本方案详细介绍了用于在厌氧条件下进行复杂粪便菌群连续流培养的微型生物反应器阵列的组装方法。我们还讨论了反应器的组装、接种以及取样方法，以便后续分析。
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摘要
摘要
微生物群，尤其是细菌，会对多种环境暴露因素产生响应，例如微量和宏量营养素、药理学化合物以及炎症介质，这些因素会动态改变菌群组成和微生物的代谢产物。了解生理培养条件如何影响微生物群落及其多样性，以及其代谢能力，将有助于深入认识它们对健康和疾病的影响。本文介绍了一种基于Auchtung等人发表的模板改进而来的实验方案，用于构建微型生物反应器阵列，可在精确控制的条件下（包括营养物质可利用性、温度、流速、pH值和氧气含量）培养复杂的粪便菌群、定义细菌共养群落或单一菌株。我们详细描述了微型生物反应器系统的构建过程，并介绍了对已发表方案中存在局限性的若干改进措施。我们还讨论了在厌氧条件下使用MEGA培养基（改编自Han等人）搭建微型生物反应器系统的方法，该培养基是一种营养丰富的培养基，可支持多种细菌的生长。本文进一步描述了将人源化小鼠粪便样本接种至微型生物反应器系统中的操作流程，以及在系统内建立复杂菌群培养的过程；该系统支持连续流动培养，并可通过无菌取样监测菌群组成的变化。该系统可灵活适应饮食变化及其他培养条件的调整。本文所述技术能够在动态条件下，或在排除宿主来源因素干扰的情况下，对种类多样且难培养的粪便微生物群落进行表征研究。
引言
肠道微生物群是由细菌、真菌、古菌和病毒组成的庞大微生物网络，其拥有的遗传和代谢能力远超人类宿主自身所含的基因组1。微生物组丰富的代谢能力包括：细菌对膳食营养物质加工产生的代谢物、宿主代谢物经细菌化学修饰后的产物，以及仅由微生物群独特合成的代谢物2。微生物群几乎参与宿主所有的生物学过程，同时也与炎症性肠病、癌症、代谢性疾病甚至神经系统疾病等病理状态密切相关2,3。要理解特定微生物或复杂微生物群落在健康与疾病中的作用，关键在于区分微生物群与宿主各自的贡献。实现这一目标的一种方法是使用微生物生物反应器，该装置可在动态条件下培养多种微生物群落。目前市面上已有多种商用生物反应器，可用于几乎任何目的的粪便细菌群落培养，例如大规模生物产物培养，或对特定营养因素进行精确控制以研究代谢过程。然而，这些系统成本极高，需要大量前期准备，且无法同时平行检测多种不同的实验条件。为提供一种更低成本、更灵活且可实现多条件平行实验的简化方法，本文介绍了基于Auchtung等人的研究4所改进的连续流式微型生物反应器阵列的构建与使用方案。
微型生物反应器系统的完整装置如图1A所示。该微型生物反应....
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方案
本研究中使用的粪便样本来自经佛罗里达大学（UF）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的实验，并在UF动物照护设施中进行（IACUC方案编号：IACUC202300000005）。简言之，将混合性别的无菌野生型（GF WT；C57BL/6）小鼠（由UF动物照护服务部无菌动物部在隔离器中繁育并维持）从繁殖用隔离器转移至ISOcage P 生物排外系统，以便进行微生物操作。将来自人类供体粪便的等量菌落形成单位（CFU）混合后灌胃给予小鼠。接种后两周，从小鼠无菌采集粪便样本，用于储存及本方案后续使用。
注意：此处描述的粪便样本采集和制备仅作为正确操作流程的示例，因为根据所采集样本的类型（人类、小鼠或其他动物）以及样本的储存方式，该流程可能存在显著差异。研究人员应参考相关文献，根据自身研究需求设计适合的粪便样本采集与保存方案。
1. 粪便样本的常规制备及 -80 °C 保存
- 选择一种厌氧存活保存培养基（此处使用 Cary Blair 培养基）。在生物安全柜中，将 1 mL 保存培养基分装至无菌的 2 mL 螺口管中，然后转移至厌氧培养箱。
- 在接收粪便样本前，确保所有用品（经高压灭菌的刮勺、无菌生理盐水以及含有保存培养基的螺口冻存管）已在厌氧培养箱中预还原 24 小时。
- 在生物安全柜中使用无菌 snap-cap 管、高压灭菌的粪便....
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结果
在接种人粪便悬液2周后，采集小鼠的粪便样本，并于-80 °C保存。使用连续流动的MEGA培养基建立生物反应器系统，设置两个重复的反应器孔（图3A）。根据步骤6所述方案，将小鼠粪便颗粒制备成粪便悬液，并通过进样口将应答小鼠的粪便悬液接种至两个反应器中。粪便菌群在反应器孔中于37 °C静态条件下过夜培养后，重新启动培养基流速，并持续维持6天。在恢复流速后的第1、2、3、4和6天分别采集两个反应器孔的样本，并于-80 °C保存以用于后续分析。
为评估随时间变化及不同重复反应器之间微生物群落组成差异， 100 µL 采用珠磨破碎均质化，随后进行苯酚:氯仿分离及DNeasy Blood提取每份样品中的DNA & 按照制造商的建议，如前所述进行组织试剂盒纯化9,10使用通用Illu.......
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讨论
本方案中描述的微型生物反应器系统能够实现独立粪便菌群的培养，从而进行平行实验。这种在排除宿主因素干扰的情况下研究微生物群落的能力，是理解微生物适应环境内在潜力的重要方法。如需要，该方案可轻松调整用于定义细菌群落甚至单一分离菌株的培养。本文所述的MEGA培养基是一种富含营养的厌氧液体培养基，专为培养难养厌氧微生物而设计，但培养基的选择可能是影响菌群组成最重要的因素。因此，研究者在设计实验前应仔细考虑培养基的选择。在本系统及其他系统中，已有多种其他类型的培养基成功应用，包括BRM、BDM和强化梭菌培养基4。
意义与潜在应用
微型生物反应器系统是一种独特的工具，可用于研究药物、膳食成分及其他处理方式对微生物群的影响，或反之研究微生物群对这些因素的影响。这些成分可接种于起始培养基中，或直接注入反应器孔内，随后进行代谢组学和分类学分析。一种潜在的实验应用是利用噬菌体扰动细菌群落，以确定其对特定宿主的选择性，或评估该宿主缺失后对群落的后续影响。此外，可将对宿主具有靶向作用但对微生物群影响未知的药物加入.......
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致谢
作者感谢Josee Gauthier在16S rRNA基因测序方面的协助。本研究部分得到了佛罗里达大学健康癌症中心基金（C.J.）和佛罗里达大学医学院Gatorade基金（C.J.）的支持。R.Z.G.由佛罗里达大学健康癌症中心基金资助。R.C.N.由佛罗里达大学国家卫生研究院TL1培训项目（TL1TR001428，UL1TR001427）、美国国家卫生研究院国家癌症研究所团队型跨学科癌症研究培训项目（T32CA257923）以及佛罗里达大学健康癌症中心资助。本出版物中报告的研究由佛罗里达大学健康癌症中心支持，该中心部分资金来自州政府拨款 佛罗里达州法规 § 381.915 及 美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所，资助号P30CA247796。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院或佛罗里达州的官方观点。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL BD Slip Tip 注射器，无菌，一次性使用 | Fisher Scientific | 309659 | |
| 1/4-28 mm 螺纹转带倒钩的雄接头（3.2 mm），5个/包 | Cole-Parmer | 008NB32-KD5L | 构建1个6孔阵列需要2包 |
| 10M NaOH（氢氧化钠） | Sigma | 72068-100ML | |
| 2.0ml 螺口管，无滚花，带裙边，透明，电子束灭菌管，带附着盖 | Fisher Scientific | 14-755-228 | |
| 2mag MIXdrive 60 搅拌驱动器 | 2mag | 40060 | 60位磁力搅拌板（可选加热功能，货号 40260） |
| 6孔反应器阵列，类ABS透明塑料 | Protolabs | Custom | 参见补充文件中的.stl文件以进行3D打印 |
| 无水乙醇（200 proof） | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 冰醋酸 | Sigma | A6283 | |
| 接头，尼龙材质，雄性鲁尔接头转1/4-28螺纹，25个/包 | Cole-Parmer | EW-45505-82 | 构建1个6孔阵列需要6个（1包） |
| 铝箔 | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| 厌氧培养箱 | Coy Lab Products | Type B | |
| Bel-Art SP Scienceware Flea Micro Spinbar 磁力搅拌子（1个/包） | Fisher Scientific | 22-261679 | 构建1个6孔阵列需要6个 |
| II级生物安全柜 | Nuaire | ||
| 丁酸 | Sigma | B103500 | |
| CaCl2 · 2H2O（二水合氯化钙） | Sigma | C7902 | |
| Clorox Healthcare 含氯杀菌湿巾，无香型，6" x 5"，每包150片 | Office Depot | 129202 | |
| D-(-)-果糖 | Sigma | F0127-100G | |
| D-(+)-纤维二糖 | Sigma | C7252-100G | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G8270-100G | |
| D-(+)-麦芽糖一水合物 | Sigma | M5885-100G | |
| Drill America Plug Hand Tap DWTP1/4-28 | Home Depot | 305699489 | |
| Dulbecco's 磷酸盐缓冲液，1X，不含钙和镁，无菌 | Genesee | 25-508 | |
| 雌性鲁尔接头 × 1/16″ 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包 | Cole-Parmer | EW-45502-00 | 构建1个6孔阵列需要24个（1包） |
| 雌性鲁尔接头 × 1/8″ 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包 | Cole-Parmer | EW-45502-04 | 构建1个6孔阵列需要6个（1包） |
| 雌性鲁尔接头 × 3/32″ 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包 | Cole-Parmer | EW-45502-02 | 构建1个6孔阵列需要6个（1包） |
| 雌性鲁尔三通接头，尼龙材质，25个/包 | Cole-Parmer | EW-45502-56 | 构建1个6孔阵列需要10个（1包） |
| FeSO4 · 7H2O（七水合硫酸亚铁） | Sigma | F8633 | |
| 血红素 | Sigma | H3281 | |
| 组氨酸 | Sigma | H7750 | |
| 异戊酸 | Sigma | 129542 | |
| K2HPO4 二碱式（磷酸氢二钾） | Sigma | P2222-1KG | |
| KH2PO4 单碱式（磷酸二氢钾） | Sigma | P0662-500G | |
| 大孔径移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707-134 | |
| L-半胱氨酸盐酸盐 | Sigma | C1276-10G | |
| 带锁环的雄性鲁尔接头 × 1/8″ 软管倒钩接头，尼龙材质，25个/包 | Cole-Parmer | EW-45505-04 | 构建1个6孔阵列需要42个（2包） |
| 肉浸膏 | Sigma | 70164-500G | |
| Med Vet International Exel 针头，20G × 1"，皮下注射，100个/盒，26417 | Fisher Scientific | 50-209-2532 | |
| 甲萘醌（维生素K3） | Sigma | M5625 | |
| MgSO4 · 7H2O（七水合硫酸镁） | Sigma | M1880-500G | |
| Milli-Q 水 | |||
| NaCl（氯化钠） | Sigma | S9888-500G | |
| NaHCO3（碳酸氢钠） | Sigma | S5761-500G | |
| Omnifi t Q系列双孔瓶盖 | Cole-Parmer | 00945Q-2 | 构建1个6孔阵列需要1个 |
| PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V | MasterFlex | ISM939C-115V | 24通道蠕动泵，需各1台用于进样和废液 |
| Precision Seal® 橡胶隔垫，白色，7 mm 外径玻璃管（100个/包） | Millipore Sigma | Z553905-100EA | 构建1个6孔阵列需要6个隔垫 |
| 丙酸 | Sigma | P5561 | |
| 泵管，双止口，Tygon S3 E-Lab，内径1.02 mm；12根/包 | VWR | MFLX96460-28 | 构建1个6孔阵列需要6根 （1包） |
| 泵管，双止口，Tygon S3 E-Lab，内径1.14 mm；12根/包 | VWR | MFLX96460-30 | 构建1个6孔阵列需要6根（1包） |
| Puritan Cary-Blair 培养基，5 ml | Fisher Scientific | 22-029-646 | |
| PYREX 2L 圆形培养基储存瓶，带GL45螺口盖 | Fisher Scientific | 06-414-1E | |
| 剃须刀片 | Genesee | 12-640 | |
| 刃天青钠盐 | ACROS Organics from ThermoFisher | AC41890-0010 | |
| 可溶性淀粉 | Sigma | S9765-100G | |
| 不锈钢微型刮勺，勺状刀头 | Fisher Scientific | S50823 | |
| TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100英尺 | VWR | MFLX06449-42 | 构建1个6孔阵列需要205.5 cm |
| 微量元素补充剂 | ATCC | MD-TMS | |
| 胰蛋白胨（BBL） | Fisher Scientific | B11921 | |
| PTFE管，1/8″（3.2 mm）外径 × 1.5 mm 内径，10 米 | Cole-Parmer | 008 T32-150-10 | 构建1个6孔阵列需要300 mm |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 维生素补充剂 | ATCC | MD-VS | |
| 酵母提取物（Bacto） | Fisher Scientific | DF0127-17-9 |
参考文献
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biol. 14 (8), e1002533(2016).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the holobiont: how microbial metabolites affect human health and ....
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