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方法文章

活细胞中代谢调控的Akt活化动态的Förster共振能量转移成像研究

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DOI：

10.3791/68075

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2025年5月23日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biocomplexity and Engineering Biology, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Futian Biomedical Innovation R&D Center, The Chinese University of Hong Kong, 3Ciechanover Institute of Precision and Regenerative Medicine, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Immunology and Microbiology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 6Department of Computer Science and IT, University of Southern Punjab

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于定量活体HepG2细胞中Akt激活及其磷酸化时空动态的实验方案。荧光共振能量转移（FRET）成像是一种强大的工具，可为癌细胞中胰岛素信号通路及代谢调控提供重要见解。

摘要

代谢调控的Akt激活是胰岛素信号级联中的一个关键节点，为研究糖尿病与癌症之间的关系提供了重要见解。为了精确量化HepG2细胞中的Akt活性，我们开发了一种稳健且可重复的实验方案，利用基于基因编码的Akt特异性生物传感器的荧光共振能量转移（FRET）技术。本方案详细描述了细胞培养、成像培养皿制备以及转染HepG2细胞以表达基于FRET的生物传感器的操作步骤，同时提供了激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件配置的具体指南。实验结果揭示了HepG2细胞中独特的胰岛素信号模式：表现为一种不可逆的开关行为，其特征是在达到特定开启阈值后出现持续性Akt激活，但缺乏关闭阈值；相比之下，肌管细胞则表现出可逆的开关行为。HepG2细胞中Akt的持续激活提示了肝细胞胰岛素抵抗和代谢失调的潜在机制，对理解代谢性疾病及癌症的发展进程具有广泛意义。该方案为在多种疾病背景下研究Akt相关信号通路和细胞行为提供了一个有价值的框架。

引言

糖尿病是一种主要的全球性健康挑战，其特征是胰岛素抵抗和葡萄糖稳态受损1。深入理解胰岛素信号通路对于阐明该疾病的病理生理机制至关重要，因为胰岛素在葡萄糖代谢、细胞生长和存活中发挥关键作用2。大量研究表明，胰岛素信号通路显著影响多种癌症，将胰岛素抵抗与肿瘤进展及患者不良预后联系在一起3,4,5,6。HepG2细胞是一种常用的肝细胞癌细胞系，是研究胰岛素抵抗以及代谢紊乱与癌症发展之间相互作用的有价值模型7。传统上，研究人员将胰岛素反应视为梯度式响应；然而，最近的研究发现，单个细胞可表现出双稳态响应，在特定胰岛素浓度阈值下出现从无响应到完全响应的显著转变8,9。

荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于研究活细胞中生物分子时空分布的有力工具10。通过提取分子动力学信息，FRET能够实时揭示Akt激活等过程，使其成为研究活细胞不可或缺的技术11,12。该成像方法在研究细胞动态过程方面已证明至关重要，特别是在代谢性疾病和癌症研究中，精确的分子相互作用尤为关键13。FRET还可实现对分子相互作用的实时监测，有助于阐明胰岛素抵抗和肿瘤进展等机制14,15。FRET生物传感器在癌症研究中至关重要，可用于研究肿瘤微环境、药物耐药性以及代谢紊乱16。FRET检测方法包括敏化发射（SE）、受体漂白（AB）、荧光寿命成像显微术（FLIM）和光谱学，每种方法在量化分子相互作用方面均具有独特优势17。SE通过测量供体与受体荧光团之间的能量转移，导致发射光谱发生可测量的变化，该变化与相互作用生物分子之间的接近程度相关18。AB利用选择性光漂白受体荧光团，并追踪供体荧光的变化，使研究人员能够评估相互作用的动力学过程和分子间距19。FLIM通过分析供体荧光团的荧光衰减速率，直接反映FRET效率，从而提供分子相互作用的精确纳米级测量结果20。

我们最近利用FRET技术，在C2C12来源的肌管细胞中证明了胰岛素反应的双稳态特性8,9,21,22,23,24。我们发现，Akt激活具有明显不同的开启和关闭阈值，这表明：尽管整体机体对胰岛素的剂量-反应呈梯度变化，但其背后从胰岛素刺激起始的亚细胞信号级联实际上更为复杂，并最终在单细胞水平上表现为“全或无”的响应模式21,22,23,24。为了检验其他细胞类型中是否存在双稳态，我们用不同浓度的胰岛素刺激HepG2细胞，并通过单细胞FRET成像记录其反应。我们使用Akt生物传感器在单细胞水平上监测Akt活性。该Akt生物传感器由增强型青色荧光蛋白（ECFP）25作为供体荧光基团，以及最亮的黄色荧光蛋白变体（YPet）26作为受体荧光基团，两者通过一段包含肽序列SGRPRTTTFADSCKP的Eevee连接子相连。该肽段可作为磷酸化Akt（pAkt）的底物，其序列经优化自人源糖原合酶激酶3β（GSK3β）。在未磷酸化状态下，供体与受体荧光基团之间的空间距离超过福斯特半径，从而抑制能量转移。当受到胰岛素刺激后，Akt发生磷酸化，进而导致SGRPRTTTFADSCKP肽段的磷酸化。这一过程引发构象变化，使供体和受体进入福斯特半径范围内，从而实现FRET27。因此，FRET信号强度与磷酸化Akt分子的数量相关，可实现对胰岛素介导的细胞反应进行实时定量分析。

本方案最初用于研究C2C12细胞系分化的肌管细胞中的胰岛素信号通路，已成功应用于HepG2细胞，并在不同硬件和软件平台上得以实施，从而证明了其适用性、可适应性与多功能性。HepG2细胞表现出组成型Akt活性，使其成为理想的 体外 用于研究肝脏特异性胰岛素信号转导及代谢过程的模型。本方案的关键步骤在方案部分中逐步详细描述。

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方案

图 1 展示了通过FRET活细胞成像监测单个HepG2细胞中Akt磷酸化实验步骤的总体流程。

1. 质粒的获取、扩增与纯化

注意：本节概述了用于单细胞 FRET 分析所需的质粒获取、扩增和纯化的关键步骤。

  1. 使用 pEevee-iAkt-NES-YPet 质粒（图 2A）。
    注意：该质粒由日本基础生物学研究所（NIBB）的 Kazuhiro Aoki 教授慷慨提供。用于 Akt 检测的 FRET 生物传感器及其相应对照的质粒图谱如 图 2 所示。在 FRET 实验中，pEevee-iAkt-NES-ECFP（供体；图 2B）和 pEevee-iAkt-NES-Ypet（受体；图 2C）质粒用作校准对照9。
    注意：图 3 展示了分子内 FRET 生物传感器的组成与作用机制。
  2. 为扩增质粒，使用化学感受态大肠杆菌（E. coli）细胞进行细菌转化（参见 材料表）。将转化后的细胞接种于含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，并在 37 °C 下过夜培养。次日，挑选一个具有氨苄青霉素抗性的单菌落，接种至添加了 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中进行培养，以扩增质粒。
  3. 为纯化质粒 DNA，使用市售的质粒 DNA 纯化试剂盒（参见 材料表）以获得高纯度和高产量。使用分光光度计（参见 材料表）测定吸光度比值（A260/A280 和 A260/A230）以评估 DNA 质量。比值在 1.8–2.0 和 2.0–2.2 范围内被视为最佳。通过琼脂糖凝胶电泳验证质粒完整性，确保其适用于转染实验。

2. 细胞培养步骤

注意：所有细胞培养操作均须在层流罩内进行，以维持无菌环境并防止污染。HepG2细胞培养流程见图4。HepG2细胞的完全培养基包含最低必需培养基（MEM）、10% 胎牛血清（FBS）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1 mM 丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺补充剂、100 U/mL 青霉素-链霉素以及2.5 µg/mL 抗生素-抗真菌溶液（参见材料表，表1）。

  1. 将冻存的 HepG2 细胞置于 37 °C 恒温混匀仪或水浴中，快速解冻至完全融化。
  2. 将解冻后的细胞转移至含有 10 mL 完全培养基的 15 mL 锥形管中（参见材料表）。
    注意：使用前将完全培养基预热至 37 °C，以尽量减少对细胞的热冲击。
  3. 在 200 x g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。
  4. 使用宽口移液吸头小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
  5. 用 10 mL 新鲜完全培养基重悬细胞沉淀。
  6. 将细胞悬液转移至 75 cm² 组织培养瓶中。
  7. 将培养瓶置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。
    注意：在接下来的 24–48 小时内观察细胞，确认其贴壁情况并评估恢复状态。换液前至少 4 小时内不要扰动细胞，以确保细胞充分贴壁。在最初 4 小时内避免频繁打开培养箱，以免影响细胞贴壁。所有细胞培养操作均应遵循所在机构的生物安全规程，并穿戴适当的个人防护装备（PPE），以确保安全的工作环境。为维持最佳生长条件并防止过度拥挤而影响细胞活力和增殖能力，当 HepG2 细胞达到 70%–80% 汇合度时进行传代培养。
  8. 传代时，吸除培养基，并用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞一次。
  9. 加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶，覆盖细胞单层（参见材料表）。
    注意：确保胰蛋白酶已预热至 37 °C，以获得最佳活性。避免过度消化细胞，否则可能降低细胞活力。在显微镜下观察细胞，确认其已脱离培养表面。
  10. 在 37 °C 下孵育约 5 分钟。
  11. 当细胞脱落后，加入 2 mL 完全培养基以中和胰蛋白酶，并用移液器收集细胞。
  12. 轻柔吹打细胞悬液，以打散细胞团块，获得单细胞悬液。
  13. 在每个新培养瓶中加入 3 mL 完全培养基，然后按 1:2 的传代比例将细胞分配至各瓶。
    注意：早期传代时采用 1:2 的稀释比例。传至第 4–5 代后，可根据情况适当采用 1:4 或 1:5 的稀释比例。
  14. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中培养。
    注意：24 小时后检查细胞，确认其贴壁并评估恢复情况。
  15. 常规培养时，每 2–3 天更换一次培养基；若 pH 指示剂由粉红色变为黄色（提示培养基酸化），则应提前换液。
    注意：避免培养基过度酸化，以免对细胞造成损伤。
  16. 定期在显微镜下检查细胞形态，以确保细胞健康。
    注意：短期保存可将 HepG2 细胞冻存于 -80 °C；长期保存应置于液氮中。本实验所用冻存液的组成见（表 2）。

3. 使用多聚赖氨酸包被成像培养皿

  1. 使用1 mL浓度为0.1 mg/mL的Poly-L-Lysine溶液覆盖每个成像培养皿的整个表面（参见 材料清单).
    注意：根据特定细胞类型的需求调整聚-L-赖氨酸浓度。
  2. 轻轻摇晃培养皿，使培养表面均匀覆盖。
    注意：整个操作过程中需确保无菌条件，以防止污染。
  3. 在室温（RT）下孵育培养皿过夜。
  4. 用移液器吸出培养皿中多余的聚-L-赖氨酸溶液。
  5. 用 PBS 冲洗表面三次，每次间隔 5 分钟（参见 材料清单). 完全去除成像培养皿中未结合的Poly-L-Lysine，以防止抑制细胞生长。轻轻冲洗培养板，避免刮擦或损坏玻璃底部。
  6. 将包被好的成像培养皿置于空气中晾干 37 °C 至少 3 小时。
  7. 立即使用包被的成像培养皿，或将其储存于 4 °C 长达2周。

4. HepG2 细胞的转染

注意：HepG2 细胞转染方法见图5。

  1. 在转染前24-48小时，将HepG2细胞接种于预先包被的成像培养皿中，确保细胞融合度达到70%-90%。
  2. 将转染试剂和编码FRET生物传感器的质粒在冰上解冻。充分涡旋混匀，并在使用前短暂离心（例如，5,000 × g 离心5秒）（参见材料表）。
    注意：确保转染试剂和质粒在使用前完全解冻。
    警告：避免反复冻融，以免降低转染试剂的效率。
  3. 将8 µg编码FRET生物传感器的质粒加入反应缓冲液中，定容至100 µL。在高速下涡旋混匀5秒（约3,000-5,000 × g）。
    注意：务必先将质粒加入缓冲液，再加入基于聚合物的转染试剂。溶液中至少应含有50 µL的反应缓冲液（参见材料表）。
  4. 向含有稀释后质粒DNA的离心管中加入2.4 µL转染聚合物。在高速下涡旋混匀15秒（约3,000-5,000 × g）。
    注意：每1 µg DNA应使用0.3 µL转染聚合物。
    警告：确保转染聚合物与质粒DNA充分混合，以形成均匀的纳米颗粒复合物。
  5. 将生物传感器与聚合物混合物在37 °C孵育15分钟，以促进纳米颗粒复合物的形成。
    注意：避免将转染聚合物在溶液中保存超过30分钟，以免降低转染效率。
    警告：仔细监控孵育时间，防止过度孵育导致转染效率下降。
  6. 在5,000 × g 离心5秒，使管内液体沉至管底，然后将全部100 µL纳米颗粒复合物溶液逐滴加入细胞培养基中。轻轻前后摇动培养板以混匀。
    注意：应将纳米颗粒复合物溶液逐滴加入，以确保其在细胞培养基中均匀分布。
    警告：避免剧烈摇动，以防细胞脱落或复合物分布不均。
  7. 将培养板置于37 °C孵育4小时至过夜。
    注意：孵育时间可根据实验需求调整，但通常4小时已足以实现高效转染。
    警告：避免长时间孵育（>16小时），以免降低细胞活力。
  8. 通过抽吸去除细胞上的纳米颗粒复合物，更换为2 mL新鲜完全培养基，并将培养板放回37 °C培养箱中继续培养至分析时间。转染后约48小时通常可达到表达峰值。
  9. 在荧光显微镜下分析细胞。
    注意：确保显微镜已正确校准用于荧光成像，以获得准确结果。
    警告：成像过程中应尽量减少细胞暴露于强光下，以避免光毒性。

5. HepG2 细胞的饥饿处理

注意：转染步骤完成后，在胰岛素刺激和FRET成像前对细胞进行无血清培养。这可以最大限度地减少因FBS中残留胰岛素导致的Akt通路激活，确保Akt活性具有稳定且一致的基线水平。本实验所用饥饿培养基的成分详见（表3）。BSA为粉末状，配制0.1%（w/v）溶液时，将0.1 g BSA溶于3 mL DMEM中，充分混匀。使用0.45 µm滤器过滤除菌，并补加DMEM定容至100 mL。

  1. 吸去培养基，用 1× PBS 洗涤成像培养皿两次，每次 5 分钟。
    注意：两次 PBS 洗涤有助于彻底去除残留的血清以及可能干扰实验的胰岛素或生长因子。
  2. 向成像培养皿中加入 2 mL 饥饿培养基（参见 材料表）。沿培养皿边缘轻柔加入培养基，避免细胞从玻璃底部脱落。在 37 °C 下孵育 4 小时。
    注意：4 小时孵育时间最有利于同步细胞代谢；但根据实验需求，孵育时间可适当延长。

6. HepG2 细胞的 FRET 活细胞成像

注意：本节提供用于监测单个 HepG2 细胞中 Akt 磷酸化时空动态的 FRET 活细胞成像操作说明。必须针对活 HepG2 细胞优化显微镜设置、操作流程和成像条件，具体如下所述。显微镜设置对于优化 FRET 成像的成像条件至关重要。请根据制造商的说明逐步完成计算机/共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的设置，以确保系统稳定运行。用于 FRET 成像的定制化 CLSM 配置如（图6）所示。

  1. 打开远程开关，为显微镜、计算机、扫描器、激光发射器、压电载物台和落射荧光LED光源供电。在通电前确保所有组件均已正确连接，以避免可能的损坏。
  2. 将激光发射器上的钥匙转至“ON”位置，并按下按钮以激活FRET所需的两束激光（457 nm和514 nm激光线）。
    注意：确保已设置适当的滤光片和参数，以获得最佳的FRET成像效果。激光线的选择应基于生物传感器的激发和发射光谱特性。
  3. 打开电源插座，为连接显微镜的计算机和显示器供电。
    注意：通电前请确保所有连接牢固，以防止设备损坏。
  4. 登录Windows系统并启动显微成像软件。
  5. 点击A1 进入采集模式，以启动成像设置。根据FRET实验的需求选择合适的光学配置。
  6. 根据需要调整激光功率和探测器灵敏度，以获得最佳成像条件。小心安装显微镜载物台顶部培养箱，并用螺丝固定。
    注意：切勿过度拧紧螺丝，以免损坏培养箱或显微镜载物台。
  7. 用无菌的双蒸水（ddH2O）填充内部水浴。牢固安装顶部加热器，并打开载物台加热器、水浴加热器和物镜加热器的电源（图7A）。
    注意：切勿过量加水，以防液体溢入系统。确保所有加热器正常工作，以维持活细胞成像所需的稳定温度环境。
  8. 使用40倍油浸物镜进行成像（见材料表）。
    注意：有关技术参数，请参考制造商官网。
  9. 用蘸有95%乙醇的镜头纸擦拭物镜。在物镜上滴加少量浸油（图7B）。将含有HepG2细胞的成像培养皿放置在显微镜载物台上，并用夹具固定（图7C）。
    注意：确保成像培养皿正确对齐并牢固固定，以防止成像过程中发生移动。避免对物镜施加压力，以防损坏物镜或培养皿的玻璃底面。
  10. 关闭培养室，将细胞在活细胞培养室中孵育1–2小时，使其达到平衡状态（图7D）。
  11. 在时间序列成像过程中，按特定时间间隔暂停，轻轻移除培养基（图7E），然后加入1 mL新配制的含指定胰岛素浓度的培养基（图7F，材料表）。
    注意：通过将1 mg胰岛素溶解于1 mL 10 mM乙酸中，配制1 mg/mL胰岛素储备液。使用0.2 µm无菌注射器滤器过滤溶液，并将分装样品储存在−20 °C。
  12. 从显微成像软件的文件 菜单中启动ND采集窗口。
    注意：ND采集设置如（图8）所示。
  13. 选择时间 选项卡，设置时间序列成像的时间间隔、持续时间和循环次数。然后点击XY 选项卡，按下+ 添加按钮，将单个HepG2细胞加入成像区域。
  14. 如需添加多个细胞，请定位合适细胞，进行扫描，精细调焦，并锁定点扩散函数（PSF）。对每个新增的成像细胞重复此步骤。在成像培养皿的不同位置扫描多个细胞，以识别并纳入多个目标细胞。
  15. 点击红色X图标以取消选择细胞。勾选'Z'框以设定Z轴位置。在完成所有参数设置后，在'文件名'框中输入实验名称。
  16. 点击浏览 选择目标文件夹，然后勾选保存到文件选项。点击立即运行选项卡以启动ND采集。ND采集窗口将实时显示时间序列成像的进度，包括已用时间和剩余时间。
  17. 在未用胰岛素刺激细胞的情况下，记录长达30分钟的基线数据。
  18. 定位合适细胞，通过放大/缩小使单个细胞聚焦，并选择荧光强度较高的细胞。逐个添加细胞，最多不超过6个。
    注意：限制细胞数量，以防止图像采集延迟或成像过程中窗口冻结。
  19. 设定时间序列成像的时间和成像频率，开始时间序列成像。
    注意：在开始成像前，确保所有参数（包括曝光时间和激光功率）均已优化。
  20. 定期暂停成像，轻轻移除玻璃底培养皿中的培养基，并加入1 mL补充了适当浓度胰岛素的培养基。
  21. 恢复图像采集。根据需要重复步骤6.20。
  22. 实验结束后，点击“完成”选项卡以关闭程序。安全备份并存储所获取的图像以供后续分析。

7. 数据分析

  1. 根据先前研究中所述的方案27,28,29,30（图9），使用成像软件对对照样品的预处理时间序列FRET成像数据进行光谱串扰和CFP自发荧光校正，从而获得校正后的FRET值和精确的FRET效率。

8. FRET 效率计算

  1. 为了确定FRET效率，需采集七幅图像：细胞（IDA(D), IDD(D), IDA(A), IAA(A), IDD, IAA，以及 IDA）。使用以下公式计算FRET效率：
    figure-protocol-1
    其中FRET已校正 由以下公式获得：
    figure-protocol-2
    与 d 和 a 定义为：
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
    这里 IDA, IDD，以及 IAA 表示用生物传感器转染的细胞的图像。 IDA(D) 和 IDD(D)）为仅含供体的对照图像，以及 IDA(A) 和 IAA(A) 是仅含受体的对照图像。

9. 图像采集

  1. IDA ：通过供体激发（434 nm）和受体发射（530 nm）获取图像。
  2. IDD ：通过供体激发（434 nm）和供体发射（477 nm）获取图像。
  3. IAA ：通过受体激发（517 nm）和受体发射（530 nm）获取图像。
  4. IDA(D) 和 IDA(A) ：采用与 IDA 相同的激发和发射条件，分别从仅表达供体和仅表达受体的细胞中获取图像。
  5. IDD(D) ：在与 IDD 相同的条件下，对仅含供体的对照样本进行成像。
  6. IAA(A) ：采用与 IAA 相同的条件获取图像，但专用于仅含受体的对照样本。

10. 背景校正

  1. 在计算机上打开图像分析软件。从顶部菜单栏中进入 文件 菜单，从下拉选项中选择 打开 或 打开文件。
  2. 浏览至包含延时图像数据的目录，找到需要分析的延时图像（例如 nd2 格式）。
  3. 选择该文件并点击 打开 或 确定，将其加载至软件中以进行查看和分析。在细胞内定义一个感兴趣区域（ROI）（或以整个细胞作为 ROI），并记录该区域内每个像素的灰度值。
  4. 选择一个无细胞区域作为背景，计算其平均灰度值。通过从细胞 ROI 内每个像素的灰度值中减去该背景平均值，生成校正后的图像。

11. 荧光共振能量转移串扰（串色）消除

注意：供体发射光与受体激发光之间的光谱重叠如图所示 图 3B，这对FRET效率和能量转移过程至关重要。在时间推移FRET成像中，串色是一个重要挑战，源于供体与受体荧光团的光谱重叠，导致测量结果不准确。由于供体和受体荧光团的光谱在一定程度上存在重叠，串扰是固有的现象（图3C，D）。这一问题会因荧光染料浓度过高和滤光片配置不当等因素而加剧。解决串色对于确保FRET测量结果的可靠性至关重要。

  1. 有关减轻串扰效应的方法，请参考之前的一项研究9。

12. 定量与统计分析

  1. 使用统计分析软件进行统计分析。

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结果

为研究HepG2细胞中Akt的活化情况，将细胞接种于预先包被的成像培养皿中，并转染基于FRET的生物传感器pEevee-iAkt-NES（图2A），该传感器旨在实现对Akt磷酸化过程的实时监测。转染后，细胞在无血清培养基中饥饿处理4小时，以同步其代谢状态并最小化基础胰岛素信号。

随后将细胞暴露于不同浓度的胰岛素（0 pM、300 pM、400 pM、500 pM、400 pM、100 pM 和 0 pM）中，以系统性地激活胰岛素信号通路。如图10A所示，Akt 磷酸化水平呈现剂量依赖性升高。值得注意的是，在胰岛素浓度为 300 pM 时，磷酸化水平显著上升，标志着 Akt 活化的最大阈值。超过该浓度后，磷酸化水平趋于平稳，在达到 500 pM 的过程中仅观察到缓慢增加。

有趣的是，当胰岛素浓度从 500 pM 逐步降低至 0 pM 时，Akt 的激活状态仍持续存在，其磷酸化水平保持升高，未能恢复至基础水平。这...

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讨论

用于监测HepG2细胞中Akt磷酸化的活细胞FRET成像方案包含多个关键步骤，以确保结果的可靠性和可重复性。第一步是细胞培养，包括常规的细胞维护、成像培养皿的包被以及细胞接种。在时间序列成像实验中，适当的包被对于细胞贴附至关重要，因为它能确保细胞稳定黏附，防止脱落并减少漂移，从而避免数据不一致9,32。细胞厚度或亚细胞结构的差异可能导致细胞部分区域失焦，影响测量准确性。温度、pH值和离子浓度会影响FRET信号并增加变异性33,34,35。良好的细胞贴附有助于维持细胞健康，保持信号通路的完整性，并确保FRET测量的准确性。将基于FRET的Akt生物传感器转染至HepG2细胞是一个关键步骤，因为转染效率直接影响FRET信号的强度和一致性31。然而，瞬时转染本身会导致生物传感器表达的异质性。通过...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作部分得到了深圳市自然科学基金（JCYJ20240813113606009）、深港科技创新合作区（HZQB-KCZYB-2020056）、国家自然科学基金（32070681）、国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2019YFA0906002）和深圳市孔雀计划（KQTD2016053117035204）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco货号#25200-056使用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞
15 mm 玻璃底细胞培养皿NEST货号#801001
2 mL Nalgene 冻存管赛默飞世尔科技货号#5012-0020
5 mL 移液管（血清学移液管）康宁货号#4487
95% 乙醇Kermel货号 C028005
A1 HD25/A1R HD25 共聚焦显微镜尼康https://www.nikon.com/放大倍数：40×，数值孔径（NA）：1.30，像素驻留时间：2.4 ms，像素尺寸：1024
氨苄青霉素Sigma-Aldrich货号#A9393
牛血清白蛋白（BSA）VWR生命科学货号 N208-10g
康宁 25 厘米2 矩形培养瓶康宁货号#430639
Countess 3 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000
Countess 细胞计数板载玻片赛默飞世尔科技http://www.thermofisher.com/#C10228
数字涡旋混合器赛默飞世尔科技https://www.thermofisher.com/
二甲基亚砜Sigma-Aldrich货号 D2650
Eppendorf Safe-Lock 离心管 1.5 mLEppendorf货号#022363204
EZ-PCR支原体检测试剂盒生物工业公司货号 20-700-20
胎牛血清，经鉴定，澳大利亚Gibco货号#10099141
GlutaMAX 补充剂Gibco货号#35050061
GraphPad Prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/
HepG2国家认证细胞库#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510  http://www.cellbank.org.cn/
37号浸油Cargille Laboratories货号 #16237
胰岛素Sigma-Aldrich货号 I5500-50MG37℃预热 °使用前将 C 放置
LB培养基（1x）Invitrogen货号#10855001
最低必需培养基（MEM）Gibco货号#1109508037℃预热 °使用前置于 C
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UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水Invitrogen货号#10977015
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参考文献

  1. GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
  2. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  3. Poloz, Y., Stambolic, V. Obesity and cancer, a case for insulin signaling. Cell Death Dis. 6 (12), e2037(2015).
  4. Arcidiacono, B., et al. Insulin resistance and cancer risk: an overview of the pathogenetic mechanisms. Exp Diabetes Res. 2012, 789174(2012).
  5. Godsland, I. F. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in the development and progression of cancer. Clin Sci (Lond). 118 (5), 315-332 (2009).
  6. Tsugane, S., Inoue, M. Insulin resistance and cancer: epidemiological evidence. Cancer Sci. 101 (5), 1073-1079 (2010).
  7. Yudhani, R. D., et al. In vitro insulin resistance model: A recent update. J Obes. 2023, 1964732(2023).
  8. Akhtar, J., et al. Bistable insulin response: The win-win solution for glycemic control. iScience. 25 (12), 105561(2022).
  9. Akhtar, J., Imran, M., Wang, G. Protocol for live-cell Forster resonance energy transfer imaging to reveal the bistable insulin response of single C2C12-derived myotubes. STAR Protoc. 5 (2), 103109(2024).
  10. Kamino, K., et al. Optimal inference of molecular interaction dynamics in FRET microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), e2211807120(2023).
  11. Kraft, A. E., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time visualization of second messengers in living cells. Methods Mol Biol. 1563, 85-90 (2017).
  12. Veeriah, S., et al. High-throughput time-resolved FRET reveals Akt/PKB activation as a poor prognostic marker in breast cancer. Cancer Res. 74 (18), 4983-4995 (2014).
  13. Conway, J. R. W., et al. Monitoring AKT activity and targeting in live tissue and disease contexts using a real-time Akt-FRET biosensor mouse. Sci Adv. 9 (17), eadf9063(2023).
  14. Chandris, P., Giannouli, C. C., Panayotou, G. Imaging approaches for the study of metabolism in real time using genetically encoded reporters. Front Cell Dev Biol. 9, 725114(2021).
  15. Yang, J., et al. Longitudinal FRET imaging of glucose and lactate dynamics and response to therapy in breast cancer cells. Mol Imaging Biol. 24 (1), 144-155 (2022).
  16. Mandrou, E., et al. A reliable system for quantitative G-protein activation imaging in cancer cells. Cells. 13 (13), 1114(2024).
  17. Fang, C., Huang, Y., Zhao, Y. Review of FRET biosensing and its application in biomolecular detection. Am J Transl Res. 15 (2), 694-709 (2023).
  18. Miller, J. N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis. Analyst. 130 (3), 265-270 (2005).
  19. Verveer, P. J., Rocks, O., Harpur, A. G., Bastiaens, P. I. Imaging protein interactions by FRET microscopy: FRET measurements by acceptor photobleaching. CSH Protoc. 2006 (6), (2006).
  20. Vu, C. Q., Arai, S. Quantitative imaging of genetically encoded fluorescence lifetime biosensors. Biosensors (Basel). 13 (10), 939(2023).
  21. Wang, G. A more holistic view of the logarithmic dose-response curve offers greater insights into insulin response. J Biol Chem. 301 (1), 108037(2025).
  22. Wang, G. Body mass dynamics is determined by the metabolic Ohm's law and adipocyte-autonomous fat mass homeostasis. iScience. 23 (6), 101176(2020).
  23. Wang, G. Raison d'être of insulin resistance: the adjustable threshold hypothesis. J R Soc Interface. 11 (101), 20140892(2014).
  24. Wang, G. Optimal homeostasis necessitates bistable control. J R Soc Interface. 9, 2723(2012).
  25. Heim, R., Tsien, R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6 (2), 178-182 (1996).
  26. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
  27. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nat Protoc. 8 (2), 265-281 (2013).
  28. Gordon, G. W., Berry, G., Liang, X. H., Levine, B., Herman, B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 74 (5), 2702-2713 (1998).
  29. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophys J. 45 (5), 939-946 (1984).
  30. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy. , US 6456734 United States Patent and Trademark Office (2002).
  31. Miura, H., Matsuda, M., Aoki, K. Development of a FRET biosensor with high specificity for Akt. Cell Struct Funct. 39 (1), 9-20 (2014).
  32. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122(2014).
  33. Rani, K., Sengupta, S. Multi-stimuli programmable FRET based RGB absorbing antennae towards ratiometric temperature, pH and multiple metal ion sensing. Chem Sci. 12 (47), 15533-15542 (2021).
  34. Betolngar, D. B., et al. pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins. Anal Bioanal Chem. 407 (14), 4183-4193 (2015).
  35. Salonikidis, P. S., et al. An ion-insensitive cAMP biosensor for long term quantitative ratiometric fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements under variable physiological conditions. J Biol Chem. 286 (26), 23419-23431 (2011).
  36. Youvan, D. C., et al. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy using genetically engineered GFP derivatives on nickel chelating beads. Biotechnol Alia. 3, 1-18 (1997).
  37. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry A. 99 (4), 407-416 (2021).
  38. Batta, A., Hajdu, T., Nagy, P. Improved estimation of the ratio of detection efficiencies of excited acceptors and donors for FRET measurements. Cytometry A. 103 (7), 563-574 (2023).
  39. Coullomb, A., et al. QuanTI-FRET: a framework for quantitative FRET measurements in living cells. Sci Rep. 10 (1), 6504(2020).
  40. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  41. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophys J. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  42. Hochreiter, B., Kunze, M., Moser, B., Schmid, J. A. Advanced FRET normalization allows quantitative analysis of protein interactions including stoichiometries and relative affinities in living cells. Sci Rep. 9 (1), 8233(2019).
  43. Liu, H., Zhang, F., Mishra, S. K., Zhou, S., Zheng, J. Knowledge-guided fuzzy logic modeling to infer cellular signaling networks from proteomic data. Sci Rep. 6, 35652(2016).
  44. Garrido-Rodriguez, M., Zirngibl, K., Ivanova, O., Lobentanzer, S., Saez-Rodriguez, J. Integrating knowledge and omics to decipher mechanisms via large-scale models of signaling networks. Mol Syst Biol. 18 (7), e11036(2022).
  45. Greenwald, E. C., Polanowska-Grabowska, R. K., Saucerman, J. J. Integrating fluorescent biosensor data using computational models. Methods Mol Biol. 1071, 227-248 (2014).
  46. Zhao, Z., Xia, J. Computational Approaches for Modeling Signal Transduction Networks. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  47. Wang, G., Krueger, G. R. Computational analysis of mTOR signaling pathway: bifurcation, carcinogenesis, and drug discovery. Anticancer Res. 30 (7), 2683-2688 (2010).
  48. Wang, G. Singularity analysis of the AKT signaling pathway reveals connections between cancer and metabolic diseases. Phys Biol. 7 (4), 046015(2010).
  49. Chedere, A., Hari, K., Kumar, S., Rangarajan, A., Jolly, M. K. Multi-stability and consequent phenotypic plasticity in AMPK-Akt double negative feedback loop in cancer cells. J Clin Med. 10 (3), 472(2021).
  50. Mosca, E., et al. Computational modeling of the metabolic States regulated by the kinase akt. Front Physiol. 3, 418(2012).
  51. Liao, J., Madahar, V., Dang, R., Jiang, L. Quantitative FRET (qFRET) technology for the determination of protein-protein interaction affinity in solution. Molecules. 26 (21), 6339(2021).
  52. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: Principle applications recent advances and challenges. Diagnostics (Basel). 13 (8), 1375(2023).
  53. Mattheisen, J. M., et al. Application of bioluminescence resonance energy transfer to quantitate cell-surface expression of membrane proteins. Anal Biochem. 684, 115361(2024).
  54. Lionetti, M. C., La Porta, C. A. M. FLIM-FRET investigation of heterogeneous huntingtin aggregation in HeLa cells. Methods Mol Biol. 2551, 595-604 (2023).
  55. Petutschnig, E. K., Pierdzig, L., Mittendorf, J., Niebisch, J. M., Lipka, V. A novel fluorescent protein pair facilitates FLIM-FRET analysis of plant immune receptor interaction under native conditions. J Exp Bot. 75 (3), 746-759 (2024).
  56. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Gotz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. J Vis Exp. 66, e4081(2012).

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活细胞中代谢调控的Akt活化动态的Förster共振能量转移成像研究
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