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方法文章

研究躯体刺激对大鼠脊髓背角心脏锁定神经元反应的编码特征

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DOI：

10.3791/68016

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2025年5月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

本文内容

摘要

我们介绍了一种同时记录脊髓多通道细胞外电活动和心功能，并分析与心搏同步的脊髓背角神经元的方法。该方法为研究针刺诱导胸腔内脏功能变化背后的脊髓机制提供了一个时间同步的研究框架。

摘要

许多研究表明，电针可能对心血管疾病的治疗和预防具有益处。然而，其作用机制仍不甚清楚。胸段脊髓背角（SDH）在整合和调节躯体与内脏传入信号方面发挥重要作用，进而可能影响心脏功能的调控。与已被广泛研究的腰段SDH相比，由于手术暴露和立体定位固定的困难，胸段SDH的研究相对较少。本研究提供了一种结合心电图记录和微电极阵列技术，同步监测神经元活动与心脏功能的一般性方法。此外，我们还描述了如何通过计算神经元活动在心跳同步状态下的放电率分布，来识别与心跳锁定的神经元。该策略对于研究心血管功能与神经元活动之间的相关性，以及理解由外周神经刺激引发的躯体-心脏反射具有重要意义。

引言

针灸或体表刺激作为中医（TCM）体系中一种重要的治疗技术，通过刺激体表特定区域发挥作用。该疗法经由传入通路、中枢整合及自主神经传出机制调节内脏功能，实现机体功能的多层面调控。该疗法的核心理念在于，对解剖位置明确的穴位进行靶向刺激可引发生理功能的系统性调节。越来越多的临床证据支持针灸作为心血管疾病管理的辅助治疗手段，在初级预防和辅助治疗方案中均显示出疗效1，2。

感觉神经元的初级传入纤维主要终止于脊髓背角（SDH），相应地，脊髓背角神经元（SDHNs）在躯体传入信号的整合与调控中发挥关键作用3,4,5。此外，脊髓背角神经元还接收心脏传入纤维，并将内脏信息传递给脊髓交感前节神经元（SPNs），以实现对心血管功能的调节6。与心脏活动同步的SPNs位于脊髓胸段（T1-T5）的侧角区域，其轴突投射至颈段或胸段神经节，并通过心脏上、中、下神经进一步支配心脏。因此，胸段脊髓在整合与调节躯体和内脏传入信号方面具有重要作用，进而可能影响心脏功能的调控。因此，理解躯体刺激如何通过调节胸段脊髓背角神经元（SDHRNs）来调控心脏功能，具有重要意义。

既往研究表明，对内关穴（PC6）进行电针刺激（该穴位在T3脊髓节段构成同位性结构-功能单元）可通过调节自主神经系统缓解心肌缺血症状7,8,9。然而，针刺对心率的影响与神经系统活动之间的实时定量同步监测尚未实现，目前仅记录了针刺后自主神经活动和心电图（ECG）的即时指标。关于脊髓背角神经元（SDHNs）与内脏生理功能之间关联的研究仍十分有限。由于胸椎具有生理性弯曲，且相邻胸椎节段（尤其是T1-T5）之间的空间狭窄，导致这些区域难以接近，因此在阐明电针刺激T3脊髓同位性穴位PC6调控心脏功能以治疗心血管疾病（CVD）的脊髓机制方面，直接证据仍然匮乏。

为了更好地理解SDH与针刺介导的心功能调节之间的关系，需要同步记录心功能和神经活动。本文将介绍一种脊髓多通道细胞外记录与心功能记录相结合，并分析心搏锁定的SDHRN的通用方法。该方法为研究针刺诱导胸腔内脏功能变化背后的脊髓机制提供了时间同步的研究框架。

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方案

动物实验方案严格遵循国家标准的要求 "实验动物福利伦理审查指南" （GB/T 35892-2018）标准，并经机构伦理委员会批准。本研究采用6至8周龄、体重约220 g的雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠。所有实验过程中均穿戴实验服、手套和口罩。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表实验结束时，大鼠在深度麻醉下经心脏灌注后实施颈椎脱位处死。

1. 术前准备

  1. 将呼吸机管路连接至Y形气管插管，确保连接牢固且气密性良好。
  2. 通过呼吸机显示屏确认气流稳定、潮气量和呼吸频率设置适当，以验证通气功能正常。
  3. 在强光下目视检查管路各段，确保管路内无冷凝液或颗粒状污染物。
  4. 使用三通BNC连接器，将放大后的ECG信号同时输入心电图仪输入端口和微电极阵列记录系统的模拟输入端口。
  5. 通过三通BNC分路器传输放大信号，同时连接心电图仪的模拟输入端口和微电极阵列记录系统的模拟输入端口。
  6. 通过将心电图仪的TTL输出连接至微电极阵列记录系统的数字输入端，建立同步触发信号；使用BNC转杜邦接口线缆启动两个系统的同步采集，并验证时间对齐性。

2. 术前准备

  1. 麻醉
    1. 通过吸入3-5%异氟烷诱导麻醉，随后对麻醉后的大鼠进行腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）。在放置电极前使用异氟烷维持吸入麻醉，浓度保持在约1.2%。确认大鼠对疼痛刺激（通过夹趾）无反应且麻醉深度适当时，方可继续操作。
    2. 去除大鼠颈部前面和背部后侧的毛发。使用无菌铺巾隔离手术区域。
    3. 将大鼠仰卧位固定于加热毯上，并在大鼠眼睛上涂抹眼膏以防止干燥。整个手术过程中使用加热垫维持核心体温在37 °C ± 0.5 °C。观察呼吸频率，并用镊子按压足垫检查是否存在回缩反应。

3. 气管插管

  1. 将大鼠置于仰卧位，并用碘酊消毒颈部区域。
  2. 沿颈部正中线做约1 cm的纵向切口，钝性分离肌肉组织。
  3. 暴露甲状腺后，仔细分离两侧甲状腺叶之间的薄层膜结构，注意避免损伤甲状腺组织。继续暴露气管。
  4. 检查"Y形套管，确认其完全干燥。使用弹簧剪在气管上做一横向切口，随后将套管插入气管切口。用3-0不可吸收缝线固定气管套管，以防漏气和意外脱管。
  5. 仔细缝合颈部肌肉和皮肤，并将大鼠连接至呼吸机。根据大鼠体重调整呼吸频率至85次/分钟，潮气量至3.5 mL7（图1B）。

4. 心电图检测

  1. 将三个电极插入大鼠皮肤：正极插入左后肢，负极插入右前肢，接地电极插入右后肢10。
  2. 使用心电图仪（滤波设置：低通 100 Hz，高通 1 kHz；采样频率：4 kHz/s）采集数据。利用心电图记录软件进行数据的记录、保存与分析。

5. 心包导管术用于给药缓激肽（BK）

  1. 将大鼠置于仰卧位，并用碘伏对其胸部皮肤进行消毒。
  2. 在左侧上胸部第1至第3肋软骨之间行胸骨切开术，暴露胸腺。沿中线钝性分离胸腺，以暴露心包膜（见图1C,D）。
  3. 使用玻璃解剖针尖端（直径0.5 mm）在心包膜上刺一个小孔。
  4. 将一根长1-2 cm、远端带有多个小孔的硅胶导管经心包膜切口插入，并用生物胶将导管固定于胸壁组织。
  5. 逐层关闭胸腔，确保大鼠呼吸通畅（见图1D）。

6. 暴露T3脊髓

  1. 将大鼠置于俯卧位，用碘伏进行常规消毒。从T2至T6椎体沿背部正中线做一条长约8 cm的切口。
  2. 使用弹簧剪剪开皮肤和肌肉层，包括斜方肌。将拉钩插入肌肉之间，进一步暴露手术视野。
  3. 仔细分离大鼠胸椎前方的脂肪组织和冬眠腺，避免损伤腺体下方的血管（见图1E）。
  4. 去除附着在头夹固定部位以及长颈肌直部的肌肉，暴露T2棘突。
  5. 向两侧牵开半棘肌和棘肌，暴露T2至T6的椎板（见图1E）。使用咬骨钳切除T3椎体的棘突，从而暴露T3脊髓。
    注意：在暴露胸椎的过程中，应特别注意保留T2棘突，因其是后续暴露T3脊髓时主要的受力支点。
  6. 去除硬脊膜和蛛网膜，并在脊髓表面滴加石蜡油，以维持脊髓神经元的活性（见图1F）。
    注意：大鼠棕色脂肪组织的血管起源于T3、T4或T5椎板，呈静脉窦样分布。操作时应避免触碰，以防引起大鼠大量失血。

7. 胸椎固定与设置

  1. 使用定制的脊柱夹固定 T2 和 T6 椎骨的关节突。用生理盐水润湿周围肌肉，以维持组织湿润。
  2. 将电极阵列连接至立体定位仪的显微操作器，并通过 T3 脊髓节段背正中裂，在中线外侧 500 µm 处垂直插入脊髓背角，深度达 1,500 µm。
  3. 将参考电极插入背部肌肉（见图 1G）。
  4. 启动多通道细胞外记录软件，进入 文件 | 硬件配置；在 设备接口列表 中选择 32 通道阵列；右键点击 选定的通道组；然后从 上下文 菜单中选择 属性。配置信号处理参数：在 滤波器 选项卡下，将 带通滤波器 (BP) 设置为 250 Hz - 5 kHz；在 采样率 输入框中设置为 30 kHz/s；勾选标有 启用动作电位处理 的复选框，以激活实时动作电位分类和基于阈值的事件提取功能。
    注意：务必彻底清除 T2 和 T6 椎骨关节突周围的肌肉和组织，特别是在使用定制脊柱夹进行脊柱固定的位置，以防止后续实验过程中发生位移。

8. 体感刺激与BK刺激

  1. 使用缓激肽（BK，1 µg/mL，溶于蒸馏水中）诱导心脏伤害性刺激。通过连接至带有多个小孔的硅胶导管的微量注射器注入4 µL BK溶液11。
  2. 在注射后30分钟内观察心率变化（升高或降低）以及T3脊髓背角神经元放电活动（升高或降低），以识别胸段脊髓背角神经元之间的动态相互作用。
  3. 在内关穴（PC6）进行手法针刺（MAPC6），刺激参数为1 Hz。PC6穴位于前肢腹侧腕关节近端2 mm处，位于桡侧腕屈肌与正中神经主干之间。将针头（0.25 mm × 25 mm）插入PC6穴，进针深度约为3 mm。比较躯体刺激前后神经元活动及心脏功能的变化。

9. 数据分析与处理

  1. 将 ns6 格式记录的神经数据导入软件，步骤如下：
    1. 文件转换：进入 文件 | 打开 以加载 ns6 文件。选择 文件 | 另存为，并选择 .nex5 格式，以生成标准化的脉冲序列数据。
    2. 脉冲分类：将转换后的 .nex5 文件导入分类软件进行神经元分类。根据波形特征和主成分分析（PCA）对脉冲波形进行分类，阈值参数设定为基线噪声的 ±3 倍标准差（SD）。
    3. 随后，执行相应的代码以过滤和分类信号。
  2. 分析与心跳同步的 SDRN。
    1. 以 R 波作为参考事件，统计每个 R 波前后 0.2 秒时间窗口内的神经元放电次数。
    2. 在以 50 毫秒为间隔统计 R 波后，生成环形事件直方图。对直方图进行归一化处理（即减去 R 波事件前后 0.2 秒内的平均放电率），以获得每个神经元在心跳周期中的放电率分布。
    3. 通过蒙特卡洛12置换检验评估统计显著性，执行 1,000 次随机重排迭代。通过随机化每次心跳 R 波前后 0.2 秒的时间（范围为 ±0.1 秒），获得随机化心跳过程中神经元的放电率分布及置信区间。若某神经元在心跳周期中的放电分布超出（高于或低于）随机化心跳过程放电率分布的 95% 置信区间，则将该神经元识别为与心跳同步的神经元（见 补充文件 1）。

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结果

按照上述方案，暴露T3节段脊髓背根神经节（SDHNs），并向心包/穴位区域给予缓激肽（BK）或进行体感针刺。本研究定量分析了伤害性内脏传入、缓激肽应用及体感调节过程中，刺激诱发的神经元激活特征（类型/频率）以及同步的心电图（ECG）变化。

图2A显示了大鼠T3脊髓的横切面。左侧展示了不同板层的分布情况，右侧显示了橙色区域，代表Dil染料在孵育10分钟后分布的位置。将浸有Dil染料的阵列电极固定于立体定位仪的显微操作器上，随后将电极垂直插入T3节段脊髓背角，位置位于后正中裂外侧500 µm，深度达1,500 µm，并根据大鼠体重对插入深度进行调整。在持续15分钟的记录后，进行灌注和组织采集，期间电极记录到来自大鼠脊髓I至VIII板层的神经信号。图2B–D展示了从第19通道记录到的神经元的点阵图、波形、主成分分析（PCA）及自相关图。图2F、G

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讨论

解码背根神经节（SDH）神经元编码特征对于理解针刺治疗内脏功能障碍的神经调节机制至关重要。本文中，我们结合了多电极阵列（MEA） 体内 采用ECG记录系统同步记录T3节段背根神经节神经元（T3 SDHNs）的放电活动和心电图。心脏痛觉刺激可激活支配心脏的C型伤害性感受器，通过内脏、背根神经节（DRG）、T1-T5脊髓节段及脊上结构，将伤害性信息向前传导。交感传入纤维进入脊髓背角，经中间神经元中继后投射至脊髓侧角的节前神经元。这些节前纤维经白交通支进入交感干，在局部或上行至星状神经节（SG）以及中、下颈交感神经节，与节后神经元形成突触连接，从而调控心率13.

内关穴（PC6）在治疗心血管疾病中的作用机制非常复杂，尚未被完全阐明。目前，躯体-交感反射通路被认为是其中较为关键的通路之一。本研究探讨了针刺内关穴对T3脊髓节段内心脏锁相与非锁相神经元的调节作用。文献中已有采用多电极阵列（MEA）记录技术来记录脊髓背角（SDH）中宽动态范围（WDR）神经元放电活动的报道14

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金（No.82330127，No.82105029）、国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（编号：2022YFC3500702）、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（编号：ZZ-2023008）以及省级教育厅项目（编号：2019JM-027）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉系统Kent ScientificSomnoSuite
Central v6.5Black MicrosystemsCerebus-128
精细剪刀精细剪刀精细剪刀
Friedman-Pearson 咬骨钳Fine Science Tools16220-14
明胶海绵Coltene274-007
插管套管Harward Apparatus73-2737
异氟烷RWDR510
LabChart 专业软件LabChart 专业软件版本 8.0
microband 电极阵列NeuronexusA1x32-6mm-50-177
微操纵器NarishigeDMA-1510
针头Zhongyantaihe0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer 软件 (V5.0)PlexonV5.0
离线排序器 PlexonV4.0
PowerlabADInstrumentsPL26T04
大鼠中国人民解放军军事医学科学院实验中心
脊柱适配器N/AN/A定制
弹簧剪Fine Science Tools15023-10
立体定位仪NarishigeSR-5R-HT

参考文献

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