该方案通过生物信息学分析和实验验证，描述了多个与心肌缺血-再灌注损伤相关的新型二硫化物应激性死亡相关差异基因的鉴定。
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本文内容
摘要
摘要
心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）是指在缺血性损伤后恢复心肌组织血流过程中发生的附加性损伤。MIRI严重影响心肌梗死后再灌注治疗的疗效以及短期和长期预后。目前，MIRI的发生机制尚未完全阐明。二硫键应激性细胞死亡（disulfideptosis）是一种新发现的细胞死亡方式，MIRI与二硫键应激性细胞死亡相关基因（DRGs）表达之间的关系尚不清楚。本研究首先通过生物信息学分析探索MIRI中与二硫键应激性细胞死亡相关的差异表达基因；其次，通过构建MIRI大鼠模型进一步检测DRGs的表达情况。研究共鉴定出12个相关基因，包括Myh9、SLC7A11、SLC3A2、Myh7b、ACTB、FLNB、Actn1、Actn4、Flnc、Dbn1和Pdlim1。MIRI大鼠心肌组织表现出明显的病理损伤和细胞凋亡现象。免疫组化结果显示，MIRI刺激可上调心肌组织中GLUT1蛋白的表达，但抑制F-actin蛋白的表达。此外，利用外部数据集和MIRI大鼠模型验证了三种蛋白表达的显著差异。本研究表明，DRGs在MIRI中具有显著的预测价值，为探索MIRI的生物标志物及潜在治疗靶点提供了新的方向。
引言
急性心肌梗死（AMI）是一种严重的心血管疾病，仍是全球死亡的主要原因之一。经皮冠状动脉介入治疗显著降低了AMI患者的死亡率1。然而，旨在恢复心肌血液供应的再灌注治疗会伴随一系列不良的病理和生理反应。这些过程可能导致梗死面积增大、心肌细胞死亡、持续性室性心律失常以及猝死2。心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）是一种复杂的心血管病理状态，受多种因素影响，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、氧化应激以及钙超载3。减轻MIRI仍是目前面临的重要挑战。
最近，二硫死亡（disulfideptosis）作为一种新型的细胞死亡形式被提出，其特征是由于细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH+）耗竭，导致包括半胱氨酸在内的二硫化物过度积累，从而引发细胞骨架肌动蛋白网络迅速崩解。二硫化物的过度积聚会破坏细胞骨架蛋白之间的二硫键，导致肌动蛋白移位并最终引发细胞死亡4,5。与先前报道的细胞死亡形式（如凋亡、坏死、焦亡和铁死亡）不同，二硫死亡由细胞内二硫化物的过度聚集所启动，且不受其他细胞死亡通路特异性抑制剂的拮抗。作为一种独特的细胞死亡方式，已有证据表明，葡萄糖缺乏所诱导的SLC7A11过表达可触发二硫死亡
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方案
本研究选用来自湖北省实验动物研究中心［SCXK（湖北）20200018］的9只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄为6–8周，体重180–220 g。大鼠饲养于特定病原体阴性动物房中，适应环境1周，光照与黑暗各12小时交替，自由饮水和进食。本研究经遵义医科大学附属第三医院动物伦理委员会批准（批准号：(2016)-1-56）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理与使用指南》中的建议。已采取严格措施以尽量减少使用动物的数量，并减轻其痛苦。
1. 与MIRI和二硫化物中毒性细胞死亡相关的基因差异表达分析
注意：根据文献报道6，选择来自名为 GSE214122 的 MIRI 的 RNA 测序数据，以筛选与二硫死亡相关的基因。
- 打开 GEO 数据库，在搜索框中输入 GSE214122，然后按 Enter 键。在“下载”部分下载生成的系列矩阵文件（TXT 格式）。
注意：在进行数据分析之前，通常需要对下载的数据进行预处理，包括检查缺失值、剔除低质量的样本和基因，并对数据进行归一化或标准化处理。所获取的 GSE214122 数据集包含假手术组和 MIRI 组的样本。 - 使用 DESeq2 软件包7对样本进行差异基因表达分析....
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结果
心肌缺血再灌注损伤中差异表达基因的筛选
来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）的GSE214122数据集包含了三组假手术样本和三组心肌缺血再灌注损伤（MIRI）样本的数据。利用R语言中的DESeq2软件包，在MIRI样本与假手术样本之间共鉴定出1233个差异表达基因（DEGs）。根据|log2FC|>2且FDR<0.05的筛选标准，进一步使用R语言的pheatmap软件包筛选出417个显著差异表达的基因（图1A）。随后，取上述1233个差异表达基因与106个铁死亡相关基因（DRGs）的交集，共得到15个交集基因，如图1B所示。这15个差异表达的铁死亡相关基因进一步通过火山图进行注释，其中12个基因在火山图中标注，如图1C所示。接着，利用STRING数据库构建这15个DRGs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，其中网络中有三个基因未与其他基因连接，因此被剔除。最终的PPI.......
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讨论
二硫死亡与肌动蛋白细胞骨架密切相关，后者是一种对维持细胞形态和存活至关重要的关键细胞结构。肌动蛋白细胞骨架由肌动蛋白丝组成，赋予细胞整体的形态和结构。F-肌动蛋白是细胞骨架的标志物，在葡萄糖饥饿条件下，二硫键显著增加，导致F-肌动蛋白下调。这一现象主要影响与肌动蛋白细胞骨架和细胞黏附相关的进程和通路10，11。
在葡萄糖代谢的背景下，葡萄糖转运蛋白（GLUTs）在维持葡萄糖动态平衡中发挥着关键作用。GLUT1 是最早被发现的 GLUT 家族成员之一，是一种与葡萄糖摄取相关的蛋白，具有广泛的组织分布。它主要表达于红细胞12以及血脑屏障的内皮细胞13，参与葡萄糖的跨膜转运过程。GLUT1 可能与葡萄糖代谢异常相关疾病的发生发展密切相关。在葡萄糖饥饿模型中，GLUT1 表达上调，促进肿瘤细胞死亡；而在心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型中，GLUT1 表达上调会加重 MIRI，而.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由贵州省科学技术厅（黔科合〔2022〕583）和贵州省中医药管理局（黔中医药〔2016〕019）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 75% 酒精 | 中国湖南同瑞健制药有限公司，中国湖南 | 85026 | |
| 6-0 尼龙缝合线 | 中国上海浦东金环医疗器械有限公司，中国上海 | CS002 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0011 | |
| 牛血清白蛋白 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | ST2254 | |
| 离心 | 湖南科达科学仪器有限公司，中国湖南 | KH19A | |
| DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒 | 中国上海，碧云天生物技术有限公司 | P0203 | |
| DAPI染色液 | 中国上海碧云天生物技术公司 | C1006 | |
| DESeq2 软件包 | 版本 4.1 | ||
| 电动剃须刀 | Kelmerpp | 235376 | |
| 增强型内源性过氧化物酶阻断缓冲液 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0100B | |
| 滤纸 | 中国南京科瑞器材有限公司，中国南京 | 1.00049×10¹¹ | |
| 荧光显微镜 | 尼康 | ECLIPSE Ci | |
| GEO数据库 | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| 玻璃研磨器 | 中国上海，上海雷鼓仪器有限公司 | B-013002 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | V8.0 | |
| 苏木精和伊红染色试剂盒 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | C0105M | |
| Image J 软件 | 美国国立卫生研究院，贝塞斯达，美国 | v1.8.0 | |
| 改良柠檬酸抗原修复液（50X） | 中国上海，碧云天生物技术有限公司 | P0083 | |
| 碘伏 | Folca，中国深圳 | 1.00077×10¹¹ | |
| 光学显微镜 | 尼康 | ECLIPSE Ci | |
| 磷酸盐缓冲液 | 中国上海碧云天生物技术公司 | C0221A | |
| 抗GLUT1一抗 | Proteintech Group, Inc, 中国武汉 | 21829-1-AP | |
| 针对 MYH9 的一抗 | Proteintech Group, Inc，中国武汉 | 11128-1-AP | |
| 抗SLC3A2一抗 | 中国武汉灵思生物科技有限公司，中国武汉 | LJS-D-7468 | |
| 针对 SLC7A11 的一抗 | Proteintech Group, Inc, 中国武汉 | 26864-1-AP | |
| 蛋白质可视化仪器 | 赛默飞世尔科技公司 | iBright CL750 | |
| 大鼠站板 | 中国郑州，郑州好派生物科技有限公司 | JPB-E | |
| 手术刀 | 中国上海联汇医疗用品有限公司，中国上海 | 1.00471×10¹³ | |
| 二抗 | 中国武汉，武汉博奥生物技术有限公司 | BA1054 | |
| STRING数据库 | https://cn.string-db.org/ | 版本 12.0 | |
| Triton X-100 | 中国上海碧云天生物技术公司 | ST1722 | |
| TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 | Proteintech Group, Inc.，中国武汉 | PF00009 |
参考文献
- Lu, Z., et al. Tripartite motif 38 attenuates cardiac fibrosis after myocardial infarction by suppressing TAK1 activation via TAB2/3 degradation. iScience. 25 (8), 104780(2022).
- Tu, Q., et al.
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