本文建立了一种基于质谱的蛋白质组学方法，利用福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中分离出的特定区域进行分析。该方案用于分析存档的福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中特定组织区域的蛋白质组。
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摘要
摘要
基于质谱（MS）的蛋白质组学能够对包括细胞、组织和体液在内的多种生物样本进行全面的蛋白质组分析。常用于长期存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，已成为蛋白质组学研究的宝贵资源。除了其存储优势外，研究人员还可通过与病理学家合作，从正常组织区域中分离出感兴趣的区域（ROIs）。尽管具有这些潜力，目前仍缺乏涵盖ROIs分离、蛋白质组样本制备及质谱分析的标准化实验流程。本方案介绍了一种整合了ROIs宏观解剖、基于悬浮液捕获的样本制备以及高通量质谱分析的一体化工作流程。通过该方法，对病理学家诊断为良性浆液性囊性肿瘤（SCN）和癌前病变导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）的患者FFPE组织中的ROIs进行了宏观解剖、收集和分析，实现了高覆盖率的蛋白质组检测。此外，成功鉴定了这两种不同类型的胰腺囊性肿瘤之间的分子差异，从而证明了该方法在推进基于FFPE组织的蛋白质组学研究中的适用性。
引言
几十年来，手术切除的人体组织一直以甲醛固定、石蜡包埋（FFPE）的形式存档。这些组织块最初可保持嵌入石蜡中的三维（3D）结构。随后使用切片机将组织切成薄片，贴附于载玻片上，并进行染色——通常采用苏木精-伊红（HE）染色或免疫组织化学（IHC）染色——以便经验丰富的病理学家进行组织病理学诊断1,2。由于甲醛引起的蛋白质交联能够抑制酶活性和蛋白水解作用，FFPE组织在长期保存方面具有显著优势3。因其支持构建大规模且保存完善的研究样本库，FFPE组织已被视为包括基因组学在内的多个领域生物标志物发现的基石4,5,6,7。
然而，它们在基于液相色谱-质谱法（LC-MS）的蛋白质组学中的应用在历史上一直存在挑战。其中一个主要限制是福尔马林引起的蛋白质交联，会干扰胰蛋白酶消化——这是全局蛋白质组分析中的关键步骤8。此外，从组织切片中可提取的蛋白质含量通常较少，使得传统的样品制备方法难以适用。尽管存在这些挑战，已有研究进展表明，....
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方案
本研究经首尔国立大学医院机构审查委员会批准（IRB编号：1904-114-1028）。所有参与者均签署书面知情同意书，同意参加本研究。本方案中使用的所有材料的详细信息见于 材料表.
1. 用于蛋白质组学样本制备的FFPE组织抗原修复
注意：确保手术刀及所有材料（如所用试管）均处于无菌状态，以避免任何交叉污染。本研究的方案可根据实验室条件进行微调，适用于任何福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。
- 从完整的FFPE组织块上切下10-µm厚的FFPE组织切片，并将其放置于玻璃载玻片上。
注意：本研究中使用了人胰腺囊肿FFPE组织（两种不同类型的囊性组织——SCN和IPMN）进行蛋白质组学样品制备。 - 小心使用二甲苯洗涤两次以去除FFPE组织中的石蜡（脱蜡）：第一次5分钟，第二次2分钟。
- 通过梯度乙醇溶液系列洗涤使组织再水化：依次在100%、85%、70%和50%乙醇中各洗涤3分钟，随后用去离子水冲洗。
注意：确保在通风橱内操作二甲苯和乙醇。
2. 福尔马林固定石蜡包埋组织蛋白质提取
- 准备一张由病理学家标记出感兴趣区域（ROI）的HE染色或免疫组化....
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结果
采用基于悬浮捕获滤膜的蛋白质组学样品制备方法，并结合单次数据非依赖性采集的无标记定量策略，应用于胰腺囊性福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的分析（图1）。在不同胰腺囊性FFPE组织的处理过程中，实现了精确的感兴趣区域（ROI）分离（图2A），从而获得各类胰腺囊性肿瘤生物学三重复样本间可重复的总离子色谱图（图2B）。液相色谱-质谱（LC-MS）分析共鉴定出9,703种蛋白质，在浆液性囊性肿瘤（SCN）和导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）中分别平均定量到7,886和8,273种蛋白质（图2C）。此外，在全部六个样本中总共鉴定出80,245个前体离子和75,412个肽段，SCN和IPMN的前体离子/肽段平均数量分别为55,729/51,488和63,573/59,519（图2D）。所有鉴定蛋白质的丰度跨越6.25个数量级，显示出全面的蛋白质组覆盖.......
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讨论
本方案介绍了一种快速高效的蛋白质组学方法，该方法利用固定于载玻片上的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中分离出的感兴趣区域（ROI），用于病理学诊断。当外科干预有利时，实体肿瘤（如癌症和囊肿）会被手术切除并保存用于病理学评估。为实现长期储存，组织经福尔马林固定并包埋于石蜡中（FFPE）。随后将FFPE组织块切成4-10 µm厚度的切片，置于载玻片上，进行抗原修复，并用HE或IHC染色。病理学家通过评估细胞形态及分子诊断标志物（如HER2、ER和PR）的表达情况，辅助做出诊断决策。
现代蛋白质组学能够在各种组织中对人类蛋白质组进行全面的定性和定量分析，并进一步开展全系统的分子研究。超高分辨率、超快速质谱仪以及高度可重复的液相色谱技术的进步在这些发展中起到了关键作用。此外，本方案整合了基于悬浮捕获（suspension trapping）装置的样品制备方法，显著缩短了实验时间，并结合了无需标记的数据非依赖性采集质谱技术（label-free data-independent acquisition-mass spectrometry, DIA-MS），实现了对福尔马林固定石蜡包埋.......
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致谢
本文中的所有图示均使用 BioRender（http://www.biorender.com）制作。本研究工作 由韩国国家研究 基金会（NRF）资助（资助编号： RS-2023-00253403 和 RS-2024-00454407）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈中0.1%甲酸（LC-MS级） | Fisher Chemical | LS120-212 | |
| 水中0.1%甲酸（LC-MS级） | Fisher Chemical | LS118-4 | |
| 0.5M TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
| 10% SDS | Invitrogen | 2679093 | |
| 1M TEAB（pH 8.5） | Sigma-Aldrich | 102545001 | |
| 1M Tris-cl（pH 8.5） | BIOSOLUTION | BTO21 | |
| A-14C离心机 | Satorious | 167709 | |
| 丙酮（HPLC级） | Fisher Scientific | A949-4 | |
| 乙腈（HPLC级） | J.T.Baker | 9017-88 | |
| 氯仿（HPLC级） | Thermo Scientific | 022920.k2 | |
| CR滤纸 | ADVANTEC | 70406001 | |
| DIA-NN ver 1.9 | 开源 | https://github.com/vdemichev/DiaNN | 蛋白质组学搜索引擎 |
| EPOCH2酶标仪 | Agilent | 2106208 | |
| 乙醇 | MERCK | K50505283 836 | |
| 甲酸（LC-MS级） | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Ingenuity信号通路分析（IPA） | QIAGEN | 830018 | 生物信息学工具 |
| 冷冻干燥仪（SRF110R+蒸气捕集器） | Thermo Scientific | SRF-110-115 | |
| 甲醇（HPLC级） | MERCK | UN1230 | |
| Microplate BCA蛋白检测试剂盒-兼容还原剂 | Thermo Scientific | 23252 | |
| MSConvert | 开源 | http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml | 质谱数据转换软件 |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Scientific | MA10813C | 质谱仪 |
| PepMAP RSLC C18分离柱 | Thermo Scientific | ES903 | |
| Perseus | 开源 | https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html | 统计分析工具 |
| PIERCE氯乙酰胺无称量格式 | Thermo Scientific | A39270 | |
| PIERCE定量比色肽检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23275 | |
| 微孔板振荡器 | Green SSeriker | VS-202D | |
| 探头式超声破碎仪 | VibraCellTM | VCX750 | |
| 蛋白质低吸附管 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| QSP 10 µL移液器吸头 | Thermo Scientific | TLR102RS-Q | |
| QSP 300 µL移液器吸头 | Thermo Scientific | TLR106RS-Q | |
| 手术刀 | Bard-Parker | 372615 | |
| S-Trap：快速通用质谱样品制备试剂盒 | PROTIFI | CO2-mini-40 | |
| SureSTART小瓶 0.2 mL | Thermo Scientific | 6pk1655 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Sigma-Aldrich | 102614284 | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382 | |
| 胰蛋白酶/Lys-C（LC-MS级） | Promega | V5073 | |
| Vanquish NEO | Thermo Scientific | 8348249 | 液相色谱系统 |
| 水（HPLC级） | Honeywell | AH365-4 | |
| Xcalibur ver 4.7 | Thermo Scientific | 30966 | 质谱数据采集软件 |
| 二甲苯 | Sigma-Aldrich | 102033629 |
参考文献
- Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
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