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方法文章

从导管细胞移植获得的类胰岛细胞在大鼠体内的研究

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DOI：

10.3791/68066

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2025年8月1日

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

本文内容

摘要

由导管细胞衍生的类胰岛细胞在降低糖尿病大鼠血糖水平和增强胰岛素生成方面展现出治疗糖尿病的潜力。然而，在确保细胞功能充分性、免疫防御及安全性方面仍存在挑战。需要进一步研究以提升这些细胞的治疗能力。

摘要

利用导管细胞来源的类胰岛细胞已成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。由于负责合成胰岛素的胰腺β细胞遭受自身免疫破坏，糖尿病患者体内胰岛素合成不足。在此背景下，胰岛细胞移植的目标是恢复患者自身产生胰岛素的能力。然而，供体胰腺中胰岛细胞获取不足以及免疫排斥反应等障碍限制了该疗法的广泛应用。在特定条件下，胰腺导管细胞具备转化为胰岛素生成细胞的能力。这些细胞可在受控环境中培养，并被诱导转化为能够分泌胰岛素的类胰岛细胞，从而适用于移植治疗。这一创新策略有望阻止1型糖尿病的进展，并减少对胰岛素注射的依赖。在本研究中，将导管细胞来源的类胰岛细胞通过门静脉移植至链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肝脏中。移植后，我们观察到大鼠血糖水平从第5天起显著下降，并持续降低达15天。此外，腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）显示，接受类胰岛细胞移植的糖尿病大鼠比对照组显著产生更多的胰岛素。这些结果表明，导管细胞来源的类胰岛细胞可能是糖尿病治疗的一种有前景的策略。该研究领域面临的主要挑战包括：确保细胞具备足够的功能活性、保护其免受免疫系统攻击，以及验证其在治疗应用中的安全性。未来的研究有望为优化此类细胞在临床治疗中的应用提供关键见解，重点在于提升疗效与安全性。

引言

1型糖尿病是一种持续性的自身免疫性疾病，其特征是胰腺中产生胰岛素的β细胞遭到破坏。目前的治疗方法主要包括长期胰岛素治疗，尽管这种方法在控制血糖水平方面是有效的，但并不能治愈该疾病，也无法阻止其进展1。由于现有治疗策略过度依赖胰岛素治疗，而疗效仍存在局限，因此探索1型糖尿病的替代疗法成为研究重点。这一需求推动了持续的研究工作，聚焦于诸如胰岛细胞移植等替代性治疗手段，旨在恢复机体自身产生胰岛素的能力。然而，由于供体胰岛细胞来源稀缺，且存在免疫排斥的风险，该疗法难以广泛应用。因此，科学界日益关注寻找可替代的胰岛素生成细胞来源1,2,3。

该方法旨在利用这些细胞的再生潜能，建立可持续的胰岛素分泌细胞供应体系4。In vitro 研究已证明，这些导管细胞可被转化为具有功能的类β细胞，能够在葡萄糖刺激下分泌胰岛素5。考虑到传统胰岛移植因复杂的免疫反应而常导致不良结果，这一研究方向尤为重要。大量研究表明，来源于导管的细胞不仅具有生成胰岛素的内在能力，还可能表现出促进免疫耐受的特性，从而缓解传统移植技术所面临的一些挑战5,6,7,8。这些细胞可在体外培养，转化为类似胰岛并能释放胰岛素的细胞，随后植入糖尿病患者体内。包括链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠实验在内的临床前研究已表明，移植这些细胞可有效降低血糖水平并增强胰岛素分泌9。

我们的研究方法旨在通过在标准细胞培养基中添加胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS）10,11,12、异噁唑啉-9（Isoxazole 9, ISX-9）13,14以及胰高血糖素样肽-1（GLP-1）15，以加速细胞向胰岛样细胞的分化过程，并提升胰岛素生成细胞的功能。据报道，这些因子在促进胰腺分化和增强胰岛素分泌方面具有重要作用。通过整合这些成分，旨在更高效地获得功能性的类胰岛细胞，并确保其在葡萄糖刺激下具备合成和释放胰岛素的能力9,10,11,12,13,14。

在胰岛移植中，免疫排斥是实现成功疗效的重要障碍。同种异体移植的胰岛易受到免疫系统的攻击，因此需要使用免疫抑制疗法来防止排斥反应16,17。胰腺导管细胞在胰岛移植过程中参与免疫排斥的作用机制，目前仍是一个正在发展的研究领域。人们认为，导管细胞可能具有减轻免疫排斥的特性，从而提高移植胰岛的存活率和正常功能。Ilieva 等人证明，与导管细胞共培养的胰岛表现出更少的中心坏死和细胞凋亡，表明其对免疫介导的损伤具有保护作用。这种保护效应可能由导管细胞分泌的胰岛素样生长因子2（IGF-2）等因子介导，正如 Marín-Cañas 等人（2019）所指出的那样18。该保护作用至关重要，因为免疫排斥对胰岛移植的成功构成了重大挑战，尤其是在1型糖尿病患者中。胰岛移植物中的导管细胞已被证实与移植物功能增强和存活率提高相关，这很可能归因于其分泌免疫调节因子以减轻免疫反应的能力19。

尽管取得了令人鼓舞的进展，但仍需解决一些障碍，以确保这些基于细胞的疗法在临床应用中的有效性和安全性。必须验证所诱导的细胞是否具有与天然β细胞相似的功能特性，并建立有效的方法来保护这些细胞免受免疫系统的攻击，以确保其长期存活和功能发挥20,21。随着该研究领域的推进，全面了解并克服这些障碍对于充分发挥导管细胞来源的胰岛素生成细胞在1型糖尿病治疗中的潜力至关重要22,23,24。

本研究旨在评估在最佳条件下由导管细胞衍生的类胰岛细胞在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中恢复血糖控制的体内效率。

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方案

本研究遵循ARRIVE指南建议，确保研究的设计、实施和报告符合动物福利和实验完整性的高标准（https://arriveguidelines.org）。安卡拉梅迪波尔大学获得了伦理委员会（AMUHADYEK-12- 09.05.2025）及机构的批准。所有方法均按照适用的指南和法规执行。已采取一切措施以最大程度减少动物痛苦，并使用实现科学目标所需的最少数量的动物。

1. 溶液的配制

  1. 酶溶液：使用50 mg粉末状Clostridium histolyticum V型胶原酶配制胶原酶溶液。将胶原酶与含钙镁的HBSS混合，定容至50 mL，使终浓度为1 mg/mL。每份样品使用7 mL该溶液，剩余部分于-20 °C冰箱中保存。
    注意：推荐的胶原酶浓度为1 mg/mL。在吸入注射器前，必须将胶原酶与预先配制的HBSS溶液混合至1 mg/mL的浓度。
  2. 洗涤液1：从500 mL不含酚红的HBSS中取出62.5 mL。将50 mL胎牛血清（FBS）小心地加入剩余的HBSS中。再加入5 mL青霉素/链霉素（P/S）、5 mL L-谷氨酰胺（L-Gln）和2.5 mL 1 M HEPES。最后用HBSS定容至500 mL。
    注意：加入酚红后，最终溶液组成为88% HBSS、10% FBS、1% P/S和1% L-Gln。为防止起泡并确保准确性，应逐步小心加入胎牛血清。
  3. 细胞培养基及洗涤液2：从500 mL Roswell Park Memorial Institute培养基（含L-Gln的RPMI）中取出62.5 mL。在向剩余RPMI中逐步加入50 mL FBS时需格外小心，避免产生泡沫。加入2.5 mL 1 M HEPES、5 mL P/S和5 mL L-Gln，并确保总体积为500 mL。4 °C保存。
  4. 密度梯度溶液：通过将1100 mg/mL密度溶液用HBSS稀释，配制终密度为1062–1096 mg/mL的梯度溶液。为确保准确性，使用密度计检测每种配制溶液的密度，并以1077 mg/mL浓度溶液作为参考。获得所需浓度（1062–1096 mg/mL）后，将溶液转移至密封容器中，避光保存于4 °C，以维持其稳定性。
  5. 配制0.4%台盼蓝溶液。磷酸盐缓冲液（PBS）pH为7.4，可促进细胞生长。
  6. 细胞培养增殖培养基：取43.4 mL Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI）与43.4 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM-低糖）混合。加入10%胎牛血清（FCS）、1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1% L-谷氨酰胺（L-Gln）、1%青霉素-链霉素（P/S）以及0.2 mL 1 M HEPES。用HBSS定容至100 mL。4 °C保存。
  7. 细胞培养分化培养基：将43.4 mL RPMI与43.4 mL DMEM-低糖混合。加入10% FCS、1% ITS、1% L-Gln、1% P/S和0.2 mL 1 M HEPES。此外，向分化培养基中加入1 µL溶于4 mL乙醇中的Isoxazole 9（ISX-9）。最后，向细胞培养基中加入24 µL浓度为50 nM的胰高血糖素样肽1（GLP-1）溶液。
    注意：ISX-9和GLP-1仅在换液时新鲜添加；二者需预先配制。所有用于培养的试剂均需新鲜配制。
  8. 二苯硫腙（DTZ）溶液：将100 mg二苯硫腙溶于20 mL二甲基亚砜（DMSO）中，充分混匀。向所得溶液中加入30 mL HBSS，搅拌至形成均一混合物。使用0.2或0.4 µm滤器过滤。向滤后溶液中加入50 mL HBSS。标注配制日期。待固体完全溶解后，再经0.4 µm滤器过滤一次。将滤后溶液分装至2 mL离心管中，解冻后立即使用。配制好的溶液于-20 °C保存。
  9. Krebs溶液：在250 mL容器中加入1.68 g氯化钠（终浓度115 mM）、0.50 g碳酸氢钠（24 mM）、0.09 g氯化钾（5 mM）、0.05 g氯化镁（1 mM）、0.09 g氯化钙（2.5 mM）和0.25 g牛血清白蛋白（0.1%）。加入6.25 mL 1 M HEPES。用去离子水定容至250 mL，搅拌至完全溶解。使用1 M NaOH或1 M HCl将pH调节至7.3–7.5。经0.22 µm滤器过滤。室温保存。使用前置于37 °C水浴中预热。
  10. 高葡萄糖浓度溶液：称取149.1 mg D-(+)-葡萄糖加入离心管中。加入50 mL Krebs溶液，充分振荡混匀。经0.22 µm滤器过滤。
  11. 低葡萄糖浓度溶液：将1 mL 16.7 mM高葡萄糖浓度溶液与9 mL Krebs溶液混合。

2. 从大鼠中分离胰腺

  1. 取三只体重在220 g至280 g之间的Wistar Albino实验大鼠（3月龄，雄性）。使用氯胺酮（35–50 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）联合麻醉。通过检查足底回缩反射是否消失来评估麻醉深度。在眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
  2. 使用剪刀沿腹白线做3–4 cm长的腹部正中切口，开始手术操作（图1A）。通过手指对肋骨施加轻柔的物理压力，抬高膈肌，从而精细操作肝脏。将肝脏外置，并置于无菌纱布上以保持稳定。
  3. 配制标准化的胶原酶溶液，剂量为每克体重28 mg；对于体重在250–300 g的大鼠，抽取7 mL（约7 g）溶液至注射器中。根据每只动物的体重调整溶液用量。
  4. 切开胰管。使用精细的血管剪，在靠近肝脏处剪断胰管。依据胰腺及其周围血管的解剖位置识别胰管。利用邻近血管和组织特征等定位线索确保准确性。在此位置进行一次精准切割，以便阻断胰管。
    注：切口极小——小到无法精确测量，但足够宽以插入导管。该切口可实现导管的顺利高效置入，同时最大程度减少对周围组织的损伤。
  5. 将带有内置套管的导管插入所形成的胰管开口中（图1B）。确认导管正确就位后，使用手术夹（如显微镊）固定导管，防止其移位。
  6. 通过缓慢、有意识地推动注射器推杆，以受控方式灌注胶原酶消化液。
  7. 完成灌注后，使用精细手术器械小心分离胰腺组织与周围结构。切除操作应迅速进行，并采用精确而轻柔的动作，以最大限度减少组织损伤。取出后立即置于冰上盛有50 mL离心管中的胰腺组织，以终止任何酶活性。
  8. 整个过程每只胰腺操作时间应控制在约60秒内25。此外，在所有胰腺完成灌注前，应将胶原酶溶液和已取出的胰腺组织均置于冰上保存。

动物模型中的外科技术；示意图显示了使用外科器械进行的肠道手术。
图1：胰腺处理过程。（A）夹闭胰管在十二指肠的开口，以及（B）使用胶原酶V型灌注，最终获得胰腺图像。请点击此处查看该图的放大版本。

3 从胰腺组织中分离导管细胞

  1. 手术取出后，将胰腺置于37 °C水浴中孵育12分钟。
  2. 向试管中加入25 mL洗涤液1以中和胶原酶活性。手动振荡试管以促进胰腺组织的解离。所有后续操作均需在层流洁净台的无菌环境下进行。
  3. 所有培养基均需置于冰上。在4 °C条件下以100 × g离心1分钟，刹车设置为最大。弃去上清液。向细胞沉淀中加入25 mL洗涤液1，并重悬混合物。
  4. 再次进行离心并弃去上清液。向沉淀中加入25 mL洗涤液1并重悬。将处理后的胰腺组织通过425 µm不锈钢筛网过滤，以去除任何残留的血管或未消化的组织碎片。
  5. 过滤后，用洗涤液1补足体积至25 mL。在4 °C条件下以100 × g离心1次，持续1分钟。移除上清液。
  6. 加入50 mL RPMI培养基后，使用无菌塑料移液管将沉淀转移至新试管中。在4 °C条件下再次以100 × g离心1分钟。弃去上清液，并将沉淀保存以供进一步分析。
    注意：所有后续步骤均在层流洁净台内无菌条件下进行，符合细胞培养实验要求。
  7. 向上一步获得的沉淀中加入10 mL密度为1.077的溶液，随后通过手指轻敲试管边缘，温和地打散并均质化沉淀。
    注意：从周围胰腺组织中分离胰岛细胞的密度范围约为1.077，而培养基的密度约为1.00126。因此，我们采用密度为1.077的溶液以实现该目的。
  8. 加入10 mL RPMI培养基，并在4 °C条件下以600 × g离心12分钟，关闭刹车。此过程在试管内形成基于密度的分层，导致胰岛细胞聚集于RPMI层正下方的一层中。
  9. 移除胰岛细胞及RPMI层。此步骤的目的是纯化胰岛细胞，以增强其与胰腺组织的分离效果，从而实现更纯净的导管细胞分离过程。
  10. 使用移液管将任何多余的胰腺组织转移至新的50 mL试管中。向组织沉淀中加入10 mL密度为1.096的溶液。
  11. 接着，使用注射器缓慢加入10 mL密度为1.062的溶液，形成梯度。注意保持各组分均匀分布。通过从最密到最稀的顺序叠加溶液来建立梯度。
  12. 在顶部加入10 mL RPMI培养基。在4 °C条件下以600 × g离心12分钟，不启用刹车。离心后可见不同密度的分层。导管细胞位于中间层，处于RPMI层下方。
  13. 使用一次性巴斯德移液管小心吸取导管细胞，并将其转移至另一个50 mL试管中。加入25 mL洗涤液2，并通过轻敲试管使悬液轻轻混匀。
  14. 以100 × g离心1分钟并弃去上清液。对沉淀再进行两次离心洗涤。最后一次洗涤后，向沉淀中加入2 mL洗涤液227。

4. 胰管细胞的分离与培养

  1. 将收获的细胞接种至T25培养瓶中，并加入5 mL预热的细胞培养液。将培养箱维持在5% CO2和37 °C条件下。
    注意：保持生理温度稳定对细胞培养至关重要，因此所有溶液在使用前均需加热至约37 °C。
  2. 24小时后，小心吸除培养基。用洗涤液2清洗细胞两次。加入新鲜细胞培养基，将培养瓶放回培养箱。贴附于培养瓶表面的细胞称为导管细胞。
  3. 每3天更换一次生长培养基。若培养基颜色迅速变化，表明其营养成分正在流失且酸性增强，提示应更频繁地更换培养基。
  4. 当培养瓶中的细胞达到80%融合度时进行传代。用1–2 mL PBS清洗两次，并去除多余培养基。
  5. 加入2 mL酶解消化液（不含酚红），启动酶解过程，使细胞从培养瓶表面分离。
  6. 在37 °C孵育2–3分钟，并在10倍显微镜下观察细胞脱落情况。若细胞仍部分贴壁，可于37 °C再孵育2分钟。
  7. 待细胞完全从培养瓶表面脱离后，加入约8 mL细胞生长培养基（体积为酶解消化液体积的4倍）以终止酶消化作用。轻轻敲击培养瓶壁。
    注意：敲击有助于细胞分散，可缩短整体孵育时间，并防止酶与细胞膜长期接触造成损伤，确保细胞完整性。
  8. 加入细胞培养基后，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在25 °C下以150 × g离心10分钟（减速设置为9档刹车），以收集细胞沉淀。
  9. 弃去上清液。将细胞沉淀用6–8 mL洗涤液2重悬。重复上述离心步骤。弃去上清液。重复该步骤以确保彻底清除酶解消化液。
  10. 用移液器轻柔吹打，将沉淀重悬于5 mL新鲜细胞培养基中，制成均匀的细胞悬液。此时进行细胞计数。
  11. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。
  12. 根据计数结果，按每T25培养瓶接种1 × 106个细胞的标准进行接种。
    注意：此时大多数细胞已被鉴定为导管细胞。根据细胞计数结果，将适量细胞接种至各培养皿中。根据实验观察，当一个培养瓶中的细胞达到最佳融合度时，将其均匀分种至两个不同的T25培养瓶中，以维持较高的增殖效率。通过该方法，我们成功地从大鼠胰腺组织中分离出导管细胞。分离成功后，根据研究计划将细胞准备用于后续实验。
  13. 继续培养至第4代。根据需要进行传代，以维持最佳生长条件。
    注意：从第4代开始，在第3至第9天之间细胞数量显著增加。由于细胞在多次传代后分裂能力趋于下降，该方法确保了获得足够数量的活细胞。当导管细胞增殖至一定数量后，开始向类胰岛样细胞转化。根据研究结果，第3至第6代细胞的增殖速率最快，其中第4代导管细胞数量增长尤为明显。然而，第6代之后细胞增殖能力开始下降。基于上述结果，对该实验方案进行了优化，以在保持细胞活力和功能性的前提下获得适量细胞28。

5. 导管细胞向胰岛样细胞簇的分化

  1. 使用标准传代方法收获第4代导管细胞。用1-2 mL PBS洗涤两次，以去除残留培养基和未贴壁细胞。
  2. 向培养瓶中加入2 mL不含酚红的酶解消化液。在37 °C孵育2-3分钟，并在10倍显微镜下观察。
  3. 若细胞仍贴壁，继续孵育2分钟。加入8 mL细胞生长培养基以终止酶反应。
  4. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在25 °C下以150 × g离心10分钟，升速和降速均设为9。
  5. 弃去上清液。将沉淀重悬于6-8 mL洗涤液2中。再次离心并弃去上清液。
  6. 将最终沉淀重悬于5 mL新鲜培养基中。按前述方法进行细胞计数。
  7. 在六孔板中每孔接种1 × 105个细胞，每孔加入3 mL培养基。在37 °C、5% CO2条件下培养。
  8. 在最初7天内每3天更换一次培养基。若培养基颜色迅速变化，可调整换液频率。
  9. 7天后逐步转换为分化培养基。总共继续培养15天（7天增殖期 + 8天分化期）。分化期间每2天更换一次培养基。
  10. 第8天开始进入分化阶段。4天后，用PBS洗涤细胞两次，每孔加入500 µL酶解消化液。
  11. 孵育2-3分钟，加入2 mL生长培养基终止反应。在25 °C下以150 x g离心10分钟。将细胞重悬后，按每孔1 × 105个细胞重新接种至六孔板中。
  12. 第15天进行完整的显微分析，以明确表征并确认类胰岛样细胞聚集体的形成24。

6. 使用二苯硫腙对分化导管细胞中的锌浓度进行定量

  1. 将DTZ溶液从−20 °C冰箱中取出，解冻并平衡至室温。向15天分化的细胞每孔加入3-4滴DTZ溶液，在显微镜下观察。通过红色染色鉴定胰岛素生成细胞28（图2）。

细胞聚集的显微镜分析；图像 A-D 显示不同密度的细胞簇，染色情况。
图 2：胰岛样导管细胞的显微镜图像。分别为培养第（A）11 天（20x）、（B）13 天（20x）、（C, D）15 天（20x）的图像。细胞经二苯硫腙（Dithizone）染色后进行观察。请点击此处查看该图的高清版本。

7. 葡萄糖刺激试验

  1. 在24孔板中，每孔接种1 × 104个类胰岛细胞簇，每孔加入1 mL分化培养基。
  2. 第15天，用葡萄糖刺激细胞。吸除原有培养基，每孔加入1 mL低葡萄糖溶液（1.67 mM），在37 °C下孵育1小时。
  3. 收集培养基并转移至2 mL离心管中。每孔加入1 mL高葡萄糖溶液（16.7 mM），孵育1小时后收集用于分析的培养基。在每次加入不同葡萄糖溶液后，每隔1小时收集一次细胞培养基。
  4. 按照试剂盒说明书进行胰岛素ELISA检测。从铝箔袋中取出微孔板后，需在开始ELISA操作前使其平衡至室温。
  5. 向样品孔、对照孔和标准品孔中各加入10 µL试剂，再加入75 µL工作用偶联物溶液。密封微孔板，在室温下震荡孵育2小时（700–900 rpm）。
  6. 用350 µL洗涤缓冲液洗涤各孔6次。每孔加入100 µL 3,3′,5,5-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。密封微孔板，在室温下避光震荡孵育15分钟（700–900 rpm）。
  7. 每孔加入100 µL终止液，轻轻振荡混匀以终止反应。去除气泡后，在450 nm处读取吸光度。加入终止液后30分钟内完成测定27。

8. 胰岛及类胰岛导管细胞移植

  1. 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对大鼠进行麻醉。对手术区域进行消毒并铺巾，沿中线做2-3 cm的切口。
  2. 移开肠管，使用牵开器暴露门静脉。进行门静脉切开，并插入预先充满生理盐水的导管（图3A）。
  3. 将100-500 µL细胞悬液注入门静脉。拔出导管，使用缝线或组织粘合剂闭合门静脉切口。关闭腹腔，监测动物恢复情况，并根据需要给予镇痛处理（图3B）。

肝脏手术，门静脉；医学实验；戴手套的手，外科工具。
图3：胰岛及类胰岛细胞的移植。 （A）用于移植胰岛及类胰岛细胞的无菌静脉留置针。 （B）将胰岛及类胰岛细胞移植至无菌注射器中。 请点击此处查看该图的放大版本。

9. 链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠

  1. 禁食大鼠12小时，将链脲佐菌素（STZ）溶于冷的柠檬酸缓冲液（pH 4.5）中，按45 mg/kg剂量腹腔注射。
    注意：STZ注射前禁食12小时可增强GLUT2的表达，从而促进胰岛β细胞中的葡萄糖转运。该过程可增加STZ进入细胞的量，导致更显著的β细胞损伤，有助于诱发更明显的高血糖，提高糖尿病模型的有效性。
  2. 注射后48–72小时检测血糖，若血糖 >250 mg/dL则确认为糖尿病。通常血糖值超过250 mg/dL的大鼠被归类为糖尿病动物，并纳入实验29。

10. 移植用胰岛及类胰岛细胞的制备

  1. 用酶解离溶液处理1分钟后收集细胞。刮取贴壁的细胞。更换新鲜培养基并收集细胞。
  2. 以300 × g 离心5分钟。将沉淀重悬于100–150 µL生理盐水中。进行细胞计数，并将细胞数量调整至每只大鼠1000 IEQ或800个胰岛，或每只大鼠1 × 105个类胰岛细胞。

11. 门静脉移植

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对动物进行麻醉。
  2. 使用无菌溶液（聚维酮碘或70%乙醇）对动物腹部区域进行消毒，并用无菌手术巾包裹手术区域。
  3. 沿中线做一长约2-3 cm的切口，以进入腹腔。
  4. 移开肠道以暴露肝脏。使用无菌拉钩固定肝脏的左叶和右叶，暴露肝脏腹侧表面以定位门静脉。
  5. 用生理盐水预冲洗聚乙烯导管（PE-10或PE-50），并将其完全充满。使用显微外科镊子夹住门静脉的一个分支——通常为左侧或右侧侧支。
  6. 进行小切口静脉切开术（约1-2 mm）。小心将导管插入切开部位。为防止移位，使用缝合材料或镊子固定导管，通常采用6-0缝线。
  7. 通过缓慢注入无菌生理盐水验证导管位置是否正确。随后将制备好的胰岛细胞及类胰岛细胞悬液经导管逐渐注入门静脉，总体积为100-500 µL。
  8. 输注完成后，拔出导管，并使用无菌组织粘合剂或可吸收缝线封闭静脉切口。
  9. 进行出血管理。将肝脏周围所有组织复位，使用可吸收缝线缝合腹肌，皮肤则用缝线或钉合器闭合。
  10. 将动物置于温暖环境中持续监护。在苏醒期间提供适当的镇痛药物（如布托啡诺0.1 mg/kg）。观察动物48小时，检查是否有感染、手术部位水肿或出血等迹象30。

12. 血糖监测

  1. 评估初始血糖水平。小心地抓住大鼠，使用采血针在尾尖处制造一个小切口。用无菌棉签轻轻擦去第一滴血液。
  2. 将第二滴血液滴加到血糖试纸上，并记录基础血糖水平31。

13. 腹腔葡萄糖耐量试验

注意：大鼠接受腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT），以评估其血液中葡萄糖清除效率。该试验可提供关于葡萄糖代谢、胰岛素敏感性以及潜在糖尿病状况的信息。腹腔注射葡萄糖耐量试验于移植后第15天进行。在IPGTT前设定禁食时间的主要原因是稳定基础血糖水平，并确保代谢状态的一致性。禁食期有助于耗尽肝脏糖原储备，从而更可靠地评估葡萄糖耐量反应。禁食6小时可减少餐后效应，而过夜禁食（约12–16小时）可能具有不同的影响，潜在地改变胰岛素敏感性和葡萄糖代谢。

  1. 对大鼠进行6小时禁食处理，仅允许过夜饮水，确保禁食时间不超过12小时。所有实验动物应保持一致的禁食时长，以减少血糖测量结果的变异性。
  2. 在给予葡萄糖前，称量大鼠体重。配制无菌溶液时，将20 g葡萄糖溶解于100 mL无菌生理盐水中。
    注意：标准剂量通常为每千克体重给予2 g葡萄糖（2 g/kg）。给药总体积根据动物体重确定。
  3. 测定基础血糖水平。固定大鼠，使用采血针在尾尖处做小切口，用无菌棉签轻轻擦去第一滴血液。
  4. 将第二滴血液滴加至血糖试纸上，记录基础血糖值。
  5. 根据大鼠体重，按2 g/kg的剂量给予相应体积的葡萄糖溶液。
  6. 在腹腔（IP）注射葡萄糖溶液前，轻柔地抓握固定大鼠。将葡萄糖注射至腹腔内，避免注入皮下组织或任何器官，并确保注射位置正确。
  7. 葡萄糖注射后，在规定时间点采集血样以监测血糖水平。典型的时间点为注射后15、30、60、90和120分钟。
  8. 在每个时间点，通过剪切尾静脉采集血液。每次采血前，确保使用酒精棉片擦拭尾部。
  9. 在每个指定时间点，使用血糖仪测量血糖水平并记录结果。
  10. 实验过程中，密切观察大鼠是否出现不适或不良反应。为减少测量间隔期间动物的应激反应，应维持温暖且安静的环境。
  11. 最后一次血糖测量完成后，清洁尾部伤口，并安抚动物29。

14. 采血后通过ELISA分析胰岛素

注意：本实验方案的步骤是采集大鼠腹主动脉血液，然后使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测胰岛素。

  1. 在采血前，按照前述方法对大鼠进行麻醉。将麻醉后的大鼠仰卧位放置于无菌手术台上。
  2. 剃除腹部区域的毛发，并使用70%乙醇或碘溶液对该区域进行消毒，以确保无菌操作。
  3. 使用手术刀沿中线做切口，穿透皮肤和肌肉层，暴露腹腔。
  4. 将肠管移开，以暴露位于脊柱旁的腹主动脉。使用肝素化注射器，以轻微角度将针头插入腹主动脉。
  5. 将血液（通常为1–3 mL，具体体积取决于大鼠体型）吸入注射器中。施加缓慢且持续的负压，避免血管塌陷或血液溶血。
  6. 将采集的血液置于离心管中，并放置于冰上保存。
  7. 若实验后需对动物实施安乐死，应依照机构伦理指南进行。
  8. 将采集的血液在4 °C条件下以300 x g离心10–15分钟，以确保血浆或血清的有效分离。将上清液转移至新管中，并于-80 °C保存，用于后续胰岛素分析。
    注意：采血过程中应避免溶血，因为这可能影响ELISA结果的准确性（图4）29。

使用导管和试管在实验室进行血液采集，静脉穿刺技术。
图4： 在移植后第15天实验结束时，通过大鼠尾静脉采血至采血管中，用于胰岛素分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

15. 采用ELISA法测定胰岛素

  1. 根据制造商说明书准备胰岛素ELISA试剂盒。在开始检测前，将所有试剂、标准品和样品恢复至室温。
  2. 确定ELISA板上用于标准品、对照品和大鼠血清样品所需的孔数。
  3. 按照ELISA试剂盒说明书的要求稀释大鼠血清样品以进行分析，例如在PBS中按1:10比例稀释。
  4. 通过系列稀释制备胰岛素标准品，以生成标准曲线，例如浓度范围为0至10 ng/mL。
  5. 将标准品、对照品和稀释后的大鼠血清样品（通常每孔50–100 µL）加入ELISA板指定的孔中。将试剂盒提供的检测抗体溶液加入每孔，确保均匀分布。
  6. 在室温下或按照说明书指定条件孵育一定时间（通常为1–2小时）。
  7. 孵育结束后，使用指定的洗涤缓冲液（通常为含0.05% Tween-20的PBS）清洗各孔，以去除未结合物质。根据试剂盒说明书进行3至5次洗涤，并确保每次洗涤后彻底移除残留液体。
  8. 向每孔加入底物溶液。底物将与结合到酶上的抗体发生反应，引起颜色变化；颜色强度与样品中胰岛素含量相关。按照试剂盒说明在避光条件下孵育一定时间，通常为15至30分钟。
  9. 向每孔加入终止液以终止比色反应。加入终止液后颜色变化将趋于稳定，通常变为黄色。
  10. 立即使用酶标仪在450 nm波长（或按试剂盒指定条件）测定每孔的光密度（OD）值。
  11. 通过绘制已知胰岛素标准品浓度与其对应的光密度（OD）值的关系曲线，生成标准曲线。
  12. 利用标准曲线及相应的OD值计算大鼠血清样品中的胰岛素浓度。胰岛素水平应以ng/mL或其他适当单位表示29。

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结果

光学显微镜分析

在第14天th 对导管细胞的每日观察显示，通过光学显微镜分析发现，细胞发生聚集并形成了类似胰岛的结构。这一结构变化表明，经过一定时间后，导管细胞通过进入有序的组织排列并获得类似胰岛的形态，改变了其形态学特征。细胞倾向于聚集的现象可能源于细胞间通讯及微环境的影响，该发现为胰岛细胞与导管细胞之间可能存在的转化过程提供了重要线索。图2 和 图5).

细胞培养分化阶段，显微镜图像；实验中的细胞生长与形态变化

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讨论

不同来源的类胰岛细胞功能潜力的研究在糖尿病研究领域引起了广泛关注。初步研究表明，当葡萄糖水平升高时，这些细胞能够释放胰岛素，提示其可能具备模拟天然胰岛功能的能力。研究人员利用双硫腙染色来验证类胰岛细胞与胰岛在表型上的相似性，这些细胞呈现出特征性的红色染色即为证据32。在糖尿病大鼠模型中进行移植实验的结果显示，类胰岛细胞控制血糖水平的能力与常规胰岛细胞相当33。

导管细胞向胰岛β细胞的转化是糖尿病治疗领域一个颇具前景的研究方向，尤其是通过胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其相关因子如ISX-9的作用机制。GLP-1因其能够刺激胰岛素生成并改善β细胞存活能力而被广泛认知，已成为胰腺细胞重编程中的关键因子。最新研究表明，GLP-1信号通路可促进胰腺α细胞向β细胞的转分化，这对于在糖尿病状态下恢复胰岛素分泌至关重要34。该过程涉及多种转录因子和信号通路的激活，从而实现细胞类型的转换，其中PDX-1和Ngn3的功能尤为关键，它们对维持β细胞特性具有重...

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披露

作者未报告任何潜在的利益冲突。

致谢

作者谨此感谢实验室团队对本研究所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠Sahar Pharma用于胰腺切除和细胞移植
10 mL 血清移液管 - 无菌康宁4488用于分离
24孔板Corning353047用于葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS） 
25 mL 血清移液管 - 无菌康宁4489用于分离
70% 乙醇 ISOLAB64-17-5大鼠消毒
聚维酮碘 Baticonol 1186大鼠消毒
Biocholl 1077SigmaL6715-BC用于胰腺纯化
Biocoll，密度 1.10 g/mLSigmaL6155-BC用于胰腺纯化
血糖仪和葡萄糖检测试纸On Call Plus用于测量血糖
BSASigmaA9418用于克雷布斯液的配制
CaCl₂Sigma57647902用于克雷布斯液的配制
导管组成：聚乙烯导管（静脉留置针） Bicakcilar24G 和 14G用于胰腺和肝脏 
离心赛默飞世尔科技ST1R Plus用于分离 
V型胶原酶， ≥ 1 FALGPA 单位/毫克固体，
>125 CDU/mg 固体 		SigmaC9263-1G用于胰腺消化
D-(+)-葡萄糖 Sigma50-99-7用于 GSIS 和 IPGTT
二苯硫腙（Dithizone, DTZ）SigmaD5130用于胰岛鉴定
DMSOSigmaD8779用于解决DTZ
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）—低葡萄糖 Gibco11885084用于细胞培养
Eppendorf管ISOLAB用于细胞洗涤
Falcon管（50 mL）ISOLABLB.IS.078.02.009用于分离
胎牛血清（FBS）SigmaN4637用于胰腺的分离与培养
细针及缝合材料（6-0 或 7-0 规格）PROLENE 蓝色 18" P-1 针头 | 8697G用于胰腺切除和细胞移植
胰高血糖素样肽1（GLP-1） Aladdinrp174144用于细胞培养
Hank's 平衡盐溶液（含 Ca-Mg 的 HBSS） 山羊座HBSS-1A用于酶的制备
不含钙、镁和酚红的HBSSBIOCHROM L2015用于胰腺分离
HEPESLonza用于细胞培养
胰岛素ELISAAlpco80-INSRT-E01用于胰岛素 ELISA
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）GibcoITS-G用于细胞培养
异噁唑-9（ISX-9） AladdinI304735-10mg用于细胞培养
KClSigma329820207用于克雷布斯液的配制
盐酸氯胺酮 200 mg/mLNexGen对于大鼠麻醉
层流柜Labor IldamBSC-1100IIA2-X用于分离与培养周期
兰氏针艾瑟特28 G用于测量血糖
L-谷氨酰胺 Sigma59202c用于胰腺的分离与培养
MgCl2Sigma329759772用于克雷布斯液的配制
酶标仪BioTek SynergyH1 多功能酶标仪用于胰岛素 ELISA
微孔板振荡器VWR 444-0270用于胰岛素 ELISA
显微外科手术显微镜EMZ-200TR 3.9X 用于胰腺切除和细胞移植
显微外科剪刀和镊子Aesculap用于胰腺切除和细胞移植
Millicell 悬挂式细胞培养插件，聚对苯二甲酸乙二醇酯 8.0µm MILLIPOREPIEP30R48 用于葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS） 
NaClSigma7647-14-5用于克雷布斯液的配制
NaHCO₃Sigma144-55-8用于克雷布斯液的配制
巴斯德吸管 3 mlBIOSIGMA用于分离
青霉素/链霉素 Sigma用于胰腺的分离与培养
磷酸盐缓冲液（PBS） BIOCHROM L1815细胞传代
牵开器（用于肝脏和结缔组织的固定）Aesculap用于胰腺切除和细胞移植
RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）山羊座RPMI-A用于胰腺的分离与培养
无菌棉签Dynarex用于胰腺切除和细胞移植
无菌注射器（10 mL）Ayset32MM 22G用于胶原酶反应
秒表KenkoKK613D对于腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）
链脲佐菌素（STZ） Sigma18883-66-4对于发生糖尿病的大鼠
注射泵滤器单元（GP-0.22） µm-3 mmMillexSLGP033RS用于细胞培养基的灭菌
T25 培养瓶Thermo130189用于培养
TrypLE Express 试剂Gibco细胞传代
水浴 Labor IldamALB128用于胶原酶反应
注射用2% (w/v) 氯胺酮溶液Rompun大鼠麻醉

参考文献

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