使用选定组织区域进行基于质谱的蛋白质组学的简化方法

Summary

在这里，我们建立了一种基于质谱的蛋白质组学方法，使用福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中的分离感兴趣区域。该方案用于分析存档的福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中特定组织区域的蛋白质组。

Abstract

基于质谱 （MS） 的蛋白质组学能够对各种生物样品（包括细胞、组织和体液）进行全面的蛋白质组分析。福尔马林固定、石蜡包埋 （FFPE） 组织切片通常用于长期存档，已成为蛋白质组学研究的宝贵资源。除了储存优势外，研究人员还可以通过与病理学家的合作，将感兴趣区域 （ROI） 与正常组织区域分离出来。尽管具有这种潜力，但仍然缺乏一种简化的蛋白质组学实验方法，包括 ROI 分离、蛋白质组学样品制备和 MS 分析。在该方案中，提出了一种结合了 ROI 宏观解剖、基于悬浮液捕获的样品制备和高通量 MS 分析的集成工作流程。通过这种方法，对病理学家诊断的良性浆液性囊性肿瘤 （SCN） 和癌前导管内状粘液性肿瘤 （IPMN） 组成的患者 FFPE 组织的 ROI 进行肉眼解剖、收集和分析，蛋白质组覆盖率高。此外，成功鉴定了两种不同的胰腺囊性肿瘤之间的分子差异，从而证明了这种方法在推进 FFPE 组织蛋白质组学研究方面的适用性。

Introduction

几十年来，手术切除的人体组织一直以福尔马林固定、石蜡包埋 （FFPE） 块的形式存档。这些组织块最初保留了包埋在石蜡中的三维 （3D） 结构。随后使用切片机对组织进行切片，安装在载玻片上，并进行染色 - 通常用苏木精和伊红 （HE） 或免疫组织化学 （IHC） 染色 - 以方便经验丰富的病理学家进行组织病理学诊断 ^1,2。由于福尔马林诱导的蛋白质交联会阻止酶和蛋白水解活性，因此 FFPE 组织在长期储存方面具有明显的优势³。由于 FFPE 组织支持构建大型、存档良好的样本集，因此一直被视为包括基因组学在内的不同领域生物标志物发现的基石 4,5,6,7。

然而，它们在基于液相色谱-质谱 （LC-MS） 的蛋白质组学中的应用历来面临挑战。一个关键的限制是福尔马林诱导的蛋白质交联，它会干扰胰蛋白酶消化 -- 这是整体蛋白质组分析的关键步骤⁸。此外，从组织载玻片中可回收的少量蛋白质通常使传统的样品制备方法不适用。尽管存在这些挑战，但进展表明，蛋白质交联可以通过长时间的高温处理来逆转 ^9,10,11。同时，针对低定量蛋白质样品优化的样品制备方法扩大了 FFPE 组织在蛋白质组学研究中的应用 12,13,14,15。

在蛋白质组学中使用 FFPE 组织载玻片的一个显著优势在于它们能够进行区域特异性分析。FFPE 玻片通常同时包含病变和邻近正常组织 （ANT）。不加选择地分析整个组织可能会因混合分子特征而导致结果混淆。相比之下，分离和分析感兴趣区域 （ROI） —— 病变与 ANT —— 能够更精确地表征特定于病理区域的分子特征。因此，基于 FFPE 的方法在蛋白质组学研究中越来越受欢迎 16,17,18,19,20。尽管它们的应用越来越多，但逐步描述整个蛋白质组学实验的简化工作流程仍然稀缺。特别是，基于视频的协议尚未发布。

本研究建立了一种基于 LC-MS 的稳健蛋白质组学工作流程，用于准确分析病变特异性区域内的分子变化。使用两名病理学家诊断的 FFPE 组织，对良性浆液性囊性肿瘤 （SCN） 和癌前导管内状粘液性肿瘤 （IPMN） 的 ROI 进行肉眼解剖、收集和分析。该方案包括 ROI 的宏观解剖、基于悬浮液捕获的样品制备，针对最少的蛋白质起始量进行了优化，以及窄范围数据非依赖型采集 （DIA）-MS 分析。该方法能够从大约 1 cm² 的组织区域鉴定出 9,000 多种蛋白质，破译与 SCN 和 IPMN 相关的不同蛋白质组学特征。

Protocol

本研究由首尔大学医院机构审查委员会 （IRB No. 1904-114-1028） 审查和批准。所有参与者都提供了参与研究的书面知情同意书。有关本协议中使用的所有材料的详细信息，请参见 材料表。

1. 用于蛋白质组学样品制备的 FFPE 组织抗原修复

注意：确保手术刀和所有材料（例如使用的管子）都是无菌的，以避免任何交叉污染。本研究的方案可以适用于任何 FFPE 组织，只需根据实验室设置进行微小修改。

1. 从整个安装的 FFPE 组织块上切下 10 μm FFPE 组织切片，并将它们放在载玻片上。
   注意：在本研究中，人胰腺囊肿 FFPE 组织（两种不同类型的囊性组织 - SCN 和 IPMN）用于蛋白质组学样品制备。
2. 小心地用二甲苯洗涤两次去除 FFPE 组织的石蜡（脱蜡）：一次 5 分钟，另一次 2 分钟。
3. 通过用分级乙醇混合物连续洗涤来再水化组织：在 100%、85%、70% 和 50% 乙醇中各 3 分钟，然后用去离子水冲洗。
   注意：确保在化学通风橱中处理二甲苯和乙醇。

2. FFPE 组织蛋白提取

1. 准备一张 HE 或 IHC 染色的组织载玻片，病理学家在其上指示 ROI。
2. 将未染色的组织载玻片和染色的组织载玻片背面相对放置，将它们对齐在一起。确保通过载玻片观察 ROI。
3. 使用手术刀去除不感兴趣的组织区域。
   注意：如果需要分析相邻的正常组织，请将它们收集在其他试管中。
4. 使用手术刀将组织 ROI 刮到载玻片的中心，然后将它们转移到干净的 1.5 mL 低蛋白结合管中。
5. 向每个试管中加入 180 μL 十二烷基硫酸钠 （SDS） 裂解缓冲液（5% SDS、2 mM 三（2-羧乙基）膦）[TCEP]、300 mM pH 8.5 Tris-HCl 的去离子水溶液）。
   注：确保裂解缓冲液的体积足以在超声处理过程中溶解组织并悬浮提取的蛋白质。缓冲液不足会导致组织裂解不完全，而过多的缓冲液可能会稀释蛋白质裂解物。
6. 以 20% 的振幅进行探针超声处理，应用 10 个 5 秒开和 5 秒关的周期。
7. 将样品在 100 °C 下以 1,000 x g 孵育 3.5 小时。
   注：在孵育过程中，每小时对样品进行 1 分钟的水超声处理，以实现高效的蛋白质提取。
8. 孵育后，在室温 （RT） 下冷却样品 10 分钟。在 RT 下以 16,000 x g 离心样品 10 分钟，以从上清液中分离组织碎片。
9. 将上清液收集到干净的标记管中，并将其储存在 -80 °C 直至进一步使用。

3. FFPE 组织裂解物的蛋白质定量

注：大多数用于蛋白质定量的二辛可宁酸测定步骤均基于制造商的说明，并稍作修改。建议根据制造商的指南制备试剂。

1. 通过连续稀释储备溶液（2 mg/mL BSA）来制备不同浓度的牛血清白蛋白 （BSA） 标准品。如有必要，用 20 或 40 倍的稀释因子稀释样品。
2. 准备去离子水作为空白，准备 SDS 裂解缓冲液作为样品对照。
3. 将 9 μL 标准品、空白、样品对照和样品移液至微孔板孔的中心。
4. 向每个孔中的样品中加入 4 μL 相容性试剂溶液。
5. 盖上板，在板振荡器上以中速混合 1 分钟。之后，将板在 37 °C 下孵育 15 分钟。
6. 向每个孔中加入 260 μL BCA 工作试剂，然后将板在 37 °C 下孵育 30 分钟。
7. 在 RT 下冷却板 3 分钟。
8. 在读板器上测量孔在 562 nm 处的吸光度。
9. 从所有样品和样品对照的吸光度值中减去空白的 562 nm 吸光度值。
10. 此外，从所有样品的吸光度值中减去空白减去样品对照的 562 nm 吸光度值。
11. 绘制并使用标准曲线来确定每个样品的蛋白质浓度。
    注：确保从 FFPE 组织的三个载玻片中提取估计的 200-250 μg 蛋白质，每个载玻片的面积约为 1 cm²。

4. 蛋白质的丙酮沉淀

注：确保总共使用 100-300 μg 蛋白质进行丙酮沉淀和基于悬浮捕获的蛋白质消化。

1. 将蛋白质样品（相当于 100-300 μg）放入与丙酮兼容的试管中。
2. 向试管中加入 -20 °C 丙酮，体积为样品体积的 5 倍。
3. 将混合物在 -20 °C 下孵育 18 小时。
4. 将试管以 16,000 x g 离心 15 分钟。
5. 小心处理上清液，不要干扰蛋白质沉淀。
6. 加入 500 μL -20 °C 丙酮并重复步骤 4.4-4.5。
7. 风干样品。

5. 基于悬浮捕获的蛋白质消化

注：基于悬浮捕集滤膜的蛋白质消化程序改编自制造商的说明，稍作修改。

1. 制备悬浮捕获裂解缓冲液（5% SDS、5 mM TCEP、50 mM pH 8.5 TEAB 的去离子水溶液）。
2. 向样品管中加入 40 μL 缓冲液并彻底涡旋以溶解风干的蛋白质沉淀。
3. 将样品在 100 °C 下孵育，以 1,000 x g 振荡 35 分钟。
4. 向样品中加入 10 μL 烷基化试剂（100 mM 氯乙酰胺 [CAA] 溶于 100 mM pH 8.5 四乙基溴化铵 [TEAB] 中）。
5. 在 RT 下以 300 x g 摇动孵育 1 小时。
6. 谨慎制备酸化剂（10% 三氟乙酸 [TFA] 的去离子水溶液）。确保在化学通风橱中处理 TFA（一种强酸）。
7. 向样品中加入 5 μL 酸化剂，使最终浓度为 1% TFA（最终样品体积：55 μL）。
8. 使用 pH 试纸检查样品的 pH 值。确保 pH 值小于 1。
9. 向样品中加入 350 μL 结合/洗涤缓冲液-1（0.1 M pH 8.5 TEAB，溶于 90% 甲醇中）以捕获蛋白质。
   注：在蛋白质捕获过程中避免涡旋和离心（步骤 5.9），以防止样品损失。足量的蛋白质可确保形成具有半透明外观的可见胶体蛋白颗粒。
10. 将悬浮捕获柱放入 2 mL 试管中，然后将整个样品（包括任何不溶性材料）转移到悬浮捕获柱中。
11. 将色谱柱以 4,000 x g 离心 50 秒以捕获蛋白质。
    注：确保所有样品都通过色谱柱;如果没有，请重复离心直至完全过滤。
12. 向色谱柱中加入 400 μL 洗涤缓冲液-2 （50 % CHCl 3 / 50 % MeOH），以 4000 x g 离心 50 秒，然后丢弃流出液。
13. 重复步骤 5.12 三次。
14. 加入 400 μL 缓冲液-1，以 4000 x g 离心 50 秒，然后丢弃流出液。
15. 重复步骤 5.14 三次。
16. 以 4000 x g 离心 1.25 分钟，以确保缓冲液-1 的整个通道。
17. 将悬浮捕获柱转移到新的样品管中进行酶消化。
18. 向悬浮捕获柱中加入 125 μL 消化缓冲液（0.16 μg/μL 胰蛋白酶/Lys-C，溶于 50 mM pH 8.5 TEAB 中）并加盖以防止蒸发。
    注：胰蛋白酶/Lys-C 比率应为 1：10（重量/重量）。确保至少 10 μg 胰蛋白酶/Lys-C 用于有效消化。
19. 在 37 °C 下孵育 18 小时，不要摇晃。
20. 制备以下洗脱缓冲液：缓冲液-1（50 mM pH 8.5 TEAB，溶于去离子水中）、缓冲液-2（0.2 % FA，溶于去离子水中）和缓冲液-3（50 % 乙腈 [ACN] 溶于去离子水中）。
21. 向悬浮捕获柱中加入 80 μL 洗脱缓冲液-1，并以 4000 x g 离心 1.25 分钟。
22. 用 80 μL 洗脱缓冲液-2 和缓冲液-3 重复步骤 5.20。
23. 汇集洗脱的肽，并将其转移到干净的新试管中。

6. 肽定量

注：定量比色肽测定的大多数步骤均根据制造商的说明改编，并稍作修改。建议根据制造商的指南制备试剂。

1. 通过连续稀释标准品的储备溶液 （1 mg/mL） 来制备一系列标准品。如果需要，使用 4 或 5 的稀释因子稀释样品。
2. 制备去离子水作为空白，并以等比例制备洗脱缓冲液-1、缓冲液-2 和缓冲液-3 的混合物作为样品对照。
3. 将 20 μL 标准品、空白样、样品对照品和样品放入每个微孔板孔的中心。
4. 向每个孔中加入 180 μL 工作试剂，并在板振荡器上充分混合板 1 分钟。
5. 盖上板并将板在 37 °C 下孵育 20 分钟。
6. 让板在 RT 下冷却 3 分钟。
7. 使用读板器测量孔在 480 nm 处的吸光度。
8. 从所有样品和样品对照的吸光度值中减去空白的 480 nm 吸光度值。
9. 此外，从所有样品的吸光度值中减去空白减去样品对照的 480 nm 吸光度值。
10. 绘制并使用标准曲线计算每个样品的肽浓度。

7. 液相色谱-质谱分析

1. 肽定量后，冻干 20 μg 肽。
2. 在超声处理浴中，将肽重新溶解在 40 μL 水性缓冲液（3% ACN 和 0.1% 甲酸 [FA] 水）中 10 分钟。所得肽浓度为 0.5 μg/ μL。
3. 将样品以 16,000 x g 离心 60 分钟，然后将样品转移到样品瓶中进行 MS 分析。
4. 使用 NANO LC-MS/MS 系统的自动进样器进样每个样品 2 μL。
5. 在反相色谱柱（0.075 mm 内径 x 150 mm 色谱柱，填充有 3 μm C18 材料，使用 5%-35% 乙腈的 127 分钟梯度，100 nL/min 的条件下分离肽。通过纳喷雾离子源电离肽，并将其转移到基于 Trackrap 的质谱仪中。
6. 使用窄范围数据非依赖型采集方法分析肽²¹.
7. 应用以下 MS 参数设置：MS m/z 范围：495-745，目标分辨率：15000，AGC 目标：3 x 10E6，最大进样时间：自动，MS/MS 窗口：用户定义（补充文件 1），目标分辨率：45000，AGC 目标 3 x 10E6，最大进样时间：自动，HCD 碰撞能量：22%、26%、30%。
   注：建议在分析前通过分析标准样品来对仪器进行初始质量检查。使用 MS 数据采集软件配置参数（参见 材料表）。

8. 蛋白质组学搜索数据分析

注：对于 MS 原始数据的蛋白质组学搜索，使用开源工具转换 LC-MS 数据格式并执行蛋白质组搜索（参见 材料表）。用于数据分析的参数详见 补充文件 2.有关开源工具的基本使用说明，请参阅 材料表中包含的链接。

1. 使用开源软件将从 LC-MS 获得的原始 MS/MS 谱图 （*.raw） 转换为 *.mzML 格式。
2. 使用格式转换的原始文件 （*.mzML） 作为开源搜索引擎的输入来执行蛋白质组搜索。
3. 根据 补充文件 2 中指定的参数启动蛋白质组学搜索。

9. 统计分析

注：对于识别差异表达蛋白的统计分析，使用开源工具进行单变量分析（例如，学生 t 检验;请参阅 材料表）。建议通过 材料表中提供的链接参考开源工具的基本使用说明。

1. 将已识别的蛋白质列表 （*.txt） 导入开源工具。
2. 将样本分类为组。对于这项研究，指定了两组： SCN 和 IPMN。
3. 对丰度值执行 Log₂ 变换，以调整数据分布以近似正态分布。
4. 应用过滤步骤以去除缺失值的蛋白质。在本研究中，每组中至少需要两个有效值才能纳入。
5. 使用基于正态分布的方法插补缺失值，以生成定量蛋白质的综合列表，用于后续的单变量分析。
6. 执行学生 t 检验以鉴定两组之间差异表达的蛋白质。在这项研究中，应用了 Benjamini-Hochberg 错误发现率 （FDR） 校正。
7. 提取满足以下条件的差异表达蛋白：Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 和 |倍数变化|≥ 2.

10. 生物信息学分析

注：使用商业生物信息学工具进行过度表征分析（例如，Ingenuity 途径分析，请参阅 材料表）。在使用此工具之前，建议参考制造商的说明。

1. 将 DEP （*.txt） 列表导入到商业工具中。
2. 启动核心分析以执行过度表示分析。
3. 使用 Fisher 精确检验 （调整后的 p 值< 0.05） 输出从 DEPs 中富集的重要经典通路。确定与研究相关的感兴趣途径。

Results

将已建立的基于悬浮捕获过滤器的蛋白质组学样品制备与使用单次数据非依赖性采集的无标记定量相结合，应用于胰腺囊性 FFPE 组织（图 1）。在不同的胰腺囊性 FFPE 组织中实现了 FFPE 组织处理过程中的精确 ROI 分离（图 2A），从而在每种类型的胰腺囊性肿瘤的生物三重复之间获得了可重现的总离子色谱图（图 2B）。LC-MS 分析鉴定了 9,703 种蛋白质，并分别定量了 SCN 和 IPMN 的平均 7,886 种和 8,273 种蛋白质（图 2C）。此外，在所有六个样品中共鉴定出 80,245 个前体和 75,412 个肽，SCN 和 IPMN 的平均前体/肽分别为 55,729/51,488 和 63,573/59,519 个（图 2D）。所有鉴定蛋白质的丰度跨越 6.25 个数量级，表明蛋白质组覆盖度全面（

Discussion

该协议概述了一种快速有效的蛋白质组学方法，该方法利用从安装在载玻片上的 FFPE 组织切片中分离的 ROI 进行病理诊断。当手术干预有利时，通过手术切除实体瘤（例如癌症和囊肿）并保留以进行病理评估。为了长期储存，将组织固定在福尔马林中并包埋在石蜡 （FFPE） 中。然后将 FFPE 组织块切片至 4-10 μm 的厚度，安装在载玻片上，进行抗原修复，并用 HE 或 IHC 染色。病理学家评估细胞形态和分子诊断标志物（例如 HER2、ER 和 PR）的表达，以帮助做出诊断决策。

现代蛋白质组学能够对各种组织中的人类蛋白质组进行全面的定性和定量分析，并进一步进行全系统的分子分析。超高分辨率、超快速质谱仪和高度可重现的液相色谱技术的进步在这些发展中发挥了关键作用。此外，该方案还集成了基于悬浮液捕获设置的样品制备，这显着减少了实验时间和无标记数据非依赖性采集质谱 （DIA-MS） 策略，为 FFPE 组织切片的 ROI 提供了快速和高度全面的蛋白质组学分析。与基于标记的方法不同，无标记蛋白质组学不需要报告基因标记试剂，因此...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% FA 的 ACN 溶液（LC-MS 级）	Fisher Chemical	LS120-212
0.1% FA 的水溶液（LC-MS 级）	Fisher Chemical	LS118-4
0.5M TCEP	Thermo Scientific	77720
10% SDS	Invitrogen	2679093
1M TEAB （pH 8.5）	Sigma-Aldrich	102545001
1M Tris-cl （pH 8.5）	BIOSOLUTION	BTO21
A-14C 离心机	Satorious	167709
丙酮（HPLC 级）	Fisher Scientific	A949-4
ACN（HPLC 级）	J.T.Baker	9017-88
CHCl3（HPLC 级）	Thermo Scientific	022920.k2
CR 纸	ADVANTEC	70406001
DIA-NN 版本 1.9	开源	https://github.com/vdemichev/DiaNN	蛋白质组学搜索引擎
EPOCH2 微孔板检测仪	Agilent
乙醇	MERCK	K50505283 836
FA（LC-MS级）	Fisher Chemical	A117-50
Ingenuity Pathway Analysis （IPA）	QIAGEN	830018	生物信息学工具
冻干器（SRF110R+vaper trap）	Thermo Scientific	SRF-110-115
MeOH（HPLC级）	MERCK	UN1230
微孔板 BCA 蛋白检测试剂盒 - 兼容还原剂	Thermo Scientific	23252
MSConvert	开源	http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml	MS 数据转换软件
Orbitrap Exploris 480	Thermo Scientific	MA10813C	MS
PepMAP RSLC C18 分离柱	Thermo Scientific	ES903
Perseus	开源	https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html	统计工具
PIERCE 氯乙酰胺无重量规格	Thermo Scientific	A39270
PIERCE 定量比色肽测定	Thermo Scientific	23275
板式摇床	绿色 SSeriker	VS-202D
探头超声仪	VibraCell TM	VCX750
蛋白 LoBind 管 1.5 mL	Eppendorf	22431081
QSP 10 µL 移液器吸头	Thermo Scientific	TLR102RS-Q
QSP 300 µL 移液器吸头	Thermo Scientific	TLR106RS-Q
手术刀	Bard-Parker	372615
S 型捕集阱：快速通用型 MS 样品制备	PROTIFI	CO2-mini-40
SureSTART 样品瓶 0.2 mL	Thermo Scientific	6pk1655
TFA	Sigma-Aldrich	102614284
ThermoMixer C	Eppendorf	5382
胰蛋白酶/Lys-C（LC-MS 级）	Promega	V5073
Vanquish NEO	Thermo Scientific	8348249	LC
水（HPLC 级）	霍尼韦尔	AH365-4
Xcalibur ver 4.7	Thermo Scientific	30966	MS 数据采集软件
二甲苯	Sigma-Aldrich	102033629