缺乏脆性 X 信使核糖核蛋白的人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞的产生和表征

摘要

在这里，我们描述了一种促进人诱导多能干细胞分化为功能性前脑特异性星形胶质细胞的方案。这使得研究神经胶质细胞在神经发育障碍（如脆性 X 综合征）发病机制中的作用，以及对其他脑部疾病进行建模。

摘要

脆性 X 综合征 （FXS） 是自闭症谱系障碍和智力障碍的主要遗传原因，已使用啮齿动物模型进行了广泛研究。最近，人类干细胞衍生的模型系统也被用于获得对 FXS 病理生理学的机制见解。然而，这些研究几乎完全集中在神经元上。此外，尽管越来越多的证据表明神经胶质细胞在健康和疾病的神经元功能中起关键作用，但人们对人类星形胶质细胞如何受到 FXS 的影响知之甚少。

因此，在这项研究中，我们成功开发了一种协议，该协议捕获了大脑发育的关键时空里程碑，并与胶质细胞生成过程保持一致。总之，这为研究神经发育障碍提供了一个有用的框架。首先，我们将人诱导的多能干细胞模式化为神经外胚层谱系，具有母亲双重抑制因子对抗 Decapentaplegic （SMAD） 抑制和小分子。随后，我们利用特异性生长因子和细胞因子生成对照 （CTRL） 和 FXS 患者来源的星形胶质细胞祖细胞 （APC）。用睫状神经营养因子（一种分化细胞因子）处理 APC 调节并驱动祖细胞走向星形胶质细胞成熟，产生前脑特异性胶质纤维酸性蛋白表达星形胶质细胞。

我们发现这些星形胶质细胞是功能性的，它们对 ATP 应用的钙反应证明了这一点，并且它们在 FXS 中表现出失调的糖酵解和线粒体代谢。综上所述，这些发现为研究神经发育障碍引起的星形胶质细胞功能改变的细胞自主和非细胞自主后果提供了一个有用的人类来源实验平台。

引言

脆性 X 综合征 （FXS） 是智力障碍和自闭症谱系障碍 （ASD） 的一种常见遗传形式，是由于缺乏由脆性 X 信使核糖核蛋白 1 （FMR1） 基因（OMIM：#300624，https://www.omim.org/entry/300624）产生的脆性 X 信使核糖核蛋白 （FMRP） 引起的。FMRP 在 mRNA 翻译的调节、mRNA 颗粒的形成和转运以及 microRNA 介导的基因表达调节中发挥作用¹。因此，FMRP 的缺失不仅影响大脑发育，还影响成人大脑功能。大脑中 FMR1 的 mRNA 转录水平和 FMRP 的免疫染色均显示高神经元表达，同时在神经胶质细胞中也显著表达²。然而，FXS 动物模型中的绝大多数早期研究主要集中在神经元及其功能的畸变上。因此，人们对神经胶质细胞在 FXS³ 中的作用知之甚少。传统上被认为是“被动支持”细胞⁴ ，越来越多的证据表明星形胶质细胞在介导广泛的神经元功能 ^5,6 中至关重要，包括促进突触发生⁷、发育中的神经回路^{的优化 8} 和神经递质再循环⁹。同时，越来越多的证据表明星形胶质细胞在疾病发病机制中的作用，并且许多神经系统疾病与星形胶质细胞功能障碍有关¹⁰。

虽然使用 FXS 动物模型的大部分早期工作都集中在识别和验证神经元中用于治疗 FXS 的各种分子靶标，但这些临床前发现并不总是能带来成功的临床结果。此外，最近临床试验的挫折也凸显了对基于人类的模型系统的需求。基于人类干细胞来源的脑细胞的神经系统疾病模型提供了一种强大的策略，可以弥合动物研究的机制见解与患者临床结果的有限成功之间的差距。然而，这些研究中只有少数集中在星形胶质细胞上，而且大部分是起源于脊髓的星形胶质细胞。反过来，鉴于研究表明星形胶质细胞的结构和功能在大脑区域之间有所不同^11,12，^这与此相关。因此，更好地了解人类星形胶质细胞疾病诱导的变化还需要考虑到星形胶质细胞的这些大脑区域特异性差异。然而，使用前脑特异性的人类干细胞衍生星形胶质细胞的神经发育障碍模型仍然相对未得到充分探索¹³。因此，为了开始解决这些差距，我们描述了从携带 FXS 突变的患者来源的诱导多能干细胞 （iPSC） 生成前脑特异性星形胶质细胞的方案;此外，我们表明星形胶质细胞具有功能并表现出改变的新陈代谢。

方案

所有使用人诱导多能干细胞 （hiPSC） 的实验（表 1）均在获得适当的机构监管批准后进行。 图 1A 表示 hiPSC 到成熟前脑特异性星形胶质细胞的完全分化方案。

1. hiPSC 的维持和扩增

1. 在接种 iPSC 前一天，在 Advanced Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/Ham's F-12 （DMEM/F12） 中涂覆 1：60 稀释的基质胶（细胞外基质 [ECM]）的 6 孔培养皿中，并储存在 2-8 °C。
   注：避免在 2-8 °C 下存放 Matrigel 包被的培养皿 >5 天，因为这可能会导致 ECM 中的蛋白质随着时间的推移而降解。为避免培养皿干燥，请在 6 孔培养皿的每孔中涂上至少 1 mL 的 1：60 稀释的 Matrigel，并均匀地涂抹在培养皿中。如果当天使用，请将板保存在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中 1 小时。
2. 在培养 hiPSC 的当天，去除涂层材料，加入 1 mL 完全 Essential 8 培养基（含 Essential 8 补充剂的 E8 基础培养基）以及终浓度为 1x 的 ROCK 抑制剂，并将培养皿保存在 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中，然后再添加 hiPSC。
3. 将 hiPSC 重悬于完全 E8 培养基中，并以 1x 终浓度的 ROCK 抑制剂重悬，以更好地粘附菌落。
   注意：请勿制备大量培养基。最多准备 3-4 天，并在 2-8 °C 下储存。
4. 第二天，补充不含 ROCK 抑制剂的 E8 完全培养基，直到细胞达到 80% 汇合（大约 4-5 天）。
5. 当它们达到 80% 汇合时，用酶法分离菌落。
   1. 要传代 iPSC，请从培养皿中取出用过的培养基，并以 1：1 的比例每孔添加 1 mL 预热 （37 °C） 胶原酶 （2 mg/mL） 和分散酶 （1 mg/mL） 混合物，并在 37 °C 下孵育 20-30 分钟以上，以使 iPSC 集落提升。
      注意：不要将培养皿在 37 °C 下放置超过 20-30 分钟;超过这段时间，菌落会解体，细胞会死亡。
6. 当菌落开始隆起时，从培养箱中取出培养皿，加入 2 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 来中和酶活性。
7. 用 DPBS 刮掉菌落，并使用大口径 10 mL 血清移液管将悬浮液收集在 15 mL 锥形管中。
8. 使用 10 mL 血清移液管轻轻研磨悬浮液 2-3 次以打碎菌落，并让菌落沉淀。
   注意：不要将菌落制成单个细胞;这可能导致细胞不粘附在培养皿上并导致更多细胞死亡。此外，不要将它们作为大群落;这将导致以后出现更多分化的菌落。
9. 一旦菌落沉淀下来（大约 2 分钟后），吸出 DPBS 酶混合物，在试管中留下大约 1 mL。
10. 向试管中加入 2 mL DPBS，敲击混合菌落，并让它们沉淀。重复此作 2 次以去除菌落中的所有残留酶。^{第 2 次} 洗涤后，尽可能多地去除上清液，将菌落重悬于 1 mL 完全 E8 培养基中，然后按照步骤 1.2-1.3 中的说明接种在新鲜制备的培养皿中。
11. 或者，使用 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 作为冷冻保护剂溶液冷冻保存一部分菌落，以备将来扩增和使用。
    1. 通过将 90% 完全 E8 培养基和 10% DMSO 作为冷冻保护剂溶液混合来新鲜制备冷冻保存培养基，并将其置于 2-8 °C 直至使用。
12. 要冷冻保存，请按照步骤 1.5-1.10作。
13. 在步骤 1.10 中，^{第 2 次} 洗涤后，让菌落沉淀并去除上清液。向菌落中加入 1 mL 新鲜制备的冷冻存培养基，然后转移至冻存管中。
    注：将冻存培养基添加到菌落中后，将内容物快速转移到冻存管中。延迟可能会导致较低的复苏率，因为 DMSO 是一种会损害细胞的冷冻保护剂。
14. 立即将冻存管移至冻存盒中，并在 -80 °C 冰箱中保存过夜。
15. 第二天，将所有冻存管移至液氮罐（LN₂ 罐）中以备将来使用。
    注意：对于任何异常，应使用 G 带（补充图 S1）对 hiPSC 进行常规核型分析，使用免疫细胞化学表征多能性（图 1B），并检测支原体。
    1. 为了使用免疫细胞化学表征 hiPSC，将菌落接种在 1：60 基质胶包被、高压灭菌的 13 mm 玻璃盖玻片上。一旦它们达到 40% 汇合，用 PBS-T（PBS-0.1% 吐温 20）洗涤细胞，用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，用 PBS 中的 0.3% Triton X-100 透化 10 分钟，然后用 PBS 中的 3% 牛血清白蛋白 （BSA） 封闭 1 小时以防止非特异性结合。
    2. 封闭后，将培养物与一抗孵育 1 小时，然后用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后相应的二抗（材料表）在黑暗中孵育 1 小时。
    3. 将盖玻片安装在带有安装介质的载玻片上，并通过 405 nm、488 nm、561 nm 和 633 nm 的共聚焦激光扫描获取图像。以 512 x 512 像素拍摄图像;将 Z 步长设置为 0.5 μm，针孔直径为 1 个艾里单位。

2. 星形胶质细胞祖细胞 （APC） 的产生和表征

1. 如步骤 1.5-1.10 中所述，酶促提升 hiPSC，并将它们接种到非粘附悬浮培养皿 （100 mm） 上，化学定义的培养基¹⁴ 含有 50% Iscove 改良的 Dulbecco 培养基 （IMDM）、50% 火腿的 F-12 营养混合物 （F12）、5 mg/mL BSA、1% 化学定义的脂质浓缩物 （CD-Lipid）、450 μM 单硫甘油、7 μg/mL 胰岛素、15 μg/mL 转铁蛋白、 1% 青霉素-链霉素补充前脑模式有丝分裂原 N-乙酰半胱氨酸 （1 mM）、LDN 193189 （0.1 μM） 和 SB431542 （10 μM），持续 7 天。
   注：小分子抑制剂 SB431542 和 LDN-193189 （LDN） 是骨形态发生蛋白和转化生长因子-β 信号通路的抑制剂。
   从那时起，培养基每 2 天补充一次或按照周一/周三/周五方案进行补充。
2. 在常氧条件下，将细胞悬液以 40 rpm 的转速放在轨道振荡器上 7 天，以帮助皮质球的发育（图 1A）。
3. 第 8 天，将皮质球转移到含有 Advanced DMEM/F12 和 1% 抗生素-抗真菌剂、1% N2 补充剂、1% 谷氨酰胺替代品、0.1% B27 补充剂和 2.5 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 的细胞增殖培养基中，持续 7 天。
4. 通过将它们置于含有 1% 抗生素抗真菌剂、1% N2、1% 谷氨酰胺替代品、0.1% B27 补充剂的高级 DMEM/F12 的高级 DMEM/F12 的神经胶质浓缩培养基中，诱导球体的神经胶质规格，20 ng/mL 表皮生长因子 （EGF）、bFGF-H（20 ng/mL bFGF-5 mg/mL 肝素）2 周以获得早期胶质球（图 1A）。
5. 对于早期胶质球的成熟，用 20 ng/mL 白血病抑制因子 （LIF） 代替 bFGF-H，并将球体维持 4 周。
6. 在成熟培养基中 4 周后，将球体长时间保持在神经胶质浓缩培养基中。为防止聚集和活力损失，每 2 周使用无菌工业刀片机械切碎胶质球，并用 DNase I 替换整个培养基，以去除切碎产生的 DNA 片段。
7. 使用木瓜蛋白酶解离试剂盒将胶质球解离成单层 APC，并接种到细胞培养物处理的贴壁培养皿上，以 1：80 稀释度稀释的基质胶涂层。
8. 在神经胶质细胞富集培养基中繁殖 APC，直到 80% 汇合，并使用酶细胞分离培养基进行酶促传代（参见 材料表）。
9. 段落：
   1. 取出用过的培养基并收集在锥形管中。向细胞中加入酶细胞分离培养基并等待 1-2 分钟。一旦细胞开始分离，加入用过的培养基以中和酶活性。
   2. 收集细胞悬液并以 800 x ɡ 离心 2 分钟。
   3. 吸出上清液，将细胞重悬于神经胶质浓缩培养基中，然后将大约 1 x 10⁶ 个细胞/孔接种到 1：80 基质胶包被的 6 孔培养皿中。
10. 对于冷冻保存：
    1. 将细胞重悬于 90% 皮质球增殖培养基（不含 bFGF）和 10% 冷冻保护剂的冷混合物中。将重悬的细胞转移到冻存管中。
    2. 立即将冻存管移至冻存箱中，并在 -80 °C 冰箱中保存过夜。
    3. 第二天，将所有冻存管移至液氮罐（LN₂ 罐）中以备将来使用。
       注：使用 10% DMSO 冷冻保存 APC 直至第 6 次传代。
11. 通过用波形蛋白和核因子 IA （NFIA） 标记物（如图 1C、D）进行免疫染色（如步骤 1.15.1-1.15.3 中所述）来表征解离的 APC（稀释度见 材料表 ）。
12. 为了确认 hiPSC 衍生的 APC 的前脑区域特异性，使用实时 qPCR 测试细胞的前脑标志物，例如人叉头盒 G1 （hFOXG1）（阳性）和后脑标志物，例如人同源盒 B4 （hHOXB4）（阴性）（图 1E，F）。
    注：用于这些实验的引物序列已列于 补充表 S1 中。

3. 前脑特异性星形胶质细胞同质种群的产生和表征

1. 星形胶质细胞与 APC 的分化
   1. 使用星形胶质细胞分化培养基 （ADM） 14 天，将 APC 分化为星形胶质细胞。星形胶质细胞分化培养基含有 Neurobasal、1% 抗生素-抗真菌剂、1% 谷氨酰胺替代品、1% N2 补充剂、0.2% B27 补充剂、1% 非必需氨基酸培养基 （NEAA） 和 10 ng/mL 睫状神经营养因子 （CNTF）。
   2. 通过使用免疫染色（如步骤 1.15.1-1.15.3 中所述）和神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 和 S100β 表达标记物（图 2A、B）来确认星形胶质细胞的身份。
2. APC 和星形胶质细胞中的从头蛋白质合成
   1. 将 hiPSC 衍生的前脑 APC 和星形胶质细胞维持在无菌高压灭菌的 13 mm 玻璃盖玻片上，并按照步骤 1.15.1-1.15.3 中的说明对其进行免疫染色。
   2. 对于 从头 蛋白质合成，使用荧光非经典氨基酸标记 （FUNCAT） 方法，在步骤 3.2.3-3.2.6 中简要解释（图 3A）。
   3. 为确保蛋氨酸缺乏，从培养物中取出生长培养基，并更换为不含蛋氨酸和半胱氨酸的培养基，该培养基与 1 mM L-叠氮基高丙氨酸 （AHA） 混合，在 37 °C 和 5% CO₂ 下混合 30 分钟。
   4. 用 PBS-T 洗涤培养物，用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，用 0.3% Triton X-100 在 PBS 中透化 10 分钟，然后用 3% BSA 在 PBS 中封闭 1 小时以防止非特异性结合。
   5. 将培养物在室温下与 Click 细胞化学反应混合物和炔烃 Alexa Fluor 647 在黑暗中孵育 1 小时，然后用一抗孵育 1 小时，用相应的二抗（材料表）孵育 1 小时（图 3B）。
   6. 将盖玻片安装在带有安装介质的载玻片上，并使用它们进行进一步的图像分析。
      1. 通过 405 nm、488 nm、561 nm 和 633nm 的共聚焦激光扫描获取图像。
      2. 以 512 x 512 像素拍摄图像;将 Z 步长设置为 0.5 μm，针孔直径为 1 个艾里单位。
      3. 将显微镜和成像参数保持在不同细胞类型的恒定设置。在同一会话中捕获每个生物复制的图像。
      4. 使用任何标准图像分析软件（例如 Fiji 或 Imaris）进行强度测量。在 Imaris 中，使用 SURFACES 模块产生细胞体的体积测量，其中 Vimentin （APCs） 和 GFAP（星形胶质细胞）限制体素范围 （250-350） 以去除碎片。
         注：保持两种细胞类型的所有生物学重复的参数。
3. 腺苷 5′-三磷酸 （ATP） 诱导的振荡钙波
   1. 将星形胶质细胞以 5 × 10^{3 个细胞} /皿的浓度接种在玻璃底培养皿 （35 mm） 上，以测量细胞对 ATP 的反应。
   2. 让细胞粘附在玻璃底部 24 小时，用不含钙的 HBSS（20 mM HEPES、137 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM 葡萄糖、1 mM MgCl_2，pH = 7.3）洗涤 3 次，并在培养基中与 5 μM 比率的公制染料 Fura-2AM 和 0.02% Pluronics F127 在室温下孵育 1 小时。
      注：Fura-2AM 是一种对光和温度敏感的化学品;储存在 -20 °C。
   3. 孵育后，用培养基洗涤 2 次，并替换为含有 HBSS 的 2 mM Ca²⁺ ，并在焦点漂移补偿倒置显微镜中使用 60 倍油物镜 （1.35 NA） 以 2 FPS 的速度对细胞进行成像。
   4. 通过在第 25^秒 时以 5 mM 的终浓度 ATP 浸泡来记录 ATP 诱导的钙反应（图 4A）。
   5. 使用 Fiji/ImageJ 在每个细胞周围绘制感兴趣的区域，并计算所有时间点的 F 340 / F380 比率（图 4B）。
4. 细胞代谢检测
   注意：根据制造商的方案测量活细胞的耗氧率 （OCR） 和细胞外酸化率 （ECAR）（参见 材料表）。
   1. 测定前一天，让星形胶质细胞粘附在 CNTF 培养基中的微孔板（1.5 × 10⁴ 接种密度）上，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
   2. 对于糖酵解应激测定：
      1. 用补充有 2 mM 谷氨酰胺（pH 调节至 7.4）的基础培养基替换细胞培养基，并在 37 °C 的非 CO₂ 室中孵育 1 小时。
         注意：必须在 37 °C 水浴中调节 pH 值。
      2. 将卡板插入仪器以校准传感器。校准后，用终浓度为以下试剂盒组分的细胞培养板更换卡盒板：10 mM 葡萄糖、1 μM 寡霉素和 50 mM 2-脱氧葡萄糖 （2-DG）（图 5A）。
      3. 在测试结束时，裂解细胞并估计总蛋白含量。
   3. 对于线粒体应激测定：
      1. 在 37 °C 的水浴中，用补充有 2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸、10 mM 葡萄糖（pH 调节至 7.4）的基础培养基替换 CNTF 培养基。
      2. 将板在 37 °C 的非 CO₂ 室中孵育 1 小时。同时，将卡板插入仪器以校准传感器。
      3. 校准后，用终浓度为以下试剂盒组分的细胞培养板更换卡板：1.5 μM 寡霉素、1 μM 羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙 （FCCP） 和 0.5 μM 鱼藤酮/抗霉素 A（图 5C）。
      4. 在测试结束时，裂解细胞并估计总蛋白含量。

结果

使用市售的成分明确的培养基维持人诱导多能干细胞 （hiPSC） 集落，并对多能性标志物 Oct4 和 Nanog 进行免疫染色（图 1B）。FXS 和 CTRL APC 显示对 vimentin 和 NFIA 免疫阳性的细胞具有相当的高度富集比例（图 1C、D）。我们发现，与 HOXB4 相比，来自健康和 FXS hiPSCs 的 APC 显示 FOXG1 的显着上调（图 1F），与主要的前脑身份一致。我们观察到与 CTRL 星形胶质细胞相比，FXS 组中表达 GFAP 的星形胶质细胞的数量显着减少，而不会影响表达 S100β 的星形胶质细胞的数量（图 2B）。Western blot 分析显示，由两个 FXS 系产生的星形胶质细胞均缺乏 FMRP 的表达（

讨论

在这里，我们描述了一种生成人 iPSC 衍生的星形胶质细胞的方法，该方法用作表征 FXS 诱导的功能变化的检测平台。这些星形胶质细胞在培养中具有功能活力并表现出各种特性，本研究中进行的一系列测量证明了这一点。该方案中的一个关键步骤是使用酶促提升方法将 iPSC 初始转化为皮质球。在此阶段，优化 IV 型胶原酶和分散酶的孵育时间至关重要。如果不进行优化，可能会导致 iPSC 崩解或形成单细胞，从而阻止皮质球的形成。这些皮质球使用双重 SMAD 抑制¹⁵ 向前脑特异性模式化，并进一步分化为星形胶质细胞祖细胞 （APC）。为了实现高 APC 数量，胶质球的机械切碎至关重要。实时 qPCR 可用于确认前脑特异性;我们观察到 FOXG1（前脑标志物）与脊髓标志物 HOXB4 相比，倍数变化显著增加。

然后使用 CNTF（JAK-STAT 信号通路的激活剂¹⁶）将 APC 分化为星形胶质细胞。这项...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-硫代甘油	Sigma-Aldrich	M6145
Accutase 溶液	Sigma-Aldrich	A6964	酶细胞分离培养基
腺苷 5&′-三磷酸镁盐	Sigma-Aldrich	A9187
高级 DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12634010
抗生素-抗真菌药 （100x）	ThermoFisher Scientific	15240062
B-27 补充剂 （50x），无血清	ThermoFisher Scientific	17504044
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418
化学成分明确的脂质浓缩物	ThermoFisher Scientific	11905031
原酶，IV 型，粉末	ThermoFisher Scientific	17104019
脱氧核糖核酸酶 I	Worthington Biochemical Corporation	LK003170
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
分散酶 II，粉末	ThermoFisher Scientific	17105041
DPBS，无钙，无镁	ThermoFisher Scientific	14190144
Essential 8 培养基	ThermoFisher Scientific	A1517001
FXS1、FXS2	科里尔医学研究所	GM07072，GM05848	FXS 患者细胞
GlutaMAX 补充剂	赛默飞世尔科技	35050061	谷氨酰胺替代品
火腿的 F-12 营养混合物	赛默飞世尔科技	11765054
健康对照细胞	松-西奈医疗中心	ND30625	健康对照细胞 
来自猪肠粘膜的肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3149
IMDM	ThermoFisher Scientific	12440053
胰岛素，人	氏	11376497001
LDN 193189	Stratech Scientific	S2618-SEL
白血病抑制因子人	Sigma-Aldrich	L5283
基质胶 生长因子还原 （GFR） 基底膜基质	Corning	354230
MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）	ThermoFisher Scientific	11140050
小鼠 FGF-碱性 （FGF-2/bFGF） 重组蛋白	Peprotech	450-33
Mr. Frosty 冷冻容器	ThermoFisher Scientific	5100-0001	冷冻箱
N-2 补充剂 （100x）	ThermoFisher Scientific	17502048
N-乙酰基-L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165
神经基础培养基	ThermoFisher Scientific	21103049
Nunc 生物样本库和细胞培养低温管	ThermoFisher Scientific	377267
Nunc 细胞培养处理 6 孔培养皿	ThermoFisher Scientific	140675
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington Biochemical Corporation	LK003150
青霉素-链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122
重组人 CNTF 蛋白，CF	R&D Systems	257-NT-010
重组人 EGF 蛋白，CF	R&D Systems	236-EG-01M
RevitaCell 补充剂 （100x）	ThermoFisher Scientific	A2644501
SB431542	Tocris	1614
Seahorse XFe24 分析仪	安捷伦科技
Seahorse XF 细胞 Mito 应激测试套件	安捷伦科技	103015-100
Seahorse XF 糖酵解应激测试套件	安捷伦科技	103020-100
组织培养皿-100 厘米	Biostar Lifetech	TCD000100
转铁蛋白	氏	10652202001
VWR 剃须刀Blades	VWR International	55411-050
抗体 <
strong>一抗	Company	目录号<	strong>稀释
Oct4 （C-10）	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279	稀释度：1：250 二抗：山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 568
Nanog	R&D Systems	AF1997	稀释度：1：100 二抗：驴抗山羊 IgG、Alexa Fluor 488
波形蛋白	Abcam	Ab5733	稀释度：1：500 二抗：山羊抗鸡 IgY、Alexa Fluor 488
NFIA	Abcam	Ab41851	稀释度：1：500 二抗：山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 568
GFAP-cy3	Sigma	C9205	稀释度：1：500 二抗：NA
GFAP	DAKO	Z0334	稀释度：1：500 二抗：山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 568
S100β	DAKO	IR504	稀释度：1：500 二抗：山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 488
抗核抗体、克隆 235-1	Merck Millipore	MAB1281	稀释度：1：1000 二抗：山羊抗小鼠 IgG1、Alexa Fluor 555
二抗 <			strong>稀释
山羊抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11004	1：1000
驴抗山羊 IgG，Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	1：1000
山羊抗鸡 IgY，Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11039	1：1000
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11011	1：1000
山羊抗兔 IgG，Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11034	1：1000
山羊抗小鼠 IgG1，Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	答21127	1：1000