使用定制3D打印模具制备和分析用于无侧限抗压强度测试的 Sporosarcina pasteurii 生物水泥砖块

摘要

Sporosarcina pasteurii 是一种尿素分解细菌，可将尿素分解为碳酸根和铵离子。碳酸根与钙离子结合形成碳酸钙，产生晶体结构，将周围颗粒固定在一起，从而生成生物水泥。本方案提供了一种便捷的方法，利用3D打印模具制备适用于抗压强度测试的生物水泥砖块。

摘要

水泥是一种关键的建筑材料，广泛应用于全球各类建筑结构中，从住宅地基到历史纪念碑和道路工程。它是一种在全球范围内至关重要且储量丰富的材料。然而，传统水泥生产是人为大气二氧化碳（CO₂）排放的主要来源之一，导致温室气体排放和气候变化。微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）是一种生物过程，其中尿素芽孢杆菌（Sporosarcina pasteurii）或其他细菌可生成强度与传统水泥相当的水泥材料，但生物水泥具有碳中和特性。这种通过MICP方法生产生物水泥的技术前景广阔，目前正受到多家企业、国家和研究团队的积极研究。本文所述方案采用定制设计、可重复使用的3D打印模具，对土壤或砂土进行渗流式MICP处理，制备出符合无侧限抗压强度测试标准要求的圆柱形砖块。这些独立自立、顶部带储液槽的模具便于对多个变量和重复样本进行并行测试。本方案详细阐述了尿素芽孢杆菌（S. pasteurii）介导的MICP反应过程，以及3D打印模具的制作、组装和使用方法，以生成生物水泥圆柱形砖块。

引言

混凝土是全球建筑项目的主要建筑材料^1,2。一项研究发现，水泥是全球消耗量第二大的材料，仅次于水³。每年水泥产量接近41亿吨^4,5。传统水泥的生产、加工和应用每年导致全球约8%的CO₂排放⁶。由于传统水泥生产需求量高且对环境具有显著破坏性，开发一种新型的碳中和胶结方法已成为实现全球可持续发展目标的首要任务^7,8,9,10。

生物水泥化是指利用微生物产生水泥、粘合剂或可用于形成固体表面或结构的物质的过程^1,11。目前研究最为明确的生物水泥化过程是利用尿素分解细菌沉淀碳酸钙，使颗粒相互连接形成坚硬的水泥状材料^12,13。

在考虑传统水泥的环保替代品时，该替代材料还必须满足水泥应有的强度要求。无侧限抗压强度试验是一种用于测定岩石、建筑材料或土样抗剪强度的分析方法¹⁴。为了有效进行抗剪试验，样品必须按照行业标准制备，包括直径与高度比为1:2以及圆柱形形状¹⁵。为此设计了一种定制的3D打印模具，以满足这些标准并提高MICP实验流程的效率。这些定制模具支持连续MICP处理液的流经式施加与排水。细菌培养液和矿化溶液可直接加入顶部储液区，随后流经模具，并通过模具底部带筛网的开口排出。模具可放置在烧杯或其他废液收集容器上方。模具沿垂直方向分为两半，便于固化砖块脱模。两半模具通过固定在框架上的八块磁铁连接，并用环氧树脂密封，以防止MICP溶液对磁铁造成损害。模具的两个半部分还设有嵌入式凹槽，用于安装橡胶密封垫圈，以增强密封性并防止泄漏。在圆柱形模具内壁设有一条刻度凹槽，用于指示砂土填充高度，确保制成的砖块高度为3英寸；该凹槽以上的空间则作为处理溶液施加时的储液区。组装时，在模具内部底部开口处覆盖一块金属丝网，可防止砂土从模具底部漏出。此外，在砂土表面放置另一块金属丝网，有助于均匀分布施加的溶液，并确保形成的砖块顶部平整，无尖锐棱边，从而避免影响无侧限抗压强度试验结果。

使用计算机辅助设计（CAD）软件设计了模具，并从CAD文件生成了STL文件（补充文件1和补充文件2）（补充文件3和补充文件4）。该STL文件被上传至3D打印机程序中并进行打印。模具打印完成后，使用水射流系统清除3D打印机产生的支撑材料，得到最终的3D打印结构。此外，还提供了用于打印夯压装置的文件，该装置可辅助在模具中压实砂土并形成平整的上表面。

方案

所用试剂、设备和软件的详细信息见材料表。

1. 溶液与培养基的配制

1. 脑心浸液（BHI）-尿素培养基（1 L）
   1. 使用天平称取37 g BHI粉末，加入1 L锥形瓶或烧杯中。
   2. 使用天平称取20 g尿素，加入同一含有BHI粉末的1 L锥形瓶或烧杯中。
      注意：切勿对含尿素的材料进行高压灭菌或添加漂白剂。尿素会分解为氨气，作为挥发性气体可能有害，并可与漂白剂反应生成有毒的芥子气。所有废弃物应按照机构的安全规程作为危险废物处理。
   3. 向含有BHI粉末和尿素的1 L锥形瓶或烧杯中加入1 L H₂O。
   4. 混合后使用0.45 µm滤膜过滤灭菌，收集至已灭菌的锥形瓶或烧杯中。
2. 胶结溶液（1 L）
   1. 使用天平称取20 g尿素，加入1 L锥形瓶或烧杯中。
   2. 使用天平称取10 g NH₄Cl（氯化铵），加入同一含有尿素的1 L锥形瓶或烧杯中。
      注意：切勿对含氯化铵的材料进行高压灭菌或添加漂白剂。氯化铵会与氨气形成平衡，作为挥发性气体可能有害，并可与漂白剂反应生成有毒的芥子气。所有废弃物应按照机构的安全规程作为危险废物处理。
   3. 使用天平称取49 g CaCl₄·2H₂O（氯化钙）加入同一含有尿素和氯化铵的1 L锥形瓶或烧杯中。
   4. 向含有尿素、氯化铵和氯化钙的1 L锥形瓶或烧杯中加入1 L H₂O。
      注：该溶液不进行灭菌；需新鲜配制，并在48小时内使用。
3. 砖块打印与制备（在MICP处理前数天进行）
   1. 将砖模的STL文件（补充文件1）和夯压装置的STL文件（补充文件2）载入适用于3D打印机的相应程序中。
      注：不同3D打印机所使用的具体程序可能不同，请使用与您所用打印机匹配的程序。
   2. 打印模具和夯压装置（图1）。
   3. 根据打印机要求对模具进行后处理。
   4. 将一块磁铁放入模具中相应的磁铁槽内，确保磁极方向使模具的两半相互吸引而非排斥。
   5. 磁铁正确放置后，用环氧树脂密封每个磁铁。
   6. 选取两个直径为1.5英寸的金属丝网圆片，备用。

2. 砖块制备（第0天）

注意：此处提供一个砖块制备的详细步骤。

1. 将150 mL BHI-脲培养基过滤除菌。对250 mL锥形瓶进行高压灭菌。
2. 配制250 mL矿化溶液；不要将其放入已高压灭菌的250 mL锥形瓶中。
3. 在含有BHI脲琼脂的培养皿上制备 S. pasteurii 分离划线培养物，并于30°C培养24–48小时（使用冻存甘油菌种中的 S. pasteurii）。
4. S. pasteurii 起始培养（第1天）
   1. 向一支培养管中加入1.6 mL BHI-脲培养基，制备1.6 mL起始培养液。
   2. 从第0天的划线平板上挑取单菌落接种至培养管中。
   3. 将起始培养物置于摇床中（150 rpm），在30°C下过夜培养。
5. 菌体培养（第2天）
   1. 检查起始培养物是否生长（表现为浊度增加）。
   2. 向250 mL已灭菌的锥形瓶中加入40 mL BHI-脲培养基。将1.6 mL起始培养液倒入锥形瓶中，在30°C下振荡培养7小时。
   3. 向锥形瓶中再加入40 mL BHI-脲培养基。将锥形瓶置于20°C摇床中过夜（约16小时）。
6. 用 S. pasteurii 处理砖块（第3天）
   1. 向过夜培养的菌液锥形瓶中再加入40 mL BHI-脲培养基，并继续在20°C下培养 S. pasteurii。
7. 制备砖模（第3天）（见 图2）。
   1. 将橡胶垫圈放置在模具相应位置。将模具两半连接，确保垫圈密封且所有磁铁均已吸合。
   2. 在圆柱形砖模底部放置一圈细铁丝网，防止沙子从模具孔洞中漏出。
   3. 将沙子或其他材料填充至模具内壁标线处，并用力压实。
   4. 在沙子顶部再覆盖一圈铁丝网，完全覆盖整个上表面，并再次压实。
   5. 将模具置于废液容器上方，以承接渗出液体。
8. 处理流程（第3天）
   1. 在沙子表面倾倒40 mL S. pasteurii 菌液，使其充分渗透。静置45分钟。
   2. 在沙子表面倾倒80 mL矿化溶液。静置30分钟。
   3. 在沙子表面倾倒40 mL S. pasteurii 菌液。静置30分钟。
   4. 在沙子表面倾倒80 mL矿化溶液。静置30分钟。
   5. 在沙子表面倾倒40 mL S. pasteurii 菌液。静置30分钟。
   6. 在沙子表面倾倒80 mL矿化溶液。静置至少48小时，或直至沙子表面明显干燥。
9. 检查最终产物（第5天）。
   1. 小心打开模具，将模具从中间分开，释放磁铁压力，轻柔地将砖块从模具中取出。
      注：若沙子仍显潮湿，则需再干燥一至两天后再取出砖块（砖块越干燥，越容易取出）。
   2. 将砖块置于纸巾上，继续干燥3周后再进行抗压强度测试。
10. 模具清洗（第5天）
    1. 取出砖块后，将垫圈和铁丝网从模具的每一半中分离。
    2. 将铁丝网浸泡于70%乙醇溶液中24小时，随后用水冲洗。必要时可轻微刷洗以清洁网面。
    3. 用70%乙醇冲洗模具，并使用软毛刷、海绵或其他清洁工具至少刷洗三次；然后用肥皂水清洗，再进行空气干燥。
    4. 用70%乙醇冲洗垫圈，再用肥皂水清洗，随后进行空气干燥。

3. 压缩测试（第25天）

1. 使用无侧限抗压强度试验分析所有砖块的强度¹⁶.
   1. 确保砖块的圆形端面平整均匀。如果端面不平，可使用锉刀或其他工具将表面修整均匀。
      注意：如果正确铺设了钢丝网，砖块的两端应基本平整。为确保强度测量准确，砖块两端尽可能平齐至关重要。
2. 将一块砖放入拉链式或密封塑料袋中，并调整砖块在塑料袋中的位置，使砖块的平整面不被塑料袋的接缝覆盖 实现平滑、平整的覆盖。
3. 将砖块放置在下部加载板上。在砖块顶部放置一块平整且均匀的加载板。
4. 施加约1磅的压力到砖块上 通过 无侧限抗压强度试验机
5. 将数字读数归零。
6. 根据仪器规格持续施加递增载荷，直至砖块发生完全结构破坏。
7. 记录每块砖的最大承重载荷。进行所需的统计分析以评估结果。

结果

3D打印模具的构建过程如图1和图2所示。阳性结果应表现为从模具中取出后仍保持形状的砖块，经过3周干燥后，呈现为结构完整、可轻易用手操作且接触时材料损失极少的固体。如果砖块未形成固体，出现碎裂或在触碰或移动过程中发生明显材料脱落，则可能在培养基或培养物制备过程中存在操作错误。阳性与阴性砖块结果的示例如图3所示。

如图4所示，模具用于同时测试两种不同的基质：粗砂和细砂。根据本文所述的S. pasteurii方案，制备了四块粗砂砖和四块细砂砖，并对其进行无侧限抗压强度测试。以往关于使用S. pasteurii形成的生物水泥化土壤的无侧限抗压强度研究结果显示，其强度范围为48–12,400 kPa，具体数值取决于土壤或砂的类型以及S. pasteurii的脲酶活性^1...

讨论

关键步骤
该生物水泥化方案利用 S. pasteurii 通过微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）技术制备生物胶结圆柱形砖块 适用于无侧限抗压强度测试。无侧限抗压强度测试中最关键的因素之一是试样的形状和结构。应确保圆柱体试样顶部和底部平整，且试样高度尽可能接近3英寸；略高于3英寸优于略低于3英寸。由于砂/土在处理过程中会发生沉降，导致高度略有损失，因此建议在初始处理前将模具略微过量填充。在施加处理前，于砂/土顶部放置的金属丝网圈有助于均匀分布施加的溶液，并形成更平整的表面¹⁶彻底清洁模具、筛网和垫圈对于最大限度降低未来砖块交叉污染的风险至关重要。同时，清洁筛网或使用新筛网也非常重要，因为筛网会随着时间推移发生生物胶结或堵塞，若不及时清洁或更换，可能导致流速下降。^13,17.

修改/故障排除

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D打印机	Stratasys	Objet 30 V3	Objet30 Pro V3.0 桌面型3D打印机
3D打印机材料	Stratasys	OBJ-04066	Rigur RGD450 模型材料
3D打印机材料	Stratasys	OBJ-04020	Sup 705 支撑材料
氯化铵	Fisher Scientific	A661-500	其他品牌的氯化铵也可使用，生产厂家无关紧要
脑心浸液肉汤	Millipore	53286	其他品牌的脑心浸液肉汤也可使用，生产厂家无关紧要
二水氯化钙	VWR	BDH9224	其他品牌的二水氯化钙也可使用，生产厂家无关紧要
粗砂	Ward’s	470016-902	特殊砂砾混合物与应力粘土
桌面水刀	Stratasys	OBJ-01400	用于3D打印件后处理的水刀系统
环氧树脂	Gorilla Glue	4200102	GORILLA 环氧胶：环氧树脂，0.8 fl oz，注射器装，透明，浓稠液体
细砂	Sandtastik	PLA25	亮白色儿童用细砂
垫片材料	McMaster-Carr	8525T65	三元乙丙橡胶（EPDM），厚度1/16”
GrabCAD	Stratasys	GrabCAD	3D打印机软件
磁铁	K&J Magnetics	D64-N52	钕铁硼N52级磁铁
SolidWorks 2021	Dassault Systèmes	SolidWorks 2021	CAD软件
Sporosarcina pasteurii			菌株：ATCC 11859 / DSM 33
真空过滤杯 0.45µm	VWR	10040-450
钢丝网 1.5” 直径圆片	McMaster-Carr	2812T43	钢丝网材料