的持续支持。本研究获得Mitacs合作项目的慷慨资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 腔室载玻片（3D打印/组装） | N/A | N/A | |
| 培养皿（10 cm） | Sarstedt | 83.3902 | |
| Delta Vision | Olympus | N/A | 也可以使用其他型号的显微镜。确保载物台和环境控制系统能够容纳电穿孔腔室载玻片（55 mm x |
| DMEM – 高葡萄糖 | Gibco | 11965092 | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | A5256701 | |
| i3 MK3S 3D 打印机 | Prusa | N/A | 可使用其他能够处理STL文件的打印机型号。 |
| 青霉素-链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15070063 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 10010031 | |
| tFUCCI(CA)5 | Addgene | 153521 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | 9002-07-07 | |
| U2-OS 细胞系 | ATCC | HTB-96 |
参考文献
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重印与许可
