用于将人粪便移植到无菌小鼠的生物排外IsoPositive笼实验的准备与维护

摘要

本方案描述了在维持无菌条件下，将无菌小鼠转移并饲养于实验用单笼隔离器（隔离笼）中的最佳操作规范。同时讨论了向无菌小鼠进行粪便移植的方法，以及从这些肠道“人源化”小鼠中收集可存活细菌以用于后续应用的技术。

摘要

无菌小鼠是研究微生物在宿主健康与疾病中作用的重要研究工具，可用于评估单个微生物、特定微生物群或复杂微生物群在宿主反应中的具体作用。传统上，无菌小鼠在柔性薄膜或半刚性隔离器中繁育和饲养，其饲养与实验操作成本高昂，且需要大量经过培训的人员以及动物设施中较大的空间。IsoPositive 隔离笼系统可在独立、密封、正压的隔离笼（isocages）中对无菌小鼠进行实验操作，从而降低成本，并提高实验操作的灵活性。

本文描述了一种将无菌小鼠从繁育隔离器转移至隔离笼，并通过人类供体粪便对小鼠进行粪便移植，以建立稳定的长期肠道“人源化”小鼠模型的实验方案，可用于后续研究。文中介绍了使用隔离笼系统所需的材料和准备工作，包括使用二氧化氯化学消毒剂对笼具、耗材、设备和个人防护装备进行灭菌的方法。同时讨论了确认转移后小鼠无菌状态的方法，以及如何检测笼具系统中的污染情况。进一步阐述了饲养管理的操作流程，包括垫料、饲料和饮水供应。此外，还详细描述了制备人源粪便悬液并经灌胃接种至无菌小鼠以建立肠道人源化小鼠模型的实验步骤，以及采集粪便样本以监测小鼠肠道微生物群组成的方法。一项实验结果表明，在人类粪便移植两周后，供体微生物群可在小鼠体内实现稳定定植，从而具备后续实验应用的条件。同时，本文还介绍了将人源化小鼠粪便收集于活性保存液中的方法，以便用于进一步的功能性实验。总体而言，这些方法可实现人源化小鼠微生物群在实验用无菌隔离笼中的安全、高效建立，便于后续干预与研究。

引言

无菌小鼠是微生物组研究者工具库中的重要工具，可用于解析微生物群在宿主健康与疾病状态中的作用。无菌小鼠出生时完全无菌，并在其整个生命周期中保持无菌状态¹。通过将特定细菌菌株定植到无菌小鼠体内，可开展这些分类单元与宿主代谢、免疫或其他功能之间的因果关系研究^2,3,4,5。尤为有利的是，可通过移植来自人类供体的粪便样本，在微生物群层面实现无菌小鼠的“人源化”，并在屏障环境中饲养以防止来自小鼠源性微生物的污染¹。这一方法已在微生物组领域推动了许多重要发现，例如人类肠道微生物组对癌症免疫治疗反应的影响^6,7,8。

然而，尽管人源化无菌小鼠在微生物组研究领域对科研工作具有不可估量的价值，但该方法仍存在诸多限制，阻碍了其更广泛的应用。无菌小鼠通常在半刚性或柔性薄膜大型隔离器中繁育和维持，但功能实验需要额外搭建独立的微型隔离器，每个微型隔离器可容纳多个鼠笼，但仅能维持单一实验条件。这种微型隔离器方法显著增加了空间占用和成本，同时严重限制了单次实验中可考察的实验条件数量以及可并行开展的实验数量。一种颇具前景的解决方案是采用一种名为 ISOcage P 生物排阻系统（下文简称为 isocage 系统）的独立模块化笼具系统^9，10。isocage 系统允许在独立、密闭、正压的隔离笼中对无菌小鼠进行实验操作，使每个鼠笼之间均可设置不同的实验条件，而不再局限于每个微型隔离器仅能设置一种条件。在规范的无菌操作技术下，动物可在 isocage 中维持长达 12 周的无菌状态，或通过人类粪便移植实现人源化，进而用于任何可在无菌条件下开展的实验方法。利用 isocage 系统可并行开展多个独立实验，其空间占用和成本远低于在多个微型隔离器中分别开展实验的方式。

在柔性薄膜饲养隔离器中繁育无菌小鼠的目的是严格维持其无菌状态¹¹。用于监测无菌状态的技术包括对小鼠体表和口腔的常规拭子取样，以及无菌采集粪便样本，并通过培养和基于PCR的商业化检测试剂盒进行检测。必须对这些样本进行细菌、血清学和真菌检测，以确认其无菌状态¹¹。当无菌小鼠从饲养隔离器转移至隔离笼盒用于实验时，需对其进行拭子取样和检测，以验证转移时的无菌状态。隔离笼盒的无菌性检查通过无菌采集粪便样本进行，随后进行培养，以检测细菌、病毒和真菌污染物。从出生到实验方案结束，仔细收集并记录这些无菌性检查结果，对于验证这些小鼠的无菌状态至关重要。

隔离笼系统由独立的笼具（图1）、用于从繁育隔离器中转移动物的转运盘（图1）以及用于容纳笼具的隔离笼架（图2）组成。每个隔离笼均在供气入口处配备一个笼级高效微粒空气（HEPA）过滤器，并配有硅胶密封垫圈，闭合时可形成气密密封，确保空气中的污染物无法进入笼内（图1A）。该笼盖在倒置并置于经灭菌的生物安全柜内时，可用作无菌操作表面（图1A）。笼内设有金属丝网架，用于放置饲料和饮水瓶（图1B）。在笼内经高压灭菌的镊子用于所有需接触笼内表面的操作。笼体本身设有卡槽，可安装可拆卸的笼号卡架，以便在外部识别动物，并设有进气和出气喷嘴，用于与隔离笼架对接（图1C-E）。安全闭合夹具和笼盖上的卡扣锁可在笼具准备重新对接至笼架系统时实现密封（图1F）。建议使用的垫料为Alpha-dri，同时推荐使用可高压灭菌的环境丰富化小屋（图1F）。转运盘用于将无菌小鼠从繁育隔离器转移至隔离笼，其配备一个可旋转的隔间盖，盖上设有三角形开口，便于对动物进行操作（图1G-H）。转运盘有小号（直径21.6 cm）和大号（直径28 cm）两种规格，均可容纳八只小鼠。使用经高压灭菌的胶带在转运盘的周缘和通气孔处形成气密密封，此操作需在用消毒剂浸泡前完成，并将盘置于经消毒剂浸湿的袋中进行运输（图1I）。笼架系统本身配备显示屏，用于监控风机运行状态、笼架级HEPA过滤器状态以及应急蓄电池电源，这些均为系统内置功能（图2A）。封闭式Magnehelic压力计显示笼系统所维持的正压，自动可视对接指示器显示笼具的对接状态（黄色标签伸出表示无笼具对接或对接失败）（图2B-D）。操作隔离笼时还需配备标准认证的生物安全柜。

本文所述方案介绍了在无菌条件下将无菌小鼠从繁育隔离器成功转移至隔离笼，同时维持其无菌状态的正确方法，以及利用人类供体粪便悬液对无菌小鼠进行人源化处理，并从隔离笼饲养的小鼠中收集粪便样本，用于确认无菌状态或保存活性以进行后续功能研究。在本示例中，无菌小鼠被接种来自接受肺癌免疫治疗的人类供体的混合粪便样本，并根据治疗反应将供体分为应答者与非应答者。在此情况下，免疫治疗的应答表型通过肠道微生物群的人源化转移至受体小鼠，随后可进一步向这些小鼠接种肿瘤细胞并给予免疫治疗。该人类粪便悬液制备方案可轻松适用于任何人类供体粪便样本或研究者希望建立的任何疾病临床前模型。利用本方案，可将任意人类供体粪便微生物群成功移植至无菌宿主小鼠体内，从而为进一步探究微生物群在健康与疾病中的作用提供可能。

图1：隔离笼具和转移盘的示意图。（A）笼盖底面的俯视图，标签标明了笼内级HEPA过滤器和硅胶垫圈密封的位置。（B）笼具内部的俯视图，标签标明了金属丝网盖、内置饮水瓶及吸管，以及用于放置可高压灭菌饲料的金属丝架位置。（C）笼具的前视图，显示用于固定笼卡的凹槽。（D）带盖完整笼具的俯视图，显示HEPA过滤器安装在进气喷嘴上的方式。（E）笼具的后视图，显示与隔离笼架系统对接的进气和出气喷嘴。（F）带盖完整笼具的侧视图，标签标明处于打开状态的安全闭合夹，每个夹子上的白色标签可将其锁定到位。笼具内部显示底部铺有Alpha-dri垫料，并建议在垫料中放置 enrichment hut（丰富化小屋）。（G）带盖转移盘的俯视图。（H）转移盘内部的俯视图，显示带有三角形开口的可旋转隔间盖，便于操作动物。（I）完全组装好的转移盘的侧视图，显示已粘贴高压灭菌胶带的位置，该胶带在从繁殖隔离器转移到隔离笼具过程中形成气密密封。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：隔离笼架系统的示意图。（A）完整的隔离笼架，笼盒已对接，并贴有标签，标明用于显示风机状态、高效过滤器状态和应急电池的监测屏幕。机架左下侧为机架级高效过滤器的插槽。（B）封闭式的曼尼霍尔德计，显示机架所维持的正压。（C）一个已对接的隔离笼，无可见的黄色对接指示，表明机架与送风喷嘴之间连接成功。（D）机架中的一个空插槽，可见自动可视对接指示器，表明该位置无笼盒，且送风喷嘴未与任何隔离笼连接。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有动物实验均经佛罗里达大学（UF）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并在UF动物照护设施中进行（IACUC方案编号：IACUC202300000005）。无菌野生型（GF WT；C57BL/6）小鼠群体由UF动物照护服务部无菌部门在隔离器中繁育并维持。将不同性别的GF WT小鼠从繁殖用隔离器中转移至ISOcage P生物排外系统，以便进行微生物操控。

人类粪便样本来自一项前瞻性观察性研究，该研究收集了接受免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的患者纵向粪便样本¹²。研究经 Advarra IRB（MCC#18611，Pro00017235）批准后，已从患者处获得知情同意。受试者接收并完成了一套液体牙科转运培养基（LDTM）粪便采集套件，该套件旨在为功能研究保存细菌活性。疗效评估将 n=4 份样本定义为应答者（R），n=6 份样本定义为无应答者（NR）。将经 LDTM 保存的均质化患者样本分别解冻后，逐一置于厌氧环境中不超过 90 秒，并按应答表型合并样本（R：n = 4，NR：n = 6）。合并后的样本随后被分装并储存在 -80 °C，用于本实验方案。为测定供体粪便的厌氧菌落形成单位（CFU）数量，将每位受试者的粪便样本进行连续梯度稀释至 1 × 10^-5，每个稀释度取 10 µL，分别在厌氧脑心浸液（BHI）和Luria Bertani（LB）琼脂平板上双份涂布，估算每克粪便的CFU数量。根据每位受试者相等的CFU数量，合并制备粪便接种物样本，用于灌胃小鼠。

1. 笼具的准备与灭菌

1. 隔离笼准备
   1. 用约500 mL的2018SX饲料或任何所需强化型可高压灭菌饲料预填充笼具，并在底部铺上ALPHA-dri垫料。在笼内垫料中放置一个可高压灭菌的丰富化小屋。将一个空的、未密封的水瓶、喷嘴以及长柄宽头镊子放置在金属网架顶部。
   2. 每个高压灭菌批次中，选择一个笼具，在其饲料内放入一个双物种生物指示剂。在每个笼具的外部贴上一条化学整合指示条。
   3. 在121 °C、至少15 PSI条件下，采用真空循环对笼具进行45分钟高压灭菌，随后进行30分钟干燥。使用国际标准化组织（ISO）认证的去污架对笼具进行灭菌，该架子可使笼具保持密封状态，同时允许蒸汽穿过内部的HEPA过滤器，从而在笼具打开前维持其无菌环境。
   4. 用饮用水灌满1 L的瓶子，用橡胶塞密封，并在瓶身表面贴上一条化学整合指示条。采用液体慢速排气程序，在121 °C、至少15 PSI条件下高压灭菌45分钟。
   5. 目视检查每个笼具上附着的化学整合指示条，以立即确认高压灭菌参数是否符合要求。
      注：生物指示剂必须在无菌条件下首次打开隔离笼时取出。将生物指示剂在37 °C下培养24小时，并观察颜色变化。若溶液从原始的蓝色/紫色澄清状态明显变为黄色或浑浊液体，则表明存在微生物生长。若指示剂仍保持澄清且呈蓝色/紫色，则表明该批次高压灭菌过程中笼具内部完全无菌。

2. 二氧化氯消毒剂的制备

警告：二氧化氯消毒剂一旦激活即具有极强腐蚀性。激活后的二氧化氯消毒剂自激活剂与基础液混合起24小时内失效。二氧化氯消毒剂会释放气体，可能刺激黏膜表面，并与皮肤接触时引起刺激。确保消毒剂配制场所配备水槽并具有良好的通风条件。使用二氧化氯消毒剂时，除动物饲养设施要求的个人防护装备（PPE）外，还应佩戴安全护目镜、呼吸器和耐化学腐蚀手套。

1. 混合基础液与活化剂
   1. 配制标准6 L体积的二氧化氯消毒剂时，先用1 L量筒量取1 L二氧化氯消毒剂基础液，倒入20 L容量的浸渍槽中。
   2. 使用同一量筒量取4 L自来水，并倒入浸渍槽中。
   3. 将用于基础液和水的量筒放置一旁；另取一个新量筒量取1 L二氧化氯消毒剂活化剂，并将其倒入浸渍槽中。
   4. 活化剂加入浸渍槽后，使用该量筒搅拌槽内液体，使其充分混合。
2. 活化过程
   1. 将浸渍槽盖上盖子，并贴上标签，注明为二氧化氯消毒剂，同时标注加入活化剂的日期、时间以及配制人员姓名。如需要，可用混合消毒剂的量筒将1 L消毒剂转移至喷雾瓶中。
   2. 将浸渍槽及喷雾瓶转移至动物饲养间，放置于Isocage架及鼠笼所在区域。活化后的二氧化氯消毒剂必须静置至少20分钟，以确保完全活化后方可使用。
      注意：若需处理大量鼠笼（>9个），可一次性在浸渍槽中配制最多12 L消毒剂。若仅处理1个鼠笼或遇紧急情况，可在较小容器中配制1.2 L二氧化氯消毒剂，随后分装至两个1 L喷雾瓶中。建议至少在预计转移无菌小鼠前1小时完成消毒剂的配制。

3. 灭菌

1. 穿戴个人防护装备（PPE）
   1. 作为主要笼具操作人员，应佩戴安全护目镜、呼吸器、耐化学腐蚀手套、无菌手术服、蓬松帽、袖套和鞋套。在PPE内层穿着刷手服，因为任何织物与二氧化氯消毒剂接触都会导致严重染色。
   2. 建议为主操作人员配备一名助手。助手应穿戴与主操作人员相同的个人防护装备，但可穿非无菌手术服。
2. 准备生物安全柜
   1. 将10片擦拭巾放入二氧化氯消毒剂浸渍槽中，并确保其完全浸透。
   2. 将浸透的擦拭巾移入生物安全柜内，按从后至前的顺序润湿柜内所有表面：工作台面、左侧、罩内后部、右侧及前部内侧玻璃。通过在未受保护的生物安全柜表面挤压擦拭巾释放液体，进行非接触式润湿，避免直接接触。
   3. 完成一轮清洁后，将擦拭巾放回二氧化氯消毒剂浸渍槽中继续浸泡。
3. 准备隔离笼具（isocage）
   1. 使用量筒向一个大塑料袋中加入至少100 mL二氧化氯消毒剂，充分摇晃袋子以确保内壁全部润湿。将袋子平放在任意平面上。
   2. 从架子上取下一个隔离笼具，放入二氧化氯消毒剂浸渍槽中，确保笼具各表面均接触液体。使用槽中已浸透的擦拭巾进一步擦洗笼具表面，以保证液体完全覆盖。
   3. 浸泡完成后，请助手打开已浸透的塑料袋，将笼具放入袋中，并立即由助手封口。使用喷雾瓶向袋口喷洒二氧化氯消毒剂。对每个待用笼具均执行此操作；单个36" 32" 48"的袋子最多可容纳四个笼具。
   4. 根据需要将足够数量的已灭菌1 L水瓶（每2个笼具配1 L水）浸入二氧化氯消毒剂浸渍槽中，随后将其放入另一个已浸透的塑料袋内。当所有物品均装入袋中后，封口并用喷雾瓶向袋口喷洒二氧化氯消毒剂。
   5. 所有笼具和物品封装完毕后，将耐化学腐蚀手套尽可能深入地浸入二氧化氯消毒剂中（避免液体接触袋口区域）。
4. 20分钟消毒期
   1. 完全灭菌需至少20分钟的液体接触时间。一旦最后一件物品完成消毒且塑料浸泡袋已封闭，助手应立即设置20分钟计时器。计时开始后，确保耐化学腐蚀手套不再接触任何未经二氧化氯消毒剂润湿的表面。
   2. 重复执行生物安全柜灭菌程序（步骤3.2），直至计时器显示20分钟结束。
   3. 助手应频繁摇晃浸泡袋外表面，以确保袋内笼具和水瓶表面持续接触消毒液。
   4. 20分钟结束后，请助手打开已浸透的塑料袋，取出已灭菌的笼具和水瓶，操作时仅接触袋子外表面。
   5. 使用已灭菌的耐化学腐蚀手套，将每个笼具和水瓶转移至已灭菌的生物安全柜中。若笼具数量过多无法全部放入生物安全柜，可将剩余笼具保留在塑料袋中；只要每次打开前后均保持袋口封闭并用二氧化氯消毒剂润湿，即可维持无菌状态。

4. 无菌小鼠转移

1. 准备隔离笼
   1. 打开密封的隔离笼时，抬起笼盖两侧夹子上的白色标签，然后将每个夹子横向拉出。必须使笼盖完全脱离笼体底部，才能将盖子从笼子上取下。将笼盖倒置放在笼子左侧，用作无菌工作台。
      注意：除了使用笼盖或灭菌器械袋内部作为无菌工作面外，也可使用灭菌布单，其提供更大的表面积，并可在操作失误时防止对笼盖造成意外污染。
   2. 使用位于笼内金属网架上方的无菌镊子，取出空的水瓶并将其放置在笼盖内侧。打开1 L水瓶，移除橡胶密封圈，将水倒入水瓶中直至注满。用镊子夹取喷嘴安装到水瓶上，并用力按压以确保密封。
   3. 使用无菌镊子将金属网架提起并向后移动数英寸，以便在笼底留出开口。将无菌镊子放置在金属网架上，确保镊子手柄不接触笼体任何表面。
2. 转移盘的使用
   注意：无菌动物饲养隔离器的日常护理与维护由经过专门培训的无菌操作人员负责。鉴于打开繁殖用隔离器存在较高风险，转移盘的灭菌、准备以及无菌小鼠从隔离器向隔离笼的转移均由这些专业人员完成。简要描述该过程如下：转移盘置于可高压灭菌的圆筒容器中进行灭菌处理，使用生物指示剂验证其无菌状态。用于密封转移盘的胶带也一同在圆筒容器内进行高压灭菌。灭菌后的容器通过转接套管连接至隔离器，随后将小鼠从笼中移至转移盘上。盖上转移盘盖后，使用经高压灭菌的胶带沿盘体边缘及通气孔进行气密性封口。密封后的转移盘立即放入隔离器的出口舱内。关闭原隔离器的舱门盖后，对外部表面彻底用消毒剂擦拭，并将其置入浸有消毒剂的袋子中，监测20分钟以确保完全去污。之后，无菌繁殖工作人员将转移盘交付给实验人员。转移盘密封后，小鼠在其中停留时间不得超过30分钟，因此必须确保本方案中所有前期步骤在转移盘到达前已充分完成。
   1. 收到转移盘后，助手应手持并部分揭开塑料外包装，使转移盘浸润面暴露出来，但助手不得触碰该表面。
   2. 收到转移盘后，助手应手持并部分揭开塑料外包装，使转移盘浸润面暴露出来，但助手不得触碰该表面。
   3. 佩戴浸有二氧化氯消毒剂的耐化学手套，小心地将转移盘从塑料包装中取出，注意避免触碰未被消毒剂浸润的任何表面。随后，将转移盘放置于已灭菌的生物安全柜平坦表面上。
   4. 打开转移盘时，撕下密封盘周缘的胶带并丢弃至生物安全柜外。取下转移盘盖并丢弃至生物安全柜外。
   5. 转移盘内部设有一个可旋转的隔间盖，其上有一个开口。使用先前放置在笼内金属网架上的无菌镊子操作此隔间盖，将其开口旋转至需要转移的小鼠位置。
3. 将小鼠从转移盘转移至隔离笼
   1. 使用镊子通过塑料盘盖上的开口夹住小鼠尾根部，提起并将其经由金属网架与笼体之间的空隙转移至隔离笼中。对所有需转入该笼的小鼠重复此操作。
   2. 所有小鼠转移完毕后，使用镊子将金属网架复位。然后用镊子提起笼盖并重新盖回笼体上方。
   3. 逐个抬起笼盖上的夹子，小心地将其压回笼体两侧，随后按下白色标签以密封笼盖。
   4. 笼子密封完成后，助手应使用二氧化氯消毒剂喷洒笼架对接口上的每个喷嘴。然后将笼子从操作台中取出并交给助手，由其将笼子对接至笼架上。
   5. 对转移盘中的每只小鼠重复上述步骤。
4. 清洁生物安全柜
   1. 完成所有小鼠向隔离笼的转移后，清除操作台内所有杂物，并用浸有二氧化氯消毒剂的擦拭巾彻底擦拭整个台面。
   2. 使用异丙醇擦拭操作台面，以去除残留的二氧化氯消毒剂。操作台工作面下方区域在消毒过程中会积聚大量液体消毒剂，需先用干擦拭巾吸除，再用异丙醇擦拭干净。
   3. 在激活后24小时，通过水槽下水道处理液态二氧化氯消毒剂；被消毒剂污染的固体材料按普通废弃物处理。
      注意：转移至隔离笼条件下的无菌小鼠需留置1周以适应新环境，之后方可进行任何干预措施。此举可减少动物应激反应，避免干扰实验结果。在为期1周的适应期结束时，按第6步所述收集粪便样本，以确认其无菌状态，再实施后续干预。

5. 将人粪便悬液经口灌胃至无菌小鼠

1. 准备高压灭菌的灌胃用品
   1. 在进行灌胃操作前一天，将口服灌胃针放入自封式灭菌袋中（每只小鼠1支），并将无菌1 mL注射器放入自封式灭菌袋中（每只小鼠1支）。将上述物品连同600 mL聚丙烯烧杯（每只小鼠1个）和一对长镊子一起放入耐高压灭菌袋中，并通过高压灭菌器进行灭菌处理。
   2. 从高压灭菌器中取出灭菌袋后，立即用包装胶带密封，并存放至次日使用。
2. 制备人粪便悬液
   1. 在灌胃当天，将保存于–80 °C冰箱中、已在厌氧保存液（本实验中为液体牙科转运培养基）中均质化并储存的人类粪便样本转移至厌氧培养箱。在10 mL锥形离心管中，用无菌厌氧生理盐水溶液以约1:10的比例稀释均质后的粪便材料。
   2. 用封口膜密封含有粪便悬液的离心管，通过涡旋振荡器混匀，随后在200 g条件下离心5分钟，以沉淀颗粒物。
   3. 将离心管重新放回厌氧培养箱，将上清液转移至另一支10 mL锥形离心管中。用封口膜密封含有粪便上清液的离心管，取出厌氧培养箱后放入次级防漏容器中。将该容器连同已高压灭菌的灌胃用品袋一同运送至动物饲养区域。
      注：为报告目的，必须估算拟用于灌胃的人类粪便样本的总CFU/mL。目前尚不明确确保充分定植所需的最低CFU载量，但较高的CFU值有助于提高供体粪便的定植效率¹³。若人粪便样本的CFU载量导致定植率较低，应重新收集人粪便标本。使用活细胞保存培养基可提高粪便标本中CFU的回收率。为测定供体粪便的厌氧/需氧菌落形成单位（CFU），将样本连续稀释至1 × 10^-5，并在需氧和厌氧BHI及LB琼脂平板上，每个稀释度点样10 µL，设两个重复。培养24小时（需氧）和48小时（厌氧）后，计算每克粪便的CFU数量。
3. 准备隔离笼
   1. 重复步骤2和3，唯一不同之处在于这些笼子中已饲养有小鼠，操作时需注意在移出笼架后的30分钟内，将每个隔离笼放入已灭菌的超净台中，并打开笼盖通风，以保证小鼠的空气流通。
   2. 采用二氧化氯消毒剂饱和法对步骤5.1和5.2中的高压灭菌灌胃用品袋和人粪便悬液管进行表面灭菌处理，方法与水瓶相同（即将其浸入消毒剂中，然后放入经消毒剂浸润的袋子中）。
   3. 完成20分钟灭菌后，将隔离笼和口服灌胃用品转移至生物安全柜中。通过将袋体抵住袋内长镊子的方式刺破高压灭菌用品袋，取出所需物品，并将空袋丢弃在超净台外。
4. 灌胃操作
   1. 更换为新的无菌外科手术服和无菌外科手套，取代原有的耐化学腐蚀手套，以防止残留的二氧化氯消毒剂接触小鼠。如有需要，可由助手协助完成此过程。
   2. 打开每个灭菌袋，取出灌胃针，并利用灭菌袋内部作为干燥、无菌的放置表面。将灌胃针连接至各注射器，打开粪便悬液管，吸取200 µL粪便悬液至每支注射器中。
   3. 使用镊子夹住笼中单只小鼠尾部基部，将其置于金属网格板上。轻柔地通过抓握背部皮肤固定小鼠，保持其直立状态，插入灌胃针后缓慢注入粪便悬液，随后立即拔出针头。
   4. 将小鼠直接放入一个已灭菌的观察杯中进行观察。对笼内每只小鼠重复上述操作。所有小鼠完成灌胃后，使用镊子将每只小鼠放回笼内垫料中，并按照步骤4.3.2–4.3.4所述方法密封笼子。
      注：若使用两种或以上不同的人粪便悬液，需对生物安全柜及相关笼具和材料重新进行灭菌处理。若存在仍需维持无菌状态的小鼠组，建议先对这些小鼠进行对照灌胃处理，再处理其他组别。
   5. 按照步骤4.4的程序处理二氧化氯消毒剂及被消毒剂浸润的材料。所有被人类粪便悬液污染的材料均应视为生物医学废弃物，并依据环境健康与安全规程进行处置。

6. 用于活性保存的人源化小鼠粪便采集

1. 准备高压灭菌用品
   1. 将短款宽头镊子（每只小鼠1把）放入自封式灭菌袋中，另将600 mL聚丙烯烧杯（每只小鼠1个）和一把长镊子放入耐高压灭菌袋中，并于粪便采集前1天通过高压灭菌器进行灭菌处理。
   2. 从高压灭菌器中取出灭菌袋后立即用包装胶带密封，并存放至次日使用。
2. 保存液管的制备
   1. 选择一种厌氧活性保存液（此处使用Cary Blair保存液）。在生物安全柜中，将1 mL保存液分装至无菌的2 mL螺口离心管中。建议粪便与保存液的最佳比例为1:10，以实现最佳保存效果。
   2. 使用永久性记号笔预先标记每根离心管，但需注意，暴露于二氧化氯消毒剂可能导致永久性记号笔的标签从塑料表面脱落。另一种方法是暂不标记离心管，由助手在采集后立即标记，再进行冷冻保存。
   3. 将这些离心管放入标准聚丙烯试管架中，以便管子能够直立存放，同时仍可通过与二氧化氯消毒剂接触实现灭菌。
3. 笼具和生物安全柜的灭菌
   1. 重复步骤2和3，对独立通气笼具（isocages）和生物安全柜进行灭菌。注意，在取出试管架后的30分钟内，应将每个独立通气笼具放入已灭菌的生物安全柜中，并打开盖子通风，以保证小鼠的空气流通。
   2. 此外，使用二氧化氯消毒剂饱和法对已高压灭菌的用品袋及装有预处理离心管的试管架进行灭菌，并将其放入盛有笼具的浸湿塑料袋中。目标是使所有离心管表面及试管架本身均与液体充分接触。
4. 粪便样本的采集与保存
   1. 在完成20分钟灭菌程序后，将独立通气笼具、高压灭菌用品及试管架转移至生物安全柜中。通过将灭菌袋抵住袋内长镊子的方式刺破袋子，取出所需物品，并将空袋丢弃在生物安全柜外。
   2. 更换为新的无菌外科手术服和无菌外科手套，以替代耐化学腐蚀手套，防止残留的二氧化氯消毒剂接触小鼠。如有需要，可由助手协助完成此过程。
   3. 打开宽头镊子的灭菌袋，利用袋内表面作为无菌操作区域，准备宽头镊子。将试管架放置在生物安全柜的工作台面上。
   4. 使用长镊子夹住笼内单只小鼠尾部基部，将其直接转移至一个已灭菌的杯子中进行观察。对笼内每只小鼠重复此操作。
   5. 观察小鼠，直至至少排出两粒新鲜粪便颗粒。
      1. 使用宽头镊子夹取粪便颗粒，直接放入离心管中。立即拧紧螺口盖，并将管子交给助手。
      2. 由助手对离心管进行标记，并立即通过涡旋振荡使粪便样本均质化。均质后，迅速将离心管置于液氮中速冻，并长期保存于-80 °C条件下。
   6. 对笼内每只小鼠重复粪便采集过程。每只小鼠采集完成后，将其放回原笼，并将笼具重新安装至笼架上。重复步骤4.4，清洁生物安全柜并处理废弃物。

结果

将先前方案中已描述的免疫检查点抑制剂（ICI）应答者与非应答者的表型粪便样本进行混合，并通过灌胃方式给予无菌野生型（GF-WT）小鼠，每组小鼠分别饲养于3个隔离笼中（每笼1-2只，应答者组n = 6，非应答者组n = 5）。移植后，小鼠适应环境1周。随后在无菌条件下收集这些小鼠的粪便样本。接着，通过灌胃给予每只小鼠1 × 10⁷ CFU的应答者或非应答者混合人源粪便。灌胃后第1、2和4周分别收集粪便样本。由于在无菌小鼠中，粪便样本对污染物的检出率可达100%，因此无需额外检测笼垫料、饮水等其他样本¹⁴。为确认粪便移植前1周时小鼠的无菌状态，从每只小鼠采集一枚粪便颗粒，称重后立即转移至厌氧舱中。每份粪便样本用1 mL无菌厌氧磷酸盐缓冲液重悬，随后使用Pellet Pestle无线研磨电机和无菌高压灭菌的混合器进行手动匀浆。将匀浆后的粪便样本进行连续梯度稀释至1 × 10^-5，每个稀释度取10 µL，重复接种于厌氧BHI琼脂平板上。每个稀释度的样本同时从厌氧舱中取出，并在有氧条件下以相同方式接种于BHI琼脂平板。厌氧平板用Parafilm封口后置于厌...

讨论

本文所述方案提供了一种可重复且高度详细的实验方法，用于在实验用隔离笼中饲养的无菌小鼠的人源化处理。将人类供体的粪便菌群特异性移植到小鼠宿主中，对微生物组研究具有重要价值。在避免小鼠特异性共生微生物污染的情况下，研究人员能够探究定植于人体的细菌对多种健康与疾病状态的影响，或研究饮食干预、药物给药等手段对人体微生物组的作用^16,17,18。此类研究对于揭示微生物组组成在健康与疾病状态中的因果关系至关重要。本方案还包括在保存介质中收集人源化小鼠粪便样本，以便后续恢复具有活性的微生物并用于进一步实验。本文未详述的另一应用是单菌定植（monoassociation）或使用明确定义的细菌群落（如Altered Schaedler菌群或小鼠肠道细菌集合[miBC]）进行定植^13,19,20

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL BD Slip Tip 注射器，无菌，一次性使用	Fisher Scientific	309659
2.0 mL 螺口管，无滚花，带裙边，天然色，电子束灭菌，带可拆卸管盖	Fisher Scientific	14-755-228
36 x 32 x 48" 3 密耳带褶聚乙烯袋	Uline	S-13455
5 加仑装 Exspor 二氧化氯消毒剂活化剂	Ecolab	6301680
5 加仑装 Exspor 二氧化氯消毒剂原液	Ecolab	6301194
600 mL 聚丙烯烧杯	Fisher Scientific	S01914
ALPHA-dri 垫料	谢泼德特种纸业
厌氧培养箱	Coy 实验室产品	B型
II级生物安全柜	Nuaire
认证 IsoCage 可高压灭菌 HEPA 过滤器 XT 极端温度	Tecniplast	1245ISOFHXT
Clear Lens LPX IQuity 安全护目镜	Fastenal	922205455
杜邦 Tyvek 袖套 - 18"	Uline	S-13893E
DWK生命科学DURAN 45毫米按压式天然橡胶盖	Fisher Scientific	01-258-107	1 L 高压灭菌瓶用橡胶瓶塞
Dynalon Quick Mist HDPE 喷雾瓶	Fisher Scientific	03-438-12B
Fisherbrand 聚丙烯量筒	Fisher Scientific	03-007-44
Fisherbran 解剖圆头镊	Fisher Scientific	08-887
Fisherbrand 即用型密封灭菌袋	Fisher Scientific	01-812-51
Fisherbrand 直头宽尖强头通用镊子	Fisher Scientific	16-100-107
Fisherbrand 无铅高压灭菌指示胶带	Fisher Scientific	15-901-110
灌胃针，可重复使用的不锈钢材质。直型。22号针头，尖端直径1.25 mm，长度38 mm或1.5英寸（一打）	布雷因特里科学公司	N-PK 020
H-B Instrument Durac 计时器	Fisher Scientific	13-202-015
IsoPositive 笼架系统（即 isocages）	Tecniplast	ISO30P	30个笼子（6宽×5高），单面
耐腈类化学品手套，尺码 S (7)、M (8) 或 L (9)，共 18 副” 长，22 密耳，Ansell	格雷格纳	4T426
腈类检查手套，中号，非无菌，无粉	MedSupply Partners	KG-1101M
橄榄色/品红卡口式气体 & 蒸汽滤芯 / 颗粒物过滤器 2个装	3M/Fastenal	50051138541878
用于小鼠的聚碳酸酯 RadDisk Mini 8-75 x 4	Braintree Scientific	IRD-P M
聚丙烯圆顶帽 - 24"，蓝色	Uline	S-10480BLU
Puritan Cary-Blair 培养基，5 mL	Fisher Scientific	22-029-646
S、M 和 L 码蓝色硅胶双模式头戴式半面罩呼吸器	3M/Fastenal	50051131370826
Sgpf 系列无菌无粉乳胶手套，CT International，厚度 = 6.5 mm，长度 = 30.5 cm（12 英寸），手套尺寸 = 8.5，手套颜色 = 白色	Fisher Scientific	18-999-102F
防滑鞋套	Uline	S-25639
手术衣，毛巾，无菌，大号，32件/箱	托马斯科学公司	KIM 95111
Teklad Global 18% 蛋白质挤压成型啮齿动物饲料（可灭菌）	Inotiv	2018SX
赛默飞世尔科技 Nalgene 耐用型矩形线性低密度聚乙烯储液罐（带盖，20 L 容量）	赛默飞世尔科技	14-831-330J
VERIFY 双物种自含式生物指示剂	Steris Healthcare	S3061
WypAll L40 1⁄4 折擦拭片	Uline	S-8490