本方案描述了在维持无菌条件下，将无菌小鼠转移并饲养于实验用单笼隔离器（隔离笼）中的最佳操作规范。同时讨论了向无菌小鼠进行粪便移植的方法，以及从这些肠道“人源化”小鼠中收集可存活细菌以用于后续应用的技术。
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摘要
摘要
无菌小鼠是研究微生物在宿主健康与疾病中作用的重要研究工具，可用于评估单个微生物、特定微生物群或复杂微生物群在宿主反应中的具体作用。传统上，无菌小鼠在柔性薄膜或半刚性隔离器中繁育和饲养，其饲养与实验操作成本高昂，且需要大量经过培训的人员以及动物设施中较大的空间。IsoPositive 隔离笼系统可在独立、密封、正压的隔离笼（isocages）中对无菌小鼠进行实验操作，从而降低成本，并提高实验操作的灵活性。
本文描述了一种将无菌小鼠从繁育隔离器转移至隔离笼，并通过人类供体粪便对小鼠进行粪便移植，以建立稳定的长期肠道“人源化”小鼠模型的实验方案，可用于后续研究。文中介绍了使用隔离笼系统所需的材料和准备工作，包括使用二氧化氯化学消毒剂对笼具、耗材、设备和个人防护装备进行灭菌的方法。同时讨论了确认转移后小鼠无菌状态的方法，以及如何检测笼具系统中的污染情况。进一步阐述了饲养管理的操作流程，包括垫料、饲料和饮水供应。此外，还详细描述了制备人源粪便悬液并经灌胃接种至无菌小鼠以建立肠道人源化小鼠模型的实验步骤，以及采集粪便样本以监测小鼠肠道微生物群组成的方法。一项实验结果表明，在人类粪便移植两周后，供体微生物群可在小鼠体内实现稳定定植，从而具备后续实验应用的条件。同时，本文还介绍了将人源化小鼠粪便收集于活性保存液中的方法，以便用于进一步的功能性实验。总体而言，这些方法可实现人源化小鼠微生物群在实验用无菌隔离笼中的安全、高效建立，便于后续干预与研究。
引言
无菌小鼠是微生物组研究者常用的重要工具，可用于解析微生物群在宿主健康与疾病状态中的作用。无菌小鼠出生时完全无菌，并在其整个生命周期中保持无菌状态1。通过将特定细菌菌株定植于无菌小鼠体内，可开展这些分类群与宿主代谢、免疫或其他生理功能之间的因果关系研究2,3,4,5。尤为有利的是，可通过移植来自人类供体的粪便样本，在微生物群层面实现无菌小鼠的“人源化”，并在屏障环境中饲养以防止来自小鼠自身微生物的污染1。这一方法已在微生物组研究领域促成多项重要发现，例如人类肠道微生物组对癌症免疫治疗疗效的影响6,7,8。
然而，尽管人源化无菌小鼠在微生物组研究领域具有不可估量的价值，但该方法的广泛应用仍受到诸多限制。无菌小鼠通常在半刚性或软膜式大型隔离器中繁育和维持，而功能性实验则需要额外搭建多个小型隔离器，每个小型隔离器可容纳若干笼具，但仅能维持单一实验条件。....
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方案
所有动物实验均经佛罗里达大学（UF）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并在UF动物照护设施中进行（IACUC方案编号：IACUC202300000005）。无菌野生型（GF WT；C57BL/6）小鼠群体由UF动物照护服务部无菌部门在隔离器中繁育并维持。将不同性别的GF WT小鼠从繁殖用隔离器中转移至ISOcage P生物排外系统，以便进行微生物操控。
人类粪便样本来自一项前瞻性观察性研究，该研究收集了接受免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的患者纵向粪便样本12。研究经 Advarra IRB（MCC#18611，Pro00017235）批准后，已从患者处获得知情同意。受试者接收并完成了一套液体牙科转运培养基（LDTM）粪便采集套件，该套件旨在为功能研究保存细菌活性。疗效评估将 n=4 份样本定义为应答者（R），n=6 份样本定义为无应答者（NR）。将经 LDTM 保存的均质化患者样本分别解冻后，逐一置于厌氧环境中不超过 90 秒，并按应答表型合并样本（R：n = 4，NR：n = 6）。合并后的样本随后被分装并储存在 -80 °C，用于本实验方案。为测定供体粪便的厌氧菌落形成单位（CFU）数量，将每位受试者的粪便样本进行连续梯度稀释至 1 × 10-5，每个稀释度取 10 µL，分别在厌氧脑心浸液（BHI）和Luria Bertani（LB）琼脂平板上双份涂布，估算每克粪便的CFU数量。根据每位受试....
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结果
将人类粪便样本按免疫检查点抑制剂（ICI）应答者与非应答者的表型进行分组（此前已在方案中描述），通过灌胃方式分别接种至无特定病原体的野生型（GF-WT）小鼠体内，每组小鼠分别饲养于3个隔离笼中（每笼1–2只，应答者组共6只，非应答者组共5只）。接种后，小鼠适应环境1周。随后，在无菌条件下收集这些小鼠的粪便样本。之后，小鼠再次通过灌胃接种1 × 107 CFU的应答者或非应答者混合人源粪便菌群。分别在灌胃后第1、2和4周收集小鼠粪便。由于粪便样本在无菌小鼠中对污染物的检出率可达100%，因此无需额外检测笼具垫料、饮水等其他环境样本14。为确认粪便移植前1周小鼠的无菌状态，从每只小鼠收集一粒新鲜粪便颗粒，称重后立即转移至厌氧环境。每份粪便样本用1 mL无菌厌氧磷酸盐缓冲液重悬，并使用无绳Pellet Pestle电机及无菌灭菌混合器进行手动匀浆。将匀浆后的粪便样本进行梯度稀释至1 × 10-5，每个稀释度取10 µL，重复接种于厌氧BHI琼脂平板上。同时，将各稀释样本从厌氧环境中取出，以相同方式接种于需氧BHI琼脂平板上。厌氧平板用Parafilm封.......
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讨论
本文所述方案提供了一种可重复且高度详细的实验方法，用于在实验用隔离笼中饲养的无菌小鼠的人源化处理。将人类供体的粪便菌群特异性移植到小鼠宿主中，对微生物组研究具有重要价值。在避免小鼠特异性共生微生物污染的情况下，研究人员能够探究定植于人体的细菌对多种健康与疾病状态的影响，或研究饮食干预、药物给药等手段对人体微生物组的作用16,17,18。此类研究对于揭示微生物组组成在健康与疾病状态中的因果关系至关重要。本方案还包括在保存介质中收集人源化小鼠粪便样本，以便后续恢复具有活性的微生物并用于进一步实验。本文未详述的另一应用是单菌定植（monoassociation）或使用明确定义的细菌群落（如Altered Schaedler菌群或小鼠肠道细菌集合[miBC]）进行定植13,19,20
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致谢
作者感谢佛罗里达大学动物护理服务部无菌动物服务分部在已知菌群动物饲养方面的协助，感谢 Brooke Bloomberg 博士和 Laura Eurell 博士在兽医及 IACUC 方面的支持，以及 Josee Gauthier 在 16S rRNA 基因测序方面的协助。本研究部分由佛罗里达大学健康癌症中心基金（C.J.）和佛罗里达大学医学院 Gatorade 基金（C.J.）资助。R.Z.G. 由佛罗里达大学健康癌症中心基金支持。R.C.N. 由佛罗里达大学国家卫生研究院 TL1 培训项目（TL1TR001428，UL1TR001427）、国家卫生研究院国家癌症研究所团队型跨学科癌症研究培训项目 T32CA257923 及佛罗里达大学健康癌症中心资助。本出版物所报告的研究由佛罗里达大学健康癌症中心支持，部分资金来自中国台湾州拨款 佛罗里达州法规 § 381.915 及 美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所，资助编号P30CA247796。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或佛罗里达州的官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL BD Slip Tip 注射器，无菌，一次性使用 | Fisher Scientific | 309659 | |
| 2.0 mL 螺口管，无滚花，带裙边，天然色，电子束灭菌，带可拆卸管盖 | Fisher Scientific | 14-755-228 | |
| 36 x 32 x 48" 3 密耳带褶聚乙烯袋 | Uline | S-13455 | |
| 5 加仑装 Exspor 二氧化氯消毒剂活化剂 | Ecolab | 6301680 | |
| 5 加仑装 Exspor 二氧化氯消毒剂原液 | Ecolab | 6301194 | |
| 600 mL 聚丙烯烧杯 | Fisher Scientific | S01914 | |
| ALPHA-dri 垫料 | 谢泼德特种纸业 | ||
| 厌氧培养箱 | Coy 实验室产品 | B型 | |
| II级生物安全柜 | Nuaire | ||
| 认证 IsoCage 可高压灭菌 HEPA 过滤器 XT 极端温度 | Tecniplast | 1245ISOFHXT | |
| Clear Lens LPX IQuity 安全护目镜 | Fastenal | 922205455 | |
| 杜邦 Tyvek 袖套 - 18" | Uline | S-13893E | |
| DWK生命科学DURAN 45毫米按压式天然橡胶盖 | Fisher Scientific | 01-258-107 | 1 L 高压灭菌瓶用橡胶瓶塞 |
| Dynalon Quick Mist HDPE 喷雾瓶 | Fisher Scientific | 03-438-12B | |
| Fisherbrand 聚丙烯量筒 | Fisher Scientific | 03-007-44 | |
| Fisherbran 解剖圆头镊 | Fisher Scientific | 08-887 | |
| Fisherbrand 即用型密封灭菌袋 | Fisher Scientific | 01-812-51 | |
| Fisherbrand 直头宽尖强头通用镊子 | Fisher Scientific | 16-100-107 | |
| Fisherbrand 无铅高压灭菌指示胶带 | Fisher Scientific | 15-901-110 | |
| 灌胃针，可重复使用的不锈钢材质。直型。22号针头，尖端直径1.25 mm，长度38 mm或1.5英寸（一打） | 布雷因特里科学公司 | N-PK 020 | |
| H-B Instrument Durac 计时器 | Fisher Scientific | 13-202-015 | |
| IsoPositive 笼架系统（即 isocages） | Tecniplast | ISO30P | 30个笼子（6宽×5高），单面 |
| 耐腈类化学品手套，尺码 S (7)、M (8) 或 L (9)，共 18 副” 长，22 密耳，Ansell | 格雷格纳 | 4T426 | |
| 腈类检查手套，中号，非无菌，无粉 | MedSupply Partners | KG-1101M | |
| 橄榄色/品红卡口式气体 & 蒸汽滤芯 / 颗粒物过滤器 2个装 | 3M/Fastenal | 50051138541878 | |
| 用于小鼠的聚碳酸酯 RadDisk Mini 8-75 x 4 | Braintree Scientific | IRD-P M | |
| 聚丙烯圆顶帽 - 24"，蓝色 | Uline | S-10480BLU | |
| Puritan Cary-Blair 培养基，5 mL | Fisher Scientific | 22-029-646 | |
| S、M 和 L 码蓝色硅胶双模式头戴式半面罩呼吸器 | 3M/Fastenal | 50051131370826 | |
| Sgpf 系列无菌无粉乳胶手套，CT International，厚度 = 6.5 mm，长度 = 30.5 cm（12 英寸），手套尺寸 = 8.5，手套颜色 = 白色 | Fisher Scientific | 18-999-102F | |
| 防滑鞋套 | Uline | S-25639 | |
| 手术衣，毛巾，无菌，大号，32件/箱 | 托马斯科学公司 | KIM 95111 | |
| Teklad Global 18% 蛋白质挤压成型啮齿动物饲料（可灭菌） | Inotiv | 2018SX | |
| 赛默飞世尔科技 Nalgene 耐用型矩形线性低密度聚乙烯储液罐（带盖，20 L 容量） | 赛默飞世尔科技 | 14-831-330J | |
| VERIFY 双物种自含式生物指示剂 | Steris Healthcare | S3061 | |
| WypAll L40 1⁄4 折擦拭片 | Uline | S-8490 |
参考文献
- Park, J. C., Im, S. -H. Of men in mice: the development and application of a humanized gnotobiotic mouse model for microbiome therapeutics. Exp Mol Med. 52 (9), 1383-1396 (2020).
- Li, F., et al.
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