本文介绍了一种利用套管技术将组织工程血管移植物植入小鼠颈动脉的实验方案，为研究血管组织再生机制提供了合适的动物模型。
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本文内容
摘要
摘要
小直径血管移植物的开发是一项全球性的研究工作，众多研究团队为此领域做出了贡献。在缺乏临床应用的情况下，动物实验在评估血管移植物的有效性和安全性方面发挥着关键作用。与其他动物模型相比，小鼠植入模型具有多项优势，包括明确的遗传背景、成熟的疾病模型构建方法以及简便的手术操作。基于这些优势，本研究设计了一种简便的套管技术，用于在小鼠颈动脉中植入组织工程血管移植物。该技术首先制备聚己内酯（PCL）小直径血管移植物 通过 静电纺丝，随后通过灌注吸附法将巨噬细胞接种到移植物上。随后， 将细胞化的组织工程血管移植物通过套管技术移植到小鼠颈动脉，以评估其通畅性及再生能力。移植30天后 体内 植入后，血管通畅性良好，移植物管腔内可见新生组织再生及内皮层形成。所有数据均采用统计学与绘图软件进行分析。本研究成功建立了小鼠颈动脉植入模型，可用于探究血管再生的细胞来源以及活性物质的作用机制，同时为新型小直径血管移植物的开发提供了理论依据。
引言
全球范围内，心血管疾病的患病率和死亡率不断上升，已成为重大的公共卫生问题1。血管旁路移植术是治疗严重冠心病和外周血管疾病的有效干预手段2。在临床实践中，直径超过6 mm的人工血管移植物已有充分的应用记录。然而，直径小于6 mm的移植物则容易发生血栓形成和内膜增生，从而导致较高的再狭窄风险3。尽管近年来小口径血管移植物的研发取得了显著进展，部分产品已接近临床应用，但仍面临诸多挑战4,5。这些问题包括长期通畅率相对较低、血管再生能力有限，以及对再生机制的理解尚不充分。
新型小直径血管移植物的临床前评估依赖于在多种动物模型中的体内植入。最常用的模型包括绵羊颈动脉、犬股动脉、兔颈动脉以及大鼠腹主动脉植入模型6,7,8,9。血管移植物的通畅性可在中等到大型动物（如绵羊、猪和犬）中进行评估。然而，由于需要专业技术与设备，这些研究涉及较高的成本。此外，其技术复杂性也给实施带来挑战。相比之下，兔和大鼠等小型动物模型缺乏遗传背景明确的成熟转基因品系，这在研究血管再生机制时构成了重大障碍。
与上述动物模型相比，小鼠模型具有相对简单的手术操作、成熟的基因工程小鼠制备方法以及明确的遗传背景。然而，由于小鼠血管直径较小，进行血管移植时的端对端吻合在技术上较为复杂，需要较高的操作技巧，且成功率相对较低。为了降低手术难度并提高血管移植物植入的成功率，本研究在小鼠颈动脉植入模型中采用了套管技术。
随后 体内 植入后，血管移植物可募集参与血管组织再生的内源性细胞。这些细胞的存在有助于内皮化和 平滑肌层的再生 移植物10然而，参与血管组织再生的细胞来源和类型仍不明确，目前有多种相互竞争的理论正在研究中11在这些研究中，炎症细胞和干细胞的作用受到关注。Breuer 等人将人骨髓来源的单核细胞（hBMCs）接种到血管移植物上，发现接种的细胞通过释放单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）将宿主细胞募集至移植物壁内，从而促进血管组织再生。12本研究提出了一种高效的灌注吸附式细胞接种方法，并成功用于将巨噬细胞接种至聚己内酯（PCL）小口径血管移植物上。植入后，这些细胞表现出持续的活性。
本文详细介绍了利用套管技术制备组织工程血管移植物并在小鼠颈动脉中进行移植的实验方法。该过程首先采用明确的参数制备PCL小直径血管移植物 通过 静电纺丝。随后，被认为合适的移植物 适用于植入的需经历机械处理 检测。 然后采用灌注吸附法将巨噬细胞接种到血管移植物上。最后，利用套管技术将接种巨噬细胞的血管移植物植入小鼠颈动脉，并在术后一个月评估其通畅性及再生性能。 体内 植入
该技术有望提高小鼠模型中血管移植的效果和成功率。此外，该模型可用于研究血管再生过程中细胞来源、关键基因和活性因子的作用机制，为小口径血管移植物的功能化改造及新型移植物的开发提供理论和方法学支持。
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方案
所有动物实验均经中国医学科学院放射医学研究所动物实验伦理委员会批准，并符合《实验动物护理与使用指南》的要求。本研究使用8-10 周龄、体重为25-30 g的雄性C57BL/6小鼠。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 小直径血管移植物的制备
注意：使用静电纺丝技术制备小直径聚己内酯（PCL）血管移植物13。
- 在室温下将PCL分别配制成10%、15%和20%（w/v）的六氟异丙醇（HFIP）溶液，搅拌12小时。
- 将PCL溶液装入10 mL注射器中，并安装21 G不锈钢针头。
- 将直径为0.7 mm、长度为20 cm的钨钢芯轴固定在收集装置上。
- 采用静电纺丝技术制备九组PCL血管移植物。将高压电源连接至针头，并在针头前方固定距离处放置内径为0.7 mm的钨钢棒作为接收装置。
注：血管移植物分组的详细说明见表1，移植物参数详见表2。 - 对制备的血管移植物进行脱气处理：将移植物置于真空干燥箱中72小时，以去除残留溶剂。
- 将移植物浸入医用酒精中30分钟，并经紫外光照射过夜，进行灭菌处理。
- 使用扫描电子显微镜（SEM）观察血管移植物的微观形貌。用导电胶将移植物固定于SEM样品台，随后放入镀金溅射仪中进行喷金处理。
- 在加速电压为15 kV的条件下，利用SEM观察血管移植物的结构及纤维形态。使用ImageJ软件对SEM图像（n = 5）中的纤维直径和孔径进行测量。
- 使用拉伸试验机评估血管移植物的力学性能（拉伸性能和弹性性能）。用间距为1 cm的固定夹具夹紧移植物的上下两端。
- 以10 mm/min 的速率拉伸移植物直至断裂，从拉伸试验机获取应力-应变曲线。
- 计算力学参数，包括最大载荷（2–15 N）、断裂应力（5–30 MPa）、断裂应变（200%–1500%）和弹性模量（1–20 MPa）14。
- 采用统计与绘图软件进行统计分析。数据以均值±标准差表示。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验分析多组间单变量差异。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
2. 将巨噬细胞接种到血管移植物上
注意：确保所有溶液和材料均为无菌。所有操作均需在细胞培养室内进行。
- 在贴壁条件下，于培养瓶中培养 RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞）细胞（图 1A）。使用完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），添加 1% 青霉素-链霉素和 10% 胎牛血清，配制细胞培养基。将培养瓶置于含 5% 二氧化碳的 37 °C 培养箱中。
- 使用细胞刮收集巨噬细胞。用 1 mL 移液器弃去培养基，并用 PBS 洗涤细胞。
- 向培养瓶中加入 2 mL 新鲜培养基，用细胞刮轻轻刮取细胞表面。将收集的细胞转移至离心管中，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟。将 5 × 106 个细胞重悬于 100 µL 完全培养基中。
- 将一段聚己内酯（PCL）血管移植物（长 1 cm）放入装有 DMEM 的 15 mL 离心管中，以 4,000 × g 离心 5 分钟。重复此步骤数次，直至移植物沉至管底，确保 DMEM 完全浸润材料。
- 准备一个底部铺有滤纸的 10 cm 培养皿。将湿润的 PCL 血管移植物置于滤纸上，并轻轻滚动以去除多余培养基。
- 用 10 µL 移液器吸取细胞悬液 10 µL，注入血管移植物的一端。在滤纸上旋转移植物，以促进悬液均匀分布。每端各注射 5 次，共注射 10 次（图 1B、C）。
- 将接种巨噬细胞的血管移植物放入含 1 mL 完全培养基的 24 孔板中，在细胞培养箱中孵育 2 小时后进行植入。
- 确定细胞在移植物壁内的分布情况。将接种巨噬细胞的血管移植物包埋于光学相干断层扫描（OCT）包埋剂中，进行冷冻切片。用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核，并在荧光显微镜下观察。
3. 小鼠颈动脉植入模型
注意：动物手术过程中需保持无菌手术区域。所有手术器械和一次性用品在手术前均应进行灭菌处理。
- 选取三只健康的雄性 C57BL/6 小鼠，每只体重为 25–30 g。 在每只动物体内植入一条血管移植物，共植入三条移植物。
- 使用尼龙管制作套管（图 2A），并在 图 2B 中展示血管套管技术的示意图。
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为 50 mg/kg）对小鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。通过夹趾反应确认麻醉深度。提供保温支持（37 °C 加热垫），并在眼睛上涂抹凡士林眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。
- 将小鼠仰卧位固定于手术台上，剃除颈部毛发。使用碘伏和酒精交替消毒皮肤数次。用无菌纱布覆盖非手术区域以维持无菌环境（图 3A）。
- 使用手术刀从下颌至胸骨做一条中线切口（长度为 1.5–2 cm）。抬起左侧唾液腺并切除左侧胸锁乳突肌以扩大手术视野。使用显微镊子暴露左侧颈总动脉（图 3B）。
- 使用显微镊子分离左侧颈总动脉（图 3C）。
- 使用 9-0 缝线在颈总动脉中段两个位置进行结扎。用显微剪刀在两结扎点之间切断动脉。将套管分别从两端穿过动脉，并使用动脉夹将动脉与套管固定在一起（图 3D）。
- 将动脉外翻覆盖套管本体，并使用显微镊子和 9-0 缝线将动脉固定于套管上（图 3E）。
- 通过将移植物两端滑过动脉套管并将两端用 9-0 缝线固定，将血管移植物植入颈总动脉的两个断端之间（图 3F）。
注意：套管、颈总动脉和血管移植物的尺寸数据见表 3。尽管移植物和套管的直径与小鼠颈总动脉的直径相近，但吻合口管腔直径与移植物直径之间仍存在不匹配。吻合口管腔直径通过从套管内径（0.5 mm）减去两倍颈总动脉壁厚度（0.1 mm）计算得出，结果为 0.3 mm。血管移植物的内径为 0.7 mm，因此直径不匹配约为 2.3 倍（0.7 mm / 0.3 mm = 2.3）。 - 移除两端的动脉夹，并用生理盐水冲洗植入部位。通过观察远端动脉搏动评估血管移植物的通畅性（图 3G）。
- 复位左侧唾液腺，并使用 6-0 缝线关闭手术切口（图 3H）。
4. 术后护理与分析
- 将小鼠转移至37 °C培养箱中，并持续监测其生命体征，直至恢复意识。
- 手术开始前30分钟，经腹腔给予5 mg/kg的酮洛芬。缝合完成后立即皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，此后每8小时重复一次，持续24小时。
- 在恢复期间监测小鼠状态，在其完全恢复之前不得将其放回群体饲养笼。
- 植入一个月后对小鼠进行麻醉，并采集血管移植物样本进行组织学分析9.
- 实施安乐死 通过 CO2 根据伦理准则，采用窒息法安乐死后进行颈椎脱位。
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结果
成功制备了具有不同参数的小直径血管移植物 通过 静电纺丝。SEM图像显示，纤维在移植物管壁内均匀分布，呈不规则排列，并可见孔隙结构（图4）。随着PCL浓度的增加，纤维直径和孔径均增大。各血管移植物组的具体数值如表所示 表 2机械测试结果表明，所有血管移植物均达到了规定的力学标准。最大载荷和断裂应变随PCL浓度的增加和血管壁厚度的增大而升高图 5A-C)，而弹性模量降低（图 5D）。根据这些研究结果，采用15% PCL浓度并具有特定壁厚的小直径血管移植物 150 µm 被选为后续实验的最佳移植物。
本研究采用灌注吸附法将巨噬细胞接种到血管移植物上。扫描电镜分析证实，巨噬细胞已成功接种于血管移植物表面，并呈均匀分布（图6A）。经DA...
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讨论
在小鼠颈动脉中采用套管技术植入组织工程血管移植物，代表了心血管研究领域的一项重要进展15。该技术的关键步骤包括细胞接种和移植物植入。本研究采用灌注吸附法提高巨噬细胞接种密度，以解决细胞接种不均匀和细胞存活率低的问题。该方法使巨噬细胞能够浸润血管移植物壁并均匀分布。
在血管植入方面，套管技术与端对端吻合16相比，可能更容易导致狭窄，尤其是在应用于直径较小的血管时。为尽量减少这一影响，选择了内外径与小鼠颈动脉直径相近的套管。相关尺寸见表3。
该技术有助于更简便地在小鼠颈动脉中进行血管移植物植入手术。既往小直径血管移植物研究中最常用的动物模型包括绵羊颈外静脉动静脉瘘模型和大鼠腹主动脉植入模型17,18。这些模型在评估血管移植物的机械强度和组织重塑能力方面具有较好效果；然而，它们在阐明潜在机...
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披露
作者不存在利益冲突的财务关系。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目（编号：32101098、32071356 和 82272158）以及中国医学科学院医学与健康科技创新工程（编号：2022-I2M-1-023）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% 青霉素-链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| 10% 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 酒精 | 天津化学试剂公司 | 1083 | |
| 抗小鼠 CD31 一抗 抗体 | BD Bioscience | 553370 | |
| 动脉夹 | RWD Life Science | R31005-06 | |
| C57BL/6 小鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | ||
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 11966025 | |
| 静电纺丝机 | 云帆科技 | DP30 | |
| 山羊抗大鼠 IgG（Alexa Fluor 555） | Invitrogen | A-21434 | |
| 苏木精-伊红（H&E） | Solarbio | G1120 | |
| 六氟异丙醇（HFIP） | 麦克林 | H811026 | |
| 碘伏 | LIRCON | V273068 | |
| 显微剪刀 | World Precision Instruments | 14124 | |
| 显微镊子 | World Precision Instruments | 500338 | |
| 正常山羊血清 | Boster | AR0009 | |
| 生理盐水 | 齐鲁制药有限公司 | H20113369 | |
| 套管用尼龙管 | Portex | ||
| 最佳切割温度化合物（OCT） | Sakara | 4583 | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma | P3761 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Solarbio | P1003 | |
| 聚（ε-己内酯）（PCL）颗粒（Mn = 80,000） | Sigma | 704067 | |
| RAW264.7 巨噬细胞 | 碧云天生物技术 | ||
| 扫描电子显微镜（SEM） | Zeiss | PHENOM-XL-G2 | |
| 6-0 外科缝合线 | 宁波成和微器械厂 | 220919 | |
| 9-0 外科缝合线 | 宁波成和微器械厂 | 221006 | |
| 注射器 | 长强医疗器械 | 0197 | |
| 拉伸试验机 | Instron | WDW-5D |
参考文献
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