本文介绍了一种用于定量活体HepG2细胞中Akt激活及其磷酸化时空动态的实验方案。荧光共振能量转移（FRET）成像是一种强大的工具，可为癌细胞中胰岛素信号通路及代谢调控提供重要见解。
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本文内容
摘要
摘要
代谢调控的Akt激活是胰岛素信号级联中的一个关键节点，为研究糖尿病与癌症之间的关系提供了重要见解。为了精确量化HepG2细胞中的Akt活性，我们开发了一种稳健且可重复的实验方案，利用基于基因编码的Akt特异性生物传感器的荧光共振能量转移（FRET）技术。本方案详细描述了细胞培养、成像培养皿制备以及转染HepG2细胞以表达基于FRET的生物传感器的操作步骤，同时提供了激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件配置的具体指南。实验结果揭示了HepG2细胞中独特的胰岛素信号模式：表现为一种不可逆的开关行为，其特征是在达到特定开启阈值后出现持续性Akt激活，但缺乏关闭阈值；相比之下，肌管细胞则表现出可逆的开关行为。HepG2细胞中Akt的持续激活提示了肝细胞胰岛素抵抗和代谢失调的潜在机制，对理解代谢性疾病及癌症的发展进程具有广泛意义。该方案为在多种疾病背景下研究Akt相关信号通路和细胞行为提供了一个有价值的框架。
引言
糖尿病是一种主要的全球性健康挑战，其特征是胰岛素抵抗和葡萄糖稳态受损1。深入理解胰岛素信号通路对于阐明该疾病的病理生理机制至关重要，因为胰岛素在葡萄糖代谢、细胞生长和存活中发挥关键作用2。大量研究表明，胰岛素信号通路显著影响多种癌症，将胰岛素抵抗与肿瘤进展及患者不良预后联系在一起3,4,5,6。HepG2细胞是一种常用的肝细胞癌细胞系，是研究胰岛素抵抗以及代谢紊乱与癌症发展之间相互作用的有价值模型7。传统上，研究人员将胰岛素反应视为梯度式响应；然而，最近的研究发现，单个细胞可表现出双稳态响应，在特定胰岛素浓度阈值下出现从无响应到完全响应的显著转变8,9。
荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于研究活细胞中生物分子时空分布的有力工具10。通过提取分子动力学信息，FRET能够实时揭示Akt激活等过程，使其成为研究活细胞....
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方案
图 1 展示了通过FRET活细胞成像监测单个HepG2细胞中Akt磷酸化实验步骤的总体流程。
1. 质粒的获取、扩增与纯化
注意：本节概述了用于单细胞 FRET 分析所需的质粒获取、扩增和纯化的关键步骤。
- 使用 pEevee-iAkt-NES-YPet 质粒（图 2A）。
注意：该质粒由日本基础生物学研究所（NIBB）的 Kazuhiro Aoki 教授慷慨提供。用于 Akt 检测的 FRET 生物传感器及其相应对照的质粒图谱如 图 2 所示。在 FRET 实验中，pEevee-iAkt-NES-ECFP（供体；图 2B）和 pEevee-iAkt-NES-Ypet（受体；图 2C）质粒用作校准对照9。
注意：图 3 展示了分子内 FRET 生物传感器的组成与作用机制。 - 为扩增质粒，使用化学感受态大肠杆菌（E. co....
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结果
为研究HepG2细胞中Akt的活化情况，将细胞接种于预先包被的成像培养皿中，并转染基于FRET的生物传感器pEevee-iAkt-NES（图2A），该传感器旨在实现对Akt磷酸化过程的实时监测。转染后，细胞在无血清培养基中饥饿处理4小时，以同步其代谢状态并最小化基础胰岛素信号。
随后将细胞暴露于不同浓度的胰岛素（0 pM、300 pM、400 pM、500 pM、400 pM、100 pM 和 0 pM）中，以系统性地激活胰岛素信号通路。如图10A所示，Akt 磷酸化水平呈现剂量依赖性升高。值得注意的是，在胰岛素浓度为 300 pM 时，磷酸化水平显著上升，标志着 Akt 活化的最大阈值。超过该浓度后，磷酸化水平趋于平稳，在达到 500 pM 的过程中仅观察到缓慢增加。
有趣的是，当胰岛素浓度从 500 pM 逐步降低至 0 pM 时，Akt 的激活状态仍持续存在，其磷酸化水平保持升高，未能恢复至基础水平。这.......
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讨论
用于监测HepG2细胞中Akt磷酸化的活细胞FRET成像方案包含多个关键步骤，以确保结果的可靠性和可重复性。第一步是细胞培养，包括常规的细胞维护、成像培养皿的包被以及细胞接种。在时间序列成像实验中，适当的包被对于细胞贴附至关重要，因为它能确保细胞稳定黏附，防止脱落并减少漂移，从而避免数据不一致9,32。细胞厚度或亚细胞结构的差异可能导致细胞部分区域失焦，影响测量准确性。温度、pH值和离子浓度会影响FRET信号并增加变异性33,34,35。良好的细胞贴附有助于维持细胞健康，保持信号通路的完整性，并确保FRET测量的准确性。将基于FRET的Akt生物传感器转染至HepG2细胞是一个关键步骤，因为转染效率直接影响FRET信号的强度和一致性31。然而，瞬时转染本身会导致生物传感器表达的异质性。通过.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作部分得到了深圳市自然科学基金（JCYJ20240813113606009）、深港科技创新合作区（HZQB-KCZYB-2020056）、国家自然科学基金（32070681）、国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2019YFA0906002）和深圳市孔雀计划（KQTD2016053117035204）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 货号#25200-056 | 使用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞 |
| 15 mm 玻璃底细胞培养皿 | NEST | 货号#801001 | |
| 2 mL Nalgene 冻存管 | 赛默飞世尔科技 | 货号#5012-0020 | |
| 5 mL 移液管（血清学移液管） | 康宁 | 货号#4487 | |
| 95% 乙醇 | Kermel | 货号 C028005 | |
| A1 HD25/A1R HD25 共聚焦显微镜 | 尼康 | https://www.nikon.com/ | 放大倍数：40×，数值孔径（NA）：1.30，像素驻留时间：2.4 ms，像素尺寸：1024 |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | 货号#A9393 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR生命科学 | 货号 N208-10g | |
| 康宁 25 厘米2 矩形培养瓶 | 康宁 | 货号#430639 | |
| Countess 3 自动细胞计数仪 | 赛默飞世尔科技 | http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000 | |
| Countess 细胞计数板载玻片 | 赛默飞世尔科技 | http://www.thermofisher.com/#C10228 | |
| 数字涡旋混合器 | 赛默飞世尔科技 | https://www.thermofisher.com/ | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 货号 D2650 | |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管 1.5 mL | Eppendorf | 货号#022363204 | |
| EZ-PCR支原体检测试剂盒 | 生物工业公司 | 货号 20-700-20 | |
| 胎牛血清，经鉴定，澳大利亚 | Gibco | 货号#10099141 | |
| GlutaMAX 补充剂 | Gibco | 货号#35050061 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | |
| HepG2 | 国家认证细胞库 | #CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510 http://www.cellbank.org.cn/ | |
| 37号浸油 | Cargille Laboratories | 货号 #16237 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | 货号 I5500-50MG | 37℃预热 °使用前将 C 放置 |
| LB培养基（1x） | Invitrogen | 货号#10855001 | |
| 最低必需培养基（MEM） | Gibco | 货号#11095080 | 37℃预热 °使用前置于 C |
| mySPIN 12 微型离心机 | 赛默飞世尔科技 | https://www.thermofisher.com/ | |
| NanoDrop One | 赛默飞世尔科技 | https://www.thermofisher.com | |
| 尼康 Plan Fluor 40×/1.30 油镜 | 尼康 | https://www.nikon.com/ | |
| NIS-Elements-AR | 尼康 | https://www.nikon.com/ | |
| 非必需氨基酸（NEAA）（100倍浓缩液） | Gibco | Cat#11140050 | |
| One Shot LB 琼脂平板 | Invitrogen | 货号#A55802 | |
| One Shot Stbl3 化学感受态 E. coli | Invitrogen | 货号 C737303 | |
| Parafilm | PARAFILM | 货号#B8R05606 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Gibco | 货号#10010023 | |
| pEevee-iAkt-NES（7,033） bp | 三浦等人 al31 | https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 货号#15070063 | |
| 普乐消炎预防剂 | InvivoGen | 货号#ant-mpp | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴化物 | Sigma-Aldrich | 货号 P4832 | |
| 精密通用水浴锅 | 赛默飞世尔科技 | https://www.thermofisher.com/ | |
| QIAprep 旋转式质粒小提试剂盒 | QIAGEN | 货号#27106 | |
| SnapGene | SnapGene by Dotmatics | https://www.snapgene.com | |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Gibco | 货号#11360070 | |
| 注射器滤器，0.22 μm μm | Millipore | 货号#SLGP033RS | |
| 东海希特载物台培养箱 | TOKAI HIT | https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator | |
| UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水 | Invitrogen | 货号#10977015 | |
| Xfect 转染试剂 | Takara Bio | 货号#631317 |
参考文献
- GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
- Li, M., et al.
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