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方法文章

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

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DOI：

10.3791/68032

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2025年5月2日

 ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy Center, Beijing Municipal Geriatric Medical Research Center, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, and Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases, Ministry of Education, 3The Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University

本文内容

摘要

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。

摘要

将仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）与基于干细胞的疗法相结合，为实现精确的神经元调控提供了一种先进的策略。在此研究中，我们利用CRISPR技术改造的人类重编程干细胞，使其表达兴奋性（hM3Dq）或抑制性（hM4Di）DREADD受体，以评估在帕金森病（PD）小鼠模型中移植的多巴胺能前体细胞的功能整合与调控能力。关键步骤包括构建非融合型DREADD表达干细胞系，将其分化为中脑多巴胺能前体细胞，并将这些细胞移植至6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁小鼠的纹状体中。我们通过行为学评估和电生理记录分析移植细胞的作用效果。行为学测试（如圆筒实验）显示，在给予氯氮平-N-氧化物（CNO）后，运动功能出现显著调控：激活hM4Di可减少对侧前肢运动，而激活hM3Dq则与运动行为增强相关。电生理记录揭示了不同的突触反应：hM4Di激活使自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的事件间歇延长、峰值幅度降低；而hM3Dq激活则使事件间歇缩短、峰值幅度升高，反映出兴奋性信号增强。综上所述，结合行为学与电生理评估，验证了经化学重编程的工程化干细胞能够精确地整合入宿主神经回路并发挥功能。

引言

仅由设计药物激活的设计受体（DREADD）是一类经过改造的G蛋白偶联受体，可通过原本无活性的合成配体进行选择性激活1。化学遗传学方法通过实现对特定脑区或细胞类型的精确激活或抑制，使研究人员能够高精度地研究神经回路的连接性，并加深了我们对细胞功能在体内和体外活动机制的理解，已成为神经科学领域的一项重要工具2,3。

基于干细胞的治疗为神经退行性疾病的治疗提供了一种前景广阔的策略。移植物细胞的疗效依赖于其在宿主组织中的适当整合、存活以及功能上的贡献。细胞活动若不受控制，可能导致包括肿瘤发生在内的不良后果4，因此需要在移植后对这些细胞进行精确调控。利用DREADD技术对人类重编程干细胞及其衍生神经元进行改造，可通过给予设计药物CNO实现对神经元活动的精确控制2,5。在帕金森病（PD）研究中，由于该疾病以多巴胺能神经元的丧失为特征，调控干细胞来源的多巴胺能神经元的活动对于在啮齿类动物模型中研究其突触输入和投射模式至关重要6,7,8,9,10。将兴奋性受体hM3Dq和抑制性受体hM4Di引入这些模型，可实现对神经元活动的精准调节11,12。

动物行为学评估与电生理记录相结合，可对化学遗传学调控对移植细胞的影响进行全面评价 体内13行为学评估，包括阿扑吗啡诱导的旋转实验、圆筒实验和转棒实验，可评估运动协调性，并为帕金森病（PD）实验模型相关的运动功能变化提供见解。14电生理学技术（如膜片钳记录）能够实时监测突触反应和动作电位，从而全面揭示移植细胞如何整合到现有神经网络中的过程。15通过将行为学评估与电生理学评价相结合，我们可以研究化学遗传学调控如何影响这些细胞在宿主神经环路中的整合及其功能。16初步研究结果表明，CNO 给药可有效调节移植细胞中的神经元活性，从而在动物模型中改善功能学结果。

在本实验方案中，利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术，对人类重编程干细胞进行基因改造，使其表达 hM3Dq 或 hM4Di 受体。将经修饰的重编程干细胞分化为中脑多巴胺能前体细胞后，将其移植到帕金森病（PD）小鼠模型中，通过行为学评估和电生理记录，评估这些细胞在宿主神经回路中的整合能力与功能调控作用。

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方案

所有动物实验均按照北京实验动物科学协会和美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）颁布的《实验动物护理与使用指南》进行。人外周血单个核细胞（PBMCs）来自一位健康供体，已获得书面知情同意，具体方法见先前研究17。

1. 构建非融合型 DREADD 干细胞系

  1. 构建DREADD供体质粒。
    注意：酶切位点应根据载体序列设计。片段应通过合成并扩增，两端设计20-30 bp与相邻片段末端匹配的重叠序列，以提高组装效率。
    1. 设计并合成T2A-ZsGreen片段（片段I）。
    2. 使用PCR从原始质粒中扩增hM3Dq/hM4Di-T2A片段（片段II）。设置PCR反应体系（总体积50 µL），包含1× PCR缓冲液、每种dNTP混合物200 µM、正向和反向引物各0.5 µM、质粒DNA模板10-50 ng，以及1.25 U高保真DNA聚合酶。进行如下热循环程序：98 °C预变性2.75分钟以充分解链模板；32个扩增循环，每个循环包括98 °C变性15秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸60秒；最后72 °C延伸7分钟。
    3. 使用适当的限制性内切酶对载体质粒进行消化，获得线性化载体。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所有片段，并使用分光光度计定量。
      注意：此处原始质粒使用MluI和SalI进行消化。
  2. 将50-100 ng线性化载体、片段I和片段II按1:3:3的摩尔比与2×克隆混合液轻柔混匀。在55 °C孵育1小时，以通过Gibson组装实现同源重组。
  3. 将靶向AAVS1位点的引导RNA插入pX458载体的BbsI位点。
    注意：使用Sanger测序对所有构建的质粒进行序列验证。
  4. 将重编程干细胞维持在培养基中，目标细胞密度为2-5 × 106 个细胞/mL。
    注意：本实验所用的重编程干细胞系由人外周血单个核细胞（PBMCs）诱导而来，具体方法见先前研究17。监测细胞健康状态至关重要，因为细胞状态显著影响电穿孔效率。参见材料表以比较不同培养基。
  5. 将2-5 × 106个细胞、每种供体质粒（hM4Di-T2A-ZsGreen或hM3Dq-T2A-ZsGreen）各2 µg，以及gRNA质粒2 µg加入100 µL电穿孔缓冲液中混匀，转移至电穿孔杯中进行电穿孔。
    注意：进行电穿孔前，确保混合物充分混匀且无气泡。根据细胞类型优化电穿孔参数以最大化转染效率，不同设备可能需要特定调整。
  6. 将核转染仪设置为B16程序，并启动电穿孔，以实现对目标诱导神经干细胞（iNSCs）的高效转染。
  7. 向6孔板的每孔加入1 mL 50 µg/mL多聚-D-赖氨酸（PDL），室温孵育至少2小时。吸除所有PDL后，向每孔加入1.5 mL 5 µg/mL层粘连蛋白，37 °C孵育2-4小时。包被后的培养板应立即使用，或于2-8 °C保存1周。
  8. 将电穿孔后的细胞转移至已包被PDL和层粘连蛋白的6孔板中。每孔接种约500,000个细胞，每孔培养体积为2 mL培养基。
  9. 电穿孔72小时后，使用流式细胞仪分选荧光阳性细胞。
    1. 将解离后的细胞重悬于DPBS中，并通过70 µm细胞筛过滤。
    2. 设置分选仪的FITC通道用于检测ZsGreen信号。以未处理的iNSCs作为阴性对照，以确定背景荧光水平。
    3. 使用100 µm喷嘴、鞘液压力20 psi校准仪器。采用四路纯度分选模式，并确认单细胞分选。
  10. 将单个ZsGreen+细胞接种于预先包被PDL和层粘连蛋白的96孔板中，每孔加入200 µL培养基以支持初始生长。在培养基中维持培养7-14天。
    注意：每日观察各孔，记录生长迹象和荧光信号，以判断是否成功整合，并标记阳性孔。
  11. 使用配备GFP滤光片组的倒置荧光显微镜分离显示荧光的单克隆。在10×放大倍数下筛选克隆。标记含有持续、均一ZsGreen信号的单克隆孔。拍摄明场和荧光图像，以记录细胞形态和荧光强度。
    注意：成像前更换新鲜培养基以降低背景荧光。排除形态不规则或存在自发荧光的克隆。
  12. 将阳性细胞在包被的48孔板中扩增，随后分为两部分，一部分用于继续培养，另一部分用于基因型鉴定。
  13. 从候选克隆中提取基因组DNA。使用两对引物配制PCR反应：一对用于确认目的基因的插入，另一对用于区分纯合子和杂合子克隆。进行如下热循环程序：95 °C预变性5分钟；38个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸45秒；最后72 °C延伸7分钟。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离。
    注意：引物信息见材料表。通过出现单一650 bp条带（引物1）确认目的基因插入。通过是否存在630 bp条带来判断：存在该条带为杂合子克隆，缺失该条带为纯合子克隆（引物2）。
  14. 将阳性细胞在包被的6孔板中进一步扩增。
  15. 将细胞消化后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，250 × g离心3分钟。以每管2.5 × 106个细胞的密度，用含10% DMSO的冻存液冷冻保存细胞。

2. 将DREADD干细胞来源的前体细胞移植到帕金森病模型小鼠中

  1. 手术前30分钟，对免疫缺陷小鼠腹腔注射去甲替林（浓度为5 mg/mL，剂量为10 mg/kg）。使用2%异氟烷对小鼠进行麻醉。
  2. 对右侧纹状体进行单侧立体定位注射6-羟基多巴胺（6-OHDA，5 µg/µL）3 µL。靶向坐标如下：前后位 = 0.5 mm，外侧位 = 2.1 mm，垂直位 = -3.2 mm。
    注意：6-OHDA应溶于含0.2%抗坏血酸的生理盐水中。确保精确定位，以尽量减少损伤程度的变异性。
    警告：6-OHDA具有细胞毒性，可产生活性氧，诱导细胞应激。操作时需谨慎。
  3. 术后4周，腹腔注射阿扑吗啡（1 mg/kg，0.5 mg/mL溶于生理盐水）以验证损伤效果。选择在30分钟观察期内出现超过100次对侧旋转的小鼠用于后续实验。
    注意：阿扑吗啡是一种多巴胺受体激动剂，可直接激活去神经支配纹状体中超敏的突触后受体，导致双侧黑质-纹状体环路活动失衡。阿扑吗啡诱导的旋转行为可用于评估6-OHDA所致单侧多巴胺能损伤的严重程度。
  4. 将细胞接种并培养于包被的六孔板中（每孔150,000个细胞）。在第一阶段分化培养基中孵育10天，每2天更换一次培养基。第11天起转换至第二阶段分化培养基，并继续孵育至第13天，每天更换培养基。
    注意：参见材料表中关于分化培养基的比较。
  5. 在分化第10天和第13天收集细胞，按1:7的比例混合。将混合细胞悬浮于移植缓冲液中，浓度为100,000个细胞/µL。
    注意：参见材料表中关于移植缓冲液的比较。
  6. 将制备好的细胞悬液总量4 µL，通过立体定位注射至帕金森病（PD）小鼠脑内。
  7. 在细胞移植后的不同时间点进行圆筒实验。将一个玻璃烧杯（直径：20 cm，高度：30 cm）置于平坦、无反光的表面上。在圆筒正上方放置顶部摄像机，以完整捕捉其直径范围。
    注意：用黑色帘布包围圆筒，以消除外部视觉刺激。
  8. 将每只小鼠置于圆筒中心，并开始同步视频记录（每次3分钟）。实验结束后，将小鼠放回其饲养笼。
    注意：实验前让小鼠在光照条件下适应测试房间30分钟。每次实验之间用70%乙醇清洁圆筒，以消除嗅觉线索。
  9. 评估小鼠3分钟内的上肢运动能力。计算受损前肢接触筒壁的次数占双侧前肢总接触次数的比例。
  10. 通过腹腔注射给予生理盐水或CNO（剂量为1.2 mg/kg）。在给予CNO后进行圆筒实验，以评估帕金森病小鼠模型的行为调节情况。
    注意：评估前应给予约40分钟的恢复期。

3. 化学遗传学调控细胞的体内电生理特征分析

  1. 通过腹腔注射 250 mg/kg 戊巴比妥麻醉小鼠。取出脑组织并立即置于冰上预冷的蔗糖基人工脑脊液（s-ACSF）中，以维持细胞完整性。使用振动切片机将脑组织切成 300–400 µm 厚的切片。
    注意：操作过程应迅速，以保持脑组织处于低温状态，从而保护细胞功能。有关用于新鲜脑切片制备的 s-ACSF，请参见材料表。
  2. 将样本转移至含有经 95% O2 和 5% CO2 平衡的 ACSF 的孵育槽中，温度维持在 34 °C，并确保整个实验过程中保持该温度。
    注意：有关 ACSF 的组成，请参见材料表。
  3. 用冰冷新鲜的细胞内液填充玻璃移液管，电极电阻应控制在 7 至 10 MΩ 之间。
    注意：细胞内液的配方请参见材料表。玻璃移液管由玻璃毛细管经微电极拉制仪拉制而成18。实验开始前应检查玻璃移液管是否存在泄漏，并确保其尖端足够锐利以穿透细胞膜。移液管制备应迅速完成，以尽量减少细胞内液的温度波动。
  4. 将脑片置于浸没式记录槽中，以 34 °C、持续通氧的 ACSF 以 2 mL/min 的流速进行灌流。在红外差分干涉显微镜下，使用电动显微操作器定位移液管。对移植物区域内的神经元施加轻柔负压（电阻 > 1 GΩ），建立全细胞记录模式。使用膜片钳放大器将细胞钳制在 -70 mV，以 10 kHz 采样率（2 kHz 滤波）连续记录 8 分钟的基础 sEPSCs，并持续监测接入电阻（目标值：<20 MΩ；若接入电阻 >25 MΩ 或波动幅度超过 >10%，则舍弃该记录）。
    注意：施加负压时应使用适当压力，避免细胞发生不期望的位移或破裂，并仔细调整移液管位置以获得良好的封接。若封接质量不佳，应弃用该移液管并重新尝试。
  5. 完成基础记录后，立即向记录槽中加入 50 µM CNO，并继续记录 16 分钟，观察 sEPSC 频率或振幅的变化。
  6. 通过将含 CNO 的溶液更换为新鲜 ACSF 进行洗脱，以有效清除记录槽中的 CNO。继续记录实验剩余时间的数据，以评估突触活动是否恢复。

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结果

图1展示了该方法学的关键步骤，即利用表达兴奋性（hM3Dq）或抑制性（hM4Di）DREADD受体的工程化人重编程干细胞，在帕金森病（PD）小鼠模型中评估所衍生的多巴胺能前体细胞的功能性整合与调控。图2概述了通过CRISPR/Cas9介导的基因敲入策略，将非融合型hM4Di-T2A-ZsGreen和hM3Dq-T2A-ZsGreen构建体导入重编程干细胞，并通过基因型鉴定进行验证。

图3 表征了化学遗传学调控对移植细胞功能及突触效应的影响。我们通过行为学评估和电生理记录分析了移植的DREADD细胞的作用效果。 图3A 显示了在生理盐水、CNO及CNO洗脱后条件下，对照组、hM4Di组和hM3Dq组在圆筒实验中对侧前肢运动结果的统计分析。CNO给药后，hM4Di移植动物的对侧前肢使用减少，而hM3Dq组的运动表现较生理盐水对照组增强。

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讨论

本方案利用CRISPR技术对人类重编程干细胞进行基因改造，使其表达兴奋性hM3Dq和抑制性hM4Di受体。通过将细胞移植到帕金森病小鼠模型中，并结合行为学评估和电生理记录，评估CNO对神经元活性的调控作用。

在化学遗传重编程干细胞中生成稳定表达的非融合DREADD构建体的第一步，涉及T2A-ZsGreen双顺反子表达盒。然而，表达融合蛋白的质粒（如hM3Dq-mCherry和hM4Di-mCherry7）对此诱导性神经干细胞系无效。为克服这一问题，我们通过Gibson组装方法构建了供体质粒，具体步骤详见方案1.1–1.2。

通过向免疫缺陷小鼠的纹状体单侧立体定位注射6-OHDA建立帕金森病模型，对于实现精确的体内调控至关重要。在整个研究过程中，包括细胞移植和药物治疗阶段，部分动物可能会出现意外死亡。因此，应仔细规划初始样本量，以确保各实验组有足够的动物数量15,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到北京市自然科学基金（7242068）、国家自然科学基金（82171250）、北京市卫生健康委员会基金（PXM2020_026283_000005）以及北京市属医学研究机构科技发展项目（11000023T000002036310）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 × Rapid Taq Master MixVazymeP222-01用于基因分型分析
2×Seamless Cloning MixBiomed Gene Tech.CL117-01用于质粒构建
6-OHDASigma-AldrichH4381用于建立帕金森病小鼠模型
AAVS1-Pur-CAG-EGFPAddgene80945作为对照 
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherryAddgene80947构建 hM4Di-T2A-ZsGreen 的原始质粒
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherryAddgene80948构建 hM3Dq-T2A-ZsGreen 的原始质粒
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreenN/AN/A基于 #80947 构建的供体质粒
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreenN/AN/A基于 #80948 构建的供体质粒
AccutaseInvitrogenA11105-01用于细胞消化
AMAXA NucleofectorLonzaAAD-1001S
阿扑吗啡Sigma-AldrichA4393
人工脑脊液 (ACSF)N/AN/A125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM 葡萄糖, 以及  26 mM NaHCO3
抗坏血酸Sigma-Aldrich1043003
B-27 添加剂Gibco17504044
BDNFPeprotech450-02
cAMPSigma-AldrichD0627
CHIR99021Yeasen53003ES10
氯氮平-N-氧化物EnzoBML-NS105
DAPTSigma-AldrichD5942
去甲丙咪嗪 Sigma-AldrichD3900
D-葡萄糖Sigma-AldrichG5767
DMEM/F12Gibco11330-032
DMEM/F12Gibco11320-033
DMSOSigma-AldrichD2650
FGF8Peprotech100-25
GDNFPeprotech450-10
GlutaMaxGibco35050-061
Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS)Gibco14175095
人白血病抑制因子 (hrLIF)MilliporeLIF1010
冰冻细胞内液N/AN/A130 mM K-葡萄糖酸盐, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% 神经生物素
KnockOut 血清替代物Gibco10828028
层粘连蛋白Roche11243217001
微电极拉制仪Sutter Instrument CompanyP-1000
N-2 添加剂Thermo Fisher17502048
Neurobasal-A 培养基Gibco10888-022
非必需氨基酸 (NEAA)Gibco11140-050
PBSGibco10010023
pCLAMP 11 软件套件Molecular DevicesN/A膜片钳电生理数据采集与分析软件
第一阶段分化培养基N/AN/A96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 添加剂, 1% N-2 添加剂, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, 以及 100 ng/mL FGF8 
第二阶段分化培养基 N/AN/A96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 添加剂, 1% N-2 添加剂, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM 抗坏血酸, 以及 0.5 mM cAMP
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 (PDL)Sigma-AldrichP7886
基因分型引物N/AN/A插入正向引物：TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT；
插入反向引物：CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT；
纯合子正向引物：CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA；纯合子反向引物：GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458Addgene152199
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Yeasen53004ES50
蔗糖型人工脑脊液 (s-ACSF)234 mM 蔗糖, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM D-葡萄糖, 0.5 mM CaCl2, 以及 10 mM MgSO4
干细胞培养基N/AN/A 48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) 和 48% Neurobasal，添加 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, 以及 3 µM CHIR99021
TGF-βIIIPeprotech100-36E
移植缓冲液N/AN/A含 5 g/L D-葡萄糖、100 ng/mL BDNF、100 ng/mL GDNF 和 0.2 mM 抗坏血酸的 HBSS 缓冲液
振动切片机Leica VT1000 S
全细胞膜片钳系统Molecular Devices MultiClamp700B

参考文献

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重编程干细胞DREADD受体帕金森病模型多巴胺能前体细胞CRISPR基因编辑电生理记录行为学评估氯氮平N-氧化物膜片钳技术
化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用
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