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方法文章

生成顶面朝外的肠道类器官及利用EdU标记评估类器官增殖速率

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DOI：

10.3791/68039

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2025年3月28日

 ,  ,  ,  , 
1Small Animal Internal Medicine, Department for Small Animals and Horses, University of Veterinary Medicine, 2Cluster of Excellence Physics of Life, TU Dresden, 3Unit for Microbiology, Center for Pathobiology, Department for Biological Sciences and Pathobiology, University of Veterinary Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种从标准基质包埋的类器官培养物中生成顶膜朝外的肠道类器官的实验方案。同时概述了将EdU掺入活跃增殖细胞中的步骤，以及对EdU阳性细胞进行半自动定量分析的方法。

摘要

本文介绍了从水凝胶包埋的肠类器官培养物中生成顶端朝外（apical-out）漂浮培养类器官的方法。同时，建立漂浮的基底朝外（basal-out）类器官培养体系，以便直接比较顶端朝外与基底朝外类器官。随后将顶端朝外和基底朝外类器官暴露于胸腺嘧啶类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU），该类似物可在细胞分裂S期整合至新合成的DNA中。通过激光扫描共聚焦显微镜，可在形态完整的类器官中对EdU的DNA整合进行 可视化 观察。然后使用图像分析软件以半自动方式对Hoechst33342和EdU标记的细胞进行定量。通过计算EdU阳性细胞占总细胞数的百分比，可实现对三维（3D）类器官中细胞增殖的分析。尽管本方案在此用于肠类器官增殖分析，但也适用于其他类器官或二维细胞培养中各类细胞核特异性染色的分析。

引言

肠道类器官是由不同细胞类型组成的肠道上皮的三维体外模型。这些类器官可轻松地由从肠隐窝中分离的成体干细胞建立1。由于类器官更接近于体内上皮组织，因此在生物医学研究中正变得越来越重要。肠道类器官不仅用于生理机制的研究（例如肠道微环境信号2,3和细胞分化4,5），也用于传染病研究6,7。然而，在三维结构中培养具有极性的细胞并形成包含中央管腔的类器官具有挑战性，因为细胞的顶膜表面最终位于类器官管腔内部而难以接触。在代谢研究中，比较顶膜与基底侧膜表面的差异可能十分重要，例如脂肪酸吸收的差异8，以及在传染病研究中的应用9,10,11,12。

生成所谓的顶端朝外类器官是解决这一问题的简便方法。通过从标准类器官培养物（即基底朝外、基质包埋的类器官）中去除细胞外基质，并将这些类器官接种于无基质培养基中，可诱导其发生极性转换9。

正如我们先前发表的研究所述，大多数类器官在12小时内会反转其极性。然而，需要48至72小时才能获得超过90%的顶膜朝外类器官。尽管顶膜朝外类器官具有可接触顶膜细胞表面的优势，但在极性反转后其增殖能力显著下降，同时细胞死亡率上升13。增殖活性这一因素可能在多种分析中成为混杂变量，在设计实验时应予以充分考虑。

本文介绍了一种建立肠类器官顶膜外翻培养物以及漂浮式基底外翻对照类器官的详细方案，可用于后续分析。此外，我们描述了使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）进行标记的方法，EdU可掺入新合成的DNA中，从而标记处于活跃增殖状态的细胞。我们进一步介绍了利用Zeiss公司的arivis Pro软件，通过定量EdU+细胞来半自动分析类器官增殖率的图像分析方法。该流程的示意图见图1。

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方案

采用 Kramer 等人于 2020 年建立的方法14，利用成体干细胞衍生的犬类肠道类器官进行实验。根据机构伦理委员会指南，治疗性切除或死后采集的组织材料的使用已包含在所有患犬主人签署的大学“治疗知情同意书”中。

1. 类器官培养

  1. 在24孔板中，将成体干细胞来源的肠道类器官包埋于选定的基底膜提取物（BME）基质中进行培养，并按照Pleguezuelos等（2020）15中所述方法，使用玻璃移液管进行机械传代。
    注意：本方案中选用Geltrex作为BME。
  2. 小心移除包埋类器官的BME中的优化培养基（表1）。
  3. 每孔加入500 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，通过反复吹打使所有基质凝胶团块脱离孔壁。将类器官转移至15 mL离心管中，并充分重悬，以彻底解离水凝胶基质。
  4. 将类器官与0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C水浴中孵育，直至所有类器官完全解离为单细胞或小细胞团。
  5. 用基础培养基（表1）稀释胰蛋白酶/细胞悬液。所用基础培养基体积至少为胰蛋白酶体积的两倍。
  6. 在8 °C下以420 × g离心5分钟，尽可能吸除上清液。
  7. 将细胞重新包埋于BME中，接种至与步骤1.3中消化时相同数量的孔中，并加入优化培养基（表1）。
  8. 将细胞在细胞培养箱中孵育3天，随后进行步骤2.1。

2. 极性逆转的诱导与EdU标记

  1. 小心地从BME包埋的类器官中移除培养基。
  2. 向每个孔中加入500 µL类器官收获溶液，并通过反复吹打将所有基质凝胶圆顶从孔壁上脱离。将类器官转移至15 mL离心管中，并充分重悬，以完全解离水凝胶基质。
  3. 将15 mL离心管置于冰上孵育1.5小时。每10分钟充分震荡一次离心管，以防止类器官聚集，并确保残留的水凝胶成分均匀解离。
  4. 在孵育期间，用抗黏附溶液包被一块96孔板。对于在步骤1.3中使用胰蛋白酶处理的24孔板中的每一孔，需包被96孔板中的8个孔。室温（RT）孵育至少1小时。
  5. 向15 mL离心管中加入至少两倍于所用类器官收获溶液体积的PBS，并在8 °C、150 × g条件下离心5分钟。
  6. 移除上清液，并将类器官重悬于1 mL PBS中。
  7. 将500 µL类器官/PBS悬液转移至另一个15 mL离心管中，然后将两个离心管再次在8 °C、150 × g条件下离心5分钟。
  8. 从96孔板中移除全部抗黏附溶液。
  9. 离心后尽可能彻底移除上清液。
  10. 使用其中一个离心管中的类器官生成漂浮的基底外翻（BO）类器官，另一个离心管用于生成顶膜外翻（AO）类器官。
  11. 对于BO类器官，向一个离心管中加入每孔100 µL含7.5% BME的优化培养基（对应96孔板每孔）。充分混匀后，将类器官均匀分配至已包被的96孔板中所需数量的孔中。
  12. 对于AO类器官，向另一个离心管中加入每孔100 µL不含BME的普通优化培养基（对应96孔板每孔）。充分混匀后，将类器官均匀分配至已包被的96孔板中所需数量的孔中。
  13. 将类器官在37 °C、5% CO2 条件下孵育3天。
    注意：形态学差异在第1天后开始可见。然而，已有发表的研究结果表明，绝大多数类器官需要约3天时间才能呈现出顶膜外翻的极性13。
  14. 在设定的时间点（例如极性逆转诱导后24 h/48 h/72 h），向所有需要标记的类器官孔中加入50 µL用优化培养基稀释的3 µM EdU，使每孔终浓度为1 µM EdU。
  15. 在37 °C、5% CO2 条件下孵育1.5小时。
  16. 使用宽口吸头收集EdU标记的类器官，并将其转移至15 mL离心管中。
  17. 向每个离心管（BO和AO类器官）中加入等体积的4%多聚甲醛（PFA）（终浓度为2% PFA），并轻轻混匀。
  18. 在室温下孵育15分钟。
  19. 加入至少两倍于15 mL离心管中液体体积的PBS，并在8 °C、80 × g条件下离心5分钟。
  20. 移除上清液，并将类器官重悬于1 mL PBS中。
  21. 再次在8 °C、80 × g条件下离心5分钟。
  22. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL PBS中，并转移至1.5 mL离心管中。将类器官在4 °C保存，直至进行EdU染色反应（见第3节）。
  23. 对每个待分析的时间点重复步骤2.14–2.22。

3. Click-it EdU 染色反应与 Hoechst 33342 染色

  1. 将固定的类器官（来自步骤 2.22）在 1.5 mL 离心管中于 4 °C 下以 50 × g 离心 g 5 分钟。
  2. 吸除上清液，使用宽口吸头将类器官重悬于1 mL PBS中含3%牛血清白蛋白（BSA）的溶液中。
  3. 重复步骤 3.1 和 3.2（洗涤步骤）。
  4. 移去上清液，将类器官重悬于1 mL PBS中稀释的0.5% Triton X-100溶液中。
  5. 室温孵育20分钟。
  6. 在室温下以 50 × g 离心类器官 g 5 分钟。
  7. 在新管中，通过混合45 µL H2加入5 µL 10x缓冲液添加剂。
  8. 在另一支离心管中，通过混合以下组分配制反应混合液：385.8 µL H2O，43 µL 10x 反应缓冲液，20 µL CuSO₄4,1.2 647 叠氮化物标记的 Alexa Fluor 50 µL，以及 50 µL 1× 缓冲液添加剂（来自步骤 3.7）。
    注意：此混合液适用于五次反应，可根据所需的染色反应次数按比例扩增或缩减。
  9. 重复步骤 3.1 和 3.2 两次（洗涤步骤）。
  10. 吸除上清液，向每管类器官中加入100 µL反应混合液（步骤3.8）。
  11. 室温避光孵育30分钟。
  12. 重复步骤 3.1 和 3.2（洗涤步骤）。
  13. 离心类器官，50 × g 室温下孵育5分钟。
  14. 用 1 mL 含 10 µg/mL Hoechst33342 的 PBS 重悬类器官。
  15. 室温避光孵育45分钟。
  16. 重复步骤 3.1 和 3.2（洗涤步骤）。
  17. 离心类器官，50 × g 4 °C下离心5分钟。
  18. 将种子类器官接种于适合共聚焦显微镜成像的载玻片中的BME基质内（例如，µ-Slide 18孔板）
  19. 在共聚焦显微镜下观察类器官图像。

4. 半自动图像分析

注意：本分析使用了 arivis Pro 版本 4.2.2（图像分析软件）。

  1. 将共聚焦显微镜图像导入图像分析软件，并定义用于保存分析文件的文件夹。使用以下选项 图像作为时间点 导入多张图像（重复图片、不同时间点、不同处理条件等）。每张图像将被视为一个单独的时间点，便于在各图像间轻松切换。
  2. 打开分析面板并导入提供的分析流程 补充文件 1 (arivis_EdU流程)
  3. 使用 放置新物体 工具和 球体 带有标签 类器官 轻松环绕所有分离良好的类器官。
  4. 切换到下一张图像，即下一个时间点，并对所有图像中的类器官进行标记。
  5. 对于彼此非常接近因而无法使用以下方法分离的类器官 球体 模式下，打开对象列表并激活标签 类器官.
  6. 继续使用 绘制对象 工具在 多边形 手动模式用于标记类器官轮廓。
    注意：在对象列表中，所有类器官均已标记并分配至特定时间点。该时间点对应于步骤 4.1 中导入图像的顺序。如有需要，现在可将这些时间点重命名为与原始图像名称一致。
  7. 在对象列表中，标记所有对象（=类器官），然后单击右键，再单击 移除标签 去除 手动 从所有对象中移除标签。
  8. 灭活 类器官 在对象列表中添加标签，并使用该标签标记先前定义对象中所有应从分析中排除的区域 绘制对象 工具在 多边形 模式。这些区域可能包括类器官腔内的死亡细胞或模糊区域，可能会干扰分析。
  9. 打开对象列表时，确保所有类器官均列在其中 类器官 标签以及所有应被排除的区域都带有该标签 手动.
  10. 单击左上角面板中的箭头以启动分析流程。
    注意：该软件现在会对 Hoechst33342 和 EdU 通道中的所有细胞核进行分割。此分析流程仅考虑 Hoechst33342 通道的分割结果。+ 和 EdU+ 大于15 µm的细胞核2 根据细胞核分割的面积大小排除可能来源于死细胞的小细胞核，以确保分析的准确性。
  11. 通过点击在对象列表中查找分析结果 特色专栏 标签
  12. 切换至 主从视图 并选择 类器官 上方面板中的标签和特征 首次时间点.
  13. 在下方面板中，选择每个类器官要显示的特征。使用 投影（x/y/z）面积（体素），平均强度 # 1 （EdU 通道），以及 SD 强度 #1.
  14. 导出结果（主从详细报告) 使用 Excel 导出 功能
  15. 保存分析文件并关闭软件。

5. 类器官增殖速率的测定

  1. 打开在步骤 4.14 中导出的 主详细报告 文件。
  2. 每个分析的图像对应一个独立的工作表。针对每幅图像，分别计算细胞核和 EdU 染色的面积/体素总和。然后，将所有结果数据复制到一个新的汇总工作表中，并将属于同一时间点的数据归为一组。
  3. 接着，计算每幅图像中细胞核的总面积（即 Hoechst33342+ 面积与 EdU+ 面积之和）。
  4. 随后，用 EdU+ 的平均面积除以细胞核总面积，得到 EdU+ DNA 所占百分比（细胞核总面积除以其自身等于 100%）。
  5. 以 BO 和 AO 类器官中增殖性 DNA 的百分比为纵坐标，不同时间点为横坐标，绘制图表。

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结果

消化后培养3天的类器官直径应理想地介于50–250 µm之间，如图2A所示。明显大于此范围的类器官可能无法有效逆转其极性。较大的类器官还可能开始出芽，我们注意到这些类器官在有效极性逆转方面也可能存在问题。基底朝外和顶端朝外的类器官在明场成像中已表现出明显的形态学差异。基底朝外的类器官在悬浮培养3天后仍保留较大的腔室（图2B），而顶端朝外的类器官（图2C）则显得更为致密。顶端朝外悬浮培养的一个非常显著特征是类器官周围漂浮的死亡细胞数量较多。这是由于顶端朝外的类器官将终末分化和死亡的细胞排入周围培养基中，而基底朝外的类器官则将死亡细胞积聚在类器官腔内。

在细胞分裂前已将EdU掺入新合成DNA的肠道类器官，可通过共聚焦显微镜进行成像。随时间推移，基底朝外类器官显示出的EdU信号明显强于顶端朝外类器官（图 3需要注意的是，并非所有类器官在体积增大的同时都会显示 EdU+ 细胞，这是由于未添加 EdU 所致。+

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讨论

本方案详细描述了如何在标准的成体干细胞来源的肠道类器官培养物中诱导极性反转。顶膜外翻类器官可用于接触通常朝向类器官腔内的细胞顶膜表面。在特定应用中，能够检测细胞顶膜表面可能具有重要意义，因为在生理条件下，该部分细胞膜在体内暴露于消化道内的所有内容物。in vivo下特异性刺激顶膜表面的其他方法包括显微注射16、类器官来源的单层细胞培养17以及类器官碎片化18。然而，正如我们及其他研究者先前所综述的那样，这些方法各自存在特定的局限性和缺点19,20。

生成顶膜外翻类器官的方法具有多项优势：1）与其他方法相比，生成顶膜外翻类器官相对简便，无需任何专用仪器或设备，因此是一种经济高效地获取细胞顶膜表面的途径；2）悬浮培养的基底外翻类器官可与之平行培养，并作为有意义的对照类器官，尤其适用于分析极性特异性效应；3）悬浮...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了奥地利兽医大学（Vetmeduni，奥地利）VetImaging 核心设施（VetCore）资源的支持。我们感谢 Ursula Reichart 在半定量图像分析方面的协助。GC 在奥地利兽医大学小型动物内科学系获得奥地利科学院（ÖAW）DOC 奖学金（资助编号 26349）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24 孔板Biologix07-6024
[Leu15]-人胃泌素 I，≥95%（HPLC）Sigma-AldrichG-9145
µ-Slide 18 孔玻璃底培养板ibidi81817
100 倍青霉素-链霉素培养基添加剂Gibco/Thermo15140122
A 83-01 Tocris Bioscience2939/10 
防黏附冲洗液StemCell Technologies7010
arivis Pro Zeiss版本 4.2.2
B27 无血清添加剂（50 倍），液体Gibco/Thermo17504044
双苯并咪唑 H 33342（Hoechst 33342）Abcamab145597
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906-100G
Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 647 染料Thermo ScientificC10340
DMEM-F12 培养基Gibco/Thermo11320033
Geltrex 基质胶Gibco/ThermoA1413202
GlutaMAX 添加剂 Gibco/Thermo35050061
HEPES 缓冲液 1 M，液体Gibco/Thermo15630056
人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）PeproTech100-18B-100µG
人肝细胞生长因子（HGF） PeproTech100-39-100µG 
人胰岛素样生长因子 I（IGF-I） PeproTech100-11-100µG
人NOGGIN（哺乳动物来源） PeproTech120-10C-200µG 
N-乙酰-L-半胱氨酸，细胞培养测试，BioReagent Sigma-AldrichA9165-5G 
类器官收获溶液ThermoC10340
Triton(TM) X-100，分子生物学级Sigma-AldrichT8787-250ML
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Gibco/Thermo25300054

参考文献

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