紫草素对脓毒症所致急性肺损伤小鼠HIF-1α/VEGF信号通路的影响

摘要

本实验方案旨在评估紫草素在缓解小鼠脓毒症所致急性肺损伤方面的有效性。通过靶向HIF-1α/VEGF通路，研究探讨了不同剂量的紫草素对生存率、肺部病理变化及炎症标志物表达的影响，凸显其潜在的治疗作用。

摘要

脓毒症常导致急性肺损伤（ALI），这是一种高死亡率的并发症。HIF-1α/VEGF 通路在脓毒症中发挥关键作用，而紫草素是一种具有抗炎特性的天然化合物，可能通过靶向该通路缓解肺损伤。将 Balb/c 小鼠随机分为四组：假手术组、模型组、低剂量治疗组和高剂量治疗组。假手术组仅进行剖腹手术，不进行盲肠结扎穿刺（CLP）；模型组则通过 CLP 诱导脓毒症相关急性肺损伤。造模后，低剂量和高剂量治疗组分别以 12.5 mg/kg 和 50 mg/kg 的剂量经灌胃给予紫草素，每日一次，持续 14 天。监测小鼠的 7 天生存率。采用苏木精-伊红（HE）染色评估肺组织病理变化，测定肺湿/干（W/D）重量比，并通过 Western blot 检测肺组织中 HIF-1α、VEGF、TNF-α 和 IL-6 的表达水平。紫草素显著提高了脓毒症小鼠的生存率，其中高剂量组效果最为明显（p < 0.05）。与模型组相比，紫草素治疗组的肺 W/D 比值和组织损伤均呈剂量依赖性显著降低。此外，紫草素显著下调了 HIF-1α、VEGF、TNF-α 和 IL-6 的表达水平，其中高剂量组的降低最为显著（p < 0.05）。紫草素可缓解脓毒症小鼠的急性肺损伤，其机制可能与抑制 HIF-1α 表达并减少相关炎症因子的产生有关。

引言

脓毒症是由感染引发的一种严重的全身性炎症反应。¹ 它常导致多器官功能障碍，并随着病情进展可能危及生命。² 尽管已采用机械通气和支持性治疗等疗法，与脓毒症相关的急性肺损伤（ALI）死亡率仍然较高，可达30%–40%。³ 这些治疗主要针对症状，而非肺损伤的根本病因，因而限制了其整体疗效。因此，开发针对肺损伤病因的新型治疗方法，有望显著改善脓毒症患者的预后。

近期研究发现，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）进展中的关键调控因子^4,5。在脓毒症期间，HIF-1α在肺组织中积聚，促进下游基因的表达，从而加剧炎症反应和组织损伤⁶。这一过程显著促进了肺损伤的恶化。因此，靶向HIF-1α信号通路为缓解脓毒症诱导的ALI中的炎症和缺氧反应提供了一种有前景的治疗策略。

在寻找更有效治疗方法的过程中，传统中医（TCM）提供了宝贵的见解^7,8。紫草素是从紫草（Lithospermum ery....

方案

本方案已获得温州医科大学实验动物中心的批准。本研究使用了雄性C57Bl/6小鼠（5–6月龄；20–25 g）。主要试剂和所用设备的详细信息列于 材料表.

1. 脓毒症小鼠模型的制备

1. 将小鼠饲养在恒定温度为 25 °C、湿度为 50%、12 小时光照/12 小时黑暗循环的环境中。
2. 经过 7 天的适应性饲养后，将小鼠随机分为四组：假手术组、模型组、低剂量治疗组和高剂量治疗组，每组 20 只小鼠。
3. 根据既往研究的参考文献¹³，对低剂量组给予 12.5 mg/kg 的紫黄素（purpurin）连续处理 14 天，对高剂量组给予 50 mg/kg 的紫黄素连续处理 14 天。假手术组仅进行剖腹、盲肠牵拉、复位和缝合操作，不进行结扎或穿刺，并以等量生理盐水处理 14 天。脓毒症模型组的实验步骤如下。
4. 在禁食过夜（可自由饮水）后，在整个过程中于无菌条件下使用戊巴比妥钠（40–80 mg/kg）对小鼠进行麻醉。麻醉期间在眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
5. 通过观察呼吸频率减慢、肌肉张力下降以及用止血钳轻夹后肢无明显应激反应来判断麻醉是否充分。
6. 使用 75% 乙醇消毒 3 次。在小鼠腹部中左侧位置做约 1 cm 的纵向切口，逐层切开皮肤、筋膜和肌肉，暴露腹腔。
7. 用双手持钝头....

结果

为了评估紫草素的治疗潜力，我们首先在7天内评估了其对脓毒症小鼠存活率的影响。紫草素治疗以剂量依赖性方式提高了存活率（图1）。

鉴于脓毒症中肺损伤的广泛发生，我们还评估了小鼠的肺水肿情况。通过测定肺湿重与干重比值（W/D）来评价肺水肿。与假手术组相比，模型组的W/D比值显著升高（p < 0.05）。紫草素治疗以剂量依赖性方式缓解了这一效应。高剂量组对肺水肿的减轻作用明显强于低剂量组（p < 0.05）（图2）。

为了进一步验证紫草素对肺组织的保护作用，进行了组织病理学分析。假手术组显示正常的肺组织结构，而CLP模型组则表现出明显的组织损伤，包括广泛的水肿、出血和炎性细胞浸润。与湿干重比（W/D比值）降低的结果一致，紫草素治疗以剂量依赖的方式减轻了这些病理改变。高剂量组小鼠的组织病理学异常显著少于CLP模型组，其病理评分也明显低于低剂.......

讨论

作为脓毒症研究的金标准模型，盲肠结扎穿刺（CLP）模型是本实验中的关键步骤，因为CLP模型在模拟人类脓毒症的复杂性方面优于许多其他模型。脓毒症相关性急性肺损伤（ALI）由于其高死亡率以及当前治疗手段的有限疗效，仍然是临床上的重大挑战^14,15。本研究首次证明，通过构建CLP模型，紫草素可通过调节HIF-1α及炎症反应，显著提高脓毒症小鼠的存活率。

CLP诱导的死亡率取决于多种技术参数，例如针头大小、结扎盲肠的长度以及盲肠穿刺的次数。如果针头过细或穿刺次数不足，则无法引发全身性脓毒症反应；如果针头过粗或穿刺次数过多，小鼠容易死亡，无法继续后续实验。因此，经过反复的技术优化与问题排查，我们确定在距离盲肠末端约1 cm处进行结扎。使用21G针头对盲肠末端进行穿刺并结扎，然后用钝头眼科镊子轻轻挤压穿刺部位，使少量肠内容物排出，再将其重新放回盲肠内。在CLP术后6 h内，观察小鼠是否出现嗜睡、活动减慢、毛发竖立、眼部分泌物及腹泻等脓毒症症状。观察结果显示，高剂量紫草素组呈现出.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苏木精和伊红（H&E）染色试剂盒	Solaibao Technology	G1120HE
低温离心机	Sigma	3K15
酶标仪	Bio-Rad	Model 680
兔单克隆 VEGF 受体1 抗体	Abcam	ab238632
兔多克隆 HIF-1α 抗体	Abcam	ab51608
SDS-PAGE 电泳系统	Bio-Rad	MINI Protean2
紫草素	MedChemExpress	HY-N0822