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方法文章

大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型中二硫化物应激相关差异基因分析及验证

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DOI：

10.3791/68019

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2025年4月18日

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University

本文内容

摘要

该方案通过生物信息学分析和实验验证，描述了多个与心肌缺血-再灌注损伤相关的新型二硫化物应激性死亡相关差异基因的鉴定。

摘要

心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）是指在缺血性损伤后恢复心肌组织血流过程中发生的附加性损伤。MIRI严重影响心肌梗死后再灌注治疗的疗效以及短期和长期预后。目前，MIRI的发生机制尚未完全阐明。二硫键应激性细胞死亡（disulfideptosis）是一种新发现的细胞死亡方式，MIRI与二硫键应激性细胞死亡相关基因（DRGs）表达之间的关系尚不清楚。本研究首先通过生物信息学分析探索MIRI中与二硫键应激性细胞死亡相关的差异表达基因；其次，通过构建MIRI大鼠模型进一步检测DRGs的表达情况。研究共鉴定出12个相关基因，包括Myh9、SLC7A11、SLC3A2、Myh7b、ACTB、FLNB、Actn1、Actn4、Flnc、Dbn1和Pdlim1。MIRI大鼠心肌组织表现出明显的病理损伤和细胞凋亡现象。免疫组化结果显示，MIRI刺激可上调心肌组织中GLUT1蛋白的表达，但抑制F-actin蛋白的表达。此外，利用外部数据集和MIRI大鼠模型验证了三种蛋白表达的显著差异。本研究表明，DRGs在MIRI中具有显著的预测价值，为探索MIRI的生物标志物及潜在治疗靶点提供了新的方向。

引言

急性心肌梗死（AMI）是一种严重的心血管疾病，仍是全球死亡的主要原因之一。经皮冠状动脉介入治疗显著降低了AMI患者的死亡率1。然而，旨在恢复心肌血液供应的再灌注治疗会伴随一系列不良的病理和生理反应。这些过程可能导致梗死面积增大、心肌细胞死亡、持续性室性心律失常以及猝死2。心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）是一种复杂的心血管病理状态，受多种因素影响，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、氧化应激以及钙超载3。减轻MIRI仍是目前面临的重要挑战。

最近，二硫死亡（disulfideptosis）作为一种新型的细胞死亡形式被提出，其特征是由于细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH+）耗竭，导致包括半胱氨酸在内的二硫化物过度积累，从而引发细胞骨架肌动蛋白网络迅速崩解。二硫化物的过度积聚会破坏细胞骨架蛋白之间的二硫键，导致肌动蛋白移位并最终引发细胞死亡4,5。与先前报道的细胞死亡形式（如凋亡、坏死、焦亡和铁死亡）不同，二硫死亡由细胞内二硫化物的过度聚集所启动，且不受其他细胞死亡通路特异性抑制剂的拮抗。作为一种独特的细胞死亡方式，已有证据表明，葡萄糖缺乏所诱导的SLC7A11过表达可触发二硫死亡4。在心肌缺血再灌注损伤（MIRI）后，胰岛素分泌不足可导致低血糖，进而引发二硫死亡，这可能对心肌细胞造成进一步损伤，并可能是MIRI的新型机制之一5。

本研究的主要目标是利用基因表达综合数据库（如基因表达汇编数据库 Gene Expression Omnibus, GEO），分析正常样本与心肌缺血再灌注损伤（MIRI）样本之间的差异基因表达。我们对差异表达基因与已知与二硫死亡（disulfideptosis）相关的基因进行了交叉比对分析，旨在鉴定在MIRI中差异表达的二硫死亡相关基因（DRGs）。采用机器学习算法筛选关键基因，并通过动物模型验证所选定差异基因的表达模式。该策略为深入理解MIRI发生与进展的潜在机制提供了新的视角。本研究的核心重点是探索MIRI中一种新型的细胞死亡机制，挖掘与其相关的差异表达基因，并开展初步实验以验证这些发现。最终目标是基于这一新兴的细胞死亡机制，识别出可用于缓解MIRI的潜在治疗靶点。

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方案

本研究选用来自湖北省实验动物研究中心［SCXK（湖北）20200018］的9只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄为6–8周，体重180–220 g。大鼠饲养于特定病原体阴性动物房中，适应环境1周，光照与黑暗各12小时交替，自由饮水和进食。本研究经遵义医科大学附属第三医院动物伦理委员会批准（批准号：(2016)-1-56）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理与使用指南》中的建议。已采取严格措施以尽量减少使用动物的数量，并减轻其痛苦。

1. 与MIRI和二硫化物中毒性细胞死亡相关的基因差异表达分析

注意：根据文献报道6，选择来自名为 GSE214122 的 MIRI 的 RNA 测序数据，以筛选与二硫死亡相关的基因。

  1. 打开 GEO 数据库，在搜索框中输入 GSE214122，然后按 Enter 键。在“下载”部分下载生成的系列矩阵文件（TXT 格式）。
    注意：在进行数据分析之前，通常需要对下载的数据进行预处理，包括检查缺失值、剔除低质量的样本和基因，并对数据进行归一化或标准化处理。所获取的 GSE214122 数据集包含假手术组和 MIRI 组的样本。
  2. 使用 DESeq2 软件包7对样本进行差异基因表达分析。将 |log2FC|>1（倍数变化大于 2）且 FDR<0.05 的基因视为具有统计学显著性，从而鉴定出与 MIRI 相关的差异表达基因。使用 R 语言的 pheatmap 软件包7生成步骤 1.2 中的差异基因表达热图。
  3. 使用 R 语言的 VennDiagram 软件包7（见材料表）构建维恩图。使用 R 中的 EnhancedVolcano 软件包7生成火山图，以可视化与二硫死亡（disulfideptosis）相关的基因。
  4. 利用 STRING 数据库7（见材料表）构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，连接 MIRI 差异表达基因与二硫死亡相关基因。

2. 大鼠MIRI模型的构建

  1. 在实施麻醉前，对大鼠进行过夜禁食。通过腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）对大鼠进行麻醉，并将其四肢固定于大鼠固定板上，保持仰卧位。通过脚趾夹捏无反应、翻正反射消失以及眨眼反射消失来确认麻醉深度。麻醉期间使用兽用眼膏以防止角膜干燥。
  2. 使用碘伏对颈部和胸部皮肤进行消毒，并用75%酒精脱碘。使用电动剃刀剃除颈部及左侧胸部的毛发，随后用手术刀做一条长约2.5 cm的颈部正中切口（参见材料表）。
  3. 用镊子分离气管，并进行气管插管，连接小型动物呼吸机3（参见材料表）。
  4. 沿胸骨左侧用眼科剪纵向剪开约4 cm切口，用镊子钝性分离皮下肌肉，暴露第三与第四肋骨之间的胸膜。
  5. 持手术刀呈45°角，从剑突至左侧第二肋间中点做一4–5 cm长的切口。使用眼科镊子轻柔缓慢地分离胸大肌和前锯肌，以进入肋间区域。
  6. 在左侧第三与第四肋骨之间使用眼科剪做一1.5 cm横向切口。用眼科镊子分离心包后，用镊子提起左心耳，以识别主动脉根部的冠状动脉开口。
  7. 使用6-0缝线在肺动脉圆锥与左心耳之间结扎左前降支冠状动脉（参见材料表）。
  8. 30分钟后，松开缝线以实现再灌注，持续120分钟，随后使用6-0缝线逐层缝合肌肉和皮肤。通过腹腔注射青霉素（参见材料表），剂量为80,000–100,000单位。
  9. 假手术组大鼠执行与模型组相同的所有操作步骤，仅将缝线穿过左前降支冠状动脉而不进行结扎或再灌注。
  10. 待大鼠恢复意识后，拔除气管插管。将大鼠送回动物房恢复，自由摄取食物和饮水。将接受手术的大鼠单独饲养于具有独立通风系统的笼具中，并置于无菌实验室环境内。
  11. 在30分钟缺血期和120分钟再灌注期内进行超声心动图检查。若测得左心室射血分数低于50%，则认为造模成功1,6。

3. 收集心脏组织3

  1. 再灌注120分钟后，将大鼠放入安乐死容器中，通过吸入二氧化碳实施安乐死。立即采集大鼠的心脏组织。
  2. 使用剃毛装置去除大鼠腹部毛发，并用碘伏和75%酒精消毒胸部前表面。用手术刀沿腹部正中线切开，暴露腹腔。
  3. 用手术剪从剑突向上剪至下颌下区域，用镊子钝性剥离皮肤及皮下组织至两侧，暴露胸廓和浅层颈肌层（参见材料表）。
  4. 用手术剪沿正中线打开胸腔和胸膜，暴露心脏，用血管夹夹闭主动脉，并用眼科剪剪断动脉。取出心脏，在冰浴中的冷生理盐水中将其切成1 mm3的组织块，用4%多聚甲醛固定48小时（参见材料表）。

4. 苏木精-伊红（H&E）染色

  1. 脱水与包埋：将心脏组织块依次浸入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇（I）、95%乙醇（II）、100%乙醇（I）和100%乙醇（II）中，每种溶液浸泡1小时进行脱水。用二甲苯（I）和二甲苯（II）各浸泡15分钟进行透明处理。将心脏组织块依次放入液态石蜡（I）、石蜡（II）和石蜡（III）中，每步20–30分钟。让石蜡块自然冷却至完全凝固。
  2. 使用石蜡切片机将包埋好的心脏组织块切成4 µm厚的切片（参见材料表）。用软毛刷将切片展平后置于45 °C水浴中，待切片完全展开后用载玻片捞起。
  3. 脱蜡：将切片置于55 °C烘箱中烘烤30–60分钟，然后依次用二甲苯（I）和二甲苯（II）各脱蜡5–10分钟。接着用无水乙醇洗涤1–5分钟，95%乙醇洗涤1–5分钟，75%乙醇洗涤1–5分钟，最后用自来水冲洗1–5分钟。
  4. 染色：用苏木精溶液染色5–20分钟，自来水冲洗5–10秒，再用伊红溶液染色15–30秒，最后用75%–85%乙醇洗涤30秒。
  5. 脱水、透明与封片：依次用95%乙醇（I）脱水0.5–2分钟、95%乙醇（II）脱水2–5分钟，再用无水乙醇（I）脱水2–5分钟、无水乙醇（II）脱水2–5分钟。随后用二甲苯（I）透明1分钟、二甲苯（II）透明1分钟，然后在切片上滴加两滴中性树胶，盖上盖玻片进行封片。轻轻按压盖玻片，使中性树胶均匀充满切片（参见材料表）。
  6. 由两名独立的技术人员以双盲法在光学显微镜下以200倍放大倍数观察每张切片。
    1. 随机选取三个视野，评估心肌充血、出血、纤维化、坏死和变性情况。采用以下评分标准：0分表示无病变；0–1分表示病变范围小于指定区域的1/4；1–2分表示病变范围约为指定区域的1/4–1/2；2–3分表示病变范围约为指定区域的1/2–3/4；3–4分表示病变范围大于指定区域的3/4。

5. TUNEL 检测

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）将蛋白酶K稀释至40 µg/mL，并向步骤4.3制备的4 µm切片中加入100 µL蛋白酶K溶液，覆盖整个样本区域，在室温下孵育10分钟。
    注意：蛋白酶K包含在TUNEL细胞凋亡检测试剂盒中（见材料表）。
  2. 用PBS洗涤切片2次，每次5分钟，用滤纸吸除多余液体，并将切片置于湿盒中保持湿润。
    注意：必须彻底洗去蛋白酶K，以免干扰后续标记反应。
  3. 均匀加入50 µL TUNEL反应液（含2 µL TdT酶和48 µL TUNEL反应缓冲液），将切片置于湿盒中，在37 °C避光孵育2小时。
    注意：TdT酶和TUNEL反应缓冲液均包含在TUNEL细胞凋亡检测试剂盒中。
  4. 弃去TUNEL反应液，用PBS漂洗2次，每次5分钟。再用含0.1% Triton X-100和5 mg/mL BSA的PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
  5. 均匀加入50 µL DAPI染色液，在室温避光条件下孵育10分钟。弃去DAPI染色液，将切片浸入PBS中清洗3次，每次5分钟。
  6. 分别在激发波长/发射波长593/614 nm和364/454 nm条件下获取TUNEL红色信号和DAPI蓝色信号。在荧光显微镜下以200倍放大倍数采集图像（见材料表）。

6. 免疫组织化学染色

  1. 在4.3步骤中的切片上加入200 µL增强型内源性过氧化物酶阻断缓冲液，室温避光孵育10分钟。用蒸馏水洗涤切片2次，每次5分钟。
  2. 向抗体孵育盒中加入1 mL改良柠檬酸抗原修复液和49 mL双蒸水，轻轻混匀。将切片浸入抗原修复液中，95 °C加热20分钟，随后冷却至室温（参见 材料表).
  3. 用 PBS 洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。将切片置于抗体孵育盒中，加入 100 µL 针对 F-actin（1:100）、GLUT1（1:200）、Myh9（1:200）、SLC7A11（1:200）和 SLC3A2（1:200）的一抗，4 °C 过夜孵育。
  4. 用 PBS 洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。向切片加入 100 µL 二抗，在室温下孵育 20 分钟。
  5. 用 PBS 洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。加入 100 µL DAB 工作液，室温染色 5 分钟，然后用纯化水冲洗以终止显色反应。
    注意：DAB工作液通过将DAB显色溶液A与DAB显色溶液B按1:1比例混合配制而成，该试剂包含于DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒中（参见 材料表).
  6. 用100 µL苏木精染色液染色3分钟，然后用流水冲洗3分钟（参见 材料表).
    注意：苏木精-伊红染色试剂盒包含苏木精染色液。
  7. 将切片依次浸入75%乙醇、95%乙醇和100%乙醇中，每种浓度各浸泡2分钟。
  8. 用中性树脂封片，盖上盖玻片，在光学显微镜下以200倍放大倍数观察切片（参见 材料表呈现棕色的组织为阳性反应。阳性表达率按视野中染色区域面积与总面积的比值计算。使用Image J软件进行定量分析。

7. 蛋白质印迹检测

注意：裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂包含在BCA蛋白定量试剂盒中（参见材料表）。

  1. 称取步骤3.5中获得的新鲜心肌组织样品0.1 g，加入1 mL裂解缓冲液和10 µL蛋白酶抑制剂，于玻璃研磨容器中研磨，随后在4 °C条件下以10,304 × g 离心10分钟。
  2. 收集上清液，按照试剂盒说明书使用BCA法进行蛋白定量8。将上清液在95 °C下煮沸5分钟。
  3. 采用10%分离胶进行蛋白电泳，每孔上样10 µL，在80/120 V电压下分离不同分子量的蛋白质。
  4. 将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜9，随后用5%脱脂奶粉封闭1小时，并在4 °C下与Myh9、SLC7A11、SLC3A2和β-tubulin一抗（稀释比例为1:1000，参见材料表）孵育过夜。
  5. 用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后在室温下与二抗（1:5000；参见材料表）孵育2小时，再用PBS洗涤3次，每次5分钟，最后使用蛋白成像仪进行显影（参见材料表）。
  6. 使用Image J软件8,9计算各条带灰度值与β-tubulin的比值。

8. 统计分析

  1. 以均值 ± 标准差表示数据。采用单因素方差分析，随后进行最小显著性差异（LSD）事后检验进行数据分析。使用商业统计分析软件（见材料表）进行统计分析，以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。

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结果

心肌缺血再灌注损伤中差异表达基因的筛选
来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus）的GSE214122数据集包含了三组假手术样本和三组心肌缺血再灌注损伤（MIRI）样本的数据。利用R语言中的DESeq2软件包，在MIRI样本与假手术样本之间共鉴定出1233个差异表达基因（DEGs）。根据|log2FC|>2且FDR<0.05的筛选标准，进一步使用R语言的pheatmap软件包筛选出417个显著差异表达的基因（图1A）。随后，取上述1233个差异表达基因与106个铁死亡相关基因（DRGs）的交集，共得到15个交集基因，如图1B所示。这15个差异表达的铁死亡相关基因进一步通过火山图进行注释，其中12个基因在火山图中标注，如图1C所示。接着，利用STRING数据库构建这15个DRGs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，其中网络中有三个基因未与其他基因连接，因此被剔除。最终的PPI...

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讨论

二硫死亡与肌动蛋白细胞骨架密切相关，后者是一种对维持细胞形态和存活至关重要的关键细胞结构。肌动蛋白细胞骨架由肌动蛋白丝组成，赋予细胞整体的形态和结构。F-肌动蛋白是细胞骨架的标志物，在葡萄糖饥饿条件下，二硫键显著增加，导致F-肌动蛋白下调。这一现象主要影响与肌动蛋白细胞骨架和细胞黏附相关的进程和通路10，11。

在葡萄糖代谢的背景下，葡萄糖转运蛋白（GLUTs）在维持葡萄糖动态平衡中发挥着关键作用。GLUT1 是最早被发现的 GLUT 家族成员之一，是一种与葡萄糖摄取相关的蛋白，具有广泛的组织分布。它主要表达于红细胞12以及血脑屏障的内皮细胞13，参与葡萄糖的跨膜转运过程。GLUT1 可能与葡萄糖代谢异常相关疾病的发生发展密切相关。在葡萄糖饥饿模型中，GLUT1 表达上调，促进肿瘤细胞死亡；而在心肌缺血再灌注损伤（MIRI）模型中，GLUT1 表达上调会加重 MIRI，而...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由贵州省科学技术厅（黔科合〔2022〕583）和贵州省中医药管理局（黔中医药〔2016〕019）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
75% 酒精中国湖南同瑞健制药有限公司，中国湖南85026
6-0 尼龙缝合线中国上海浦东金环医疗器械有限公司，中国上海CS002
BCA蛋白定量试剂盒中国上海碧云天生物技术有限公司P0011
牛血清白蛋白中国上海碧云天生物技术有限公司ST2254
离心湖南科达科学仪器有限公司，中国湖南KH19A
DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒中国上海，碧云天生物技术有限公司P0203
DAPI染色液中国上海碧云天生物技术公司C1006
DESeq2 软件包版本 4.1
电动剃须刀Kelmerpp235376
增强型内源性过氧化物酶阻断缓冲液中国上海碧云天生物技术有限公司P0100B 
滤纸中国南京科瑞器材有限公司，中国南京1.00049×10¹¹
荧光显微镜尼康ECLIPSE Ci
GEO数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
玻璃研磨器中国上海，上海雷鼓仪器有限公司B-013002
GraphPad PrismGraphPad SoftwareV8.0
苏木精和伊红染色试剂盒中国上海碧云天生物技术有限公司C0105M
Image J 软件美国国立卫生研究院，贝塞斯达，美国v1.8.0
改良柠檬酸抗原修复液（50X）中国上海，碧云天生物技术有限公司P0083
碘伏Folca，中国深圳1.00077×10¹¹
光学显微镜尼康ECLIPSE Ci
磷酸盐缓冲液中国上海碧云天生物技术公司C0221A
抗GLUT1一抗Proteintech Group, Inc, 中国武汉21829-1-AP
针对 MYH9 的一抗Proteintech Group, Inc，中国武汉11128-1-AP
抗SLC3A2一抗中国武汉灵思生物科技有限公司，中国武汉LJS-D-7468
针对 SLC7A11 的一抗Proteintech Group, Inc, 中国武汉26864-1-AP
蛋白质可视化仪器赛默飞世尔科技公司iBright CL750
大鼠站板中国郑州，郑州好派生物科技有限公司JPB-E
手术刀中国上海联汇医疗用品有限公司，中国上海1.00471×10¹³
二抗中国武汉，武汉博奥生物技术有限公司BA1054
STRING数据库https://cn.string-db.org/版本 12.0
Triton X-100中国上海碧云天生物技术公司ST1722
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒Proteintech Group, Inc.，中国武汉PF00009

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