方法文章

利用质粒DNA转染和mRNA核转染递送在人类细胞中进行CRISPR表观基因组编辑

DOI：

10.3791/68089

⸱

2025年5月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Chan Zuckerberg Biohub - San Francisco

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了利用质粒DNA转染和mRNA核转染技术，在人源细胞系中进行基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的表观基因组编辑的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

表观遗传学是指组蛋白蛋白和DNA的化学修饰，这些修饰可以调控基因的表达。人类表观基因组在细胞分化和衰老过程中会动态变化，许多疾病与异常的表观基因组模式相关。CRISPR技术的最新进展推动了可编程工具的发展，能够在基因组特定位点编辑表观遗传修饰，从而实现对人类细胞中表观遗传修饰的精确重写。基于CRISPR的表观基因组编辑器依赖于无催化活性的dCas9与表观遗传修饰因子的偶联，最终实现对哺乳动物基因组中靶向基因的程序化抑制或激活。与传统的基因组编辑方法不同，表观基因组编辑无需造成DNA断裂或改变人类基因组序列，因此是一种更安全的调控 基因表达的替代方法。在本实验方案中，我们重点介绍两种利用质粒DNA转染和编码CRISPR表观基因组编辑器的mRNA进行核转染的方法，以在人类细胞系中实现dCas9介导的表观基因组编辑。我们展示了利用CRISPR干扰（CRISPRi）可瞬时抑制基因表达的可编程表观基因组编辑，以及利用CRISPRoff实现对基因持续数周的持久沉默——CRISPRoff是dCas9与KRAB结构域及de novo DNA甲基转移酶复合物的融合体。此外，我们还提供了定量检测靶基因表观基因组编辑效果的方法指导，以及根据实验条件选择合适表观基因组编辑工具的关键考虑因素。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管我们体内每个细胞的基因组内容几乎相同，但每种细胞类型的转录谱却存在显著差异。DNA和组蛋白上的表观遗传修饰是转录表达的关键调控因素。与致密且无转录活性的异染色质相比，具有转录活性的常染色质具有独特的表观遗传标记。例如，异染色质区域的特征是存在抑制性组蛋白修饰，包括组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3）、组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），以及基因启动子区域胞嘧啶与鸟嘌呤相邻位点（CpG）的DNA甲基化1。基因组中活跃表达的区域通常由组蛋白乙酰化以及组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）来界定1。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术革命催生了大量能够程序化改变基因组序列的工具。CRISPR 技术基于一种原核生物防御机制，可在可编程的目标序列处切割核酸。CRISPR 核酸酶2,3,4、碱基编辑器5,6 和先导编辑器7,8 可通过切割 DNA 并修复这些断裂，改变哺乳动物基因组的 DNA 序列。尽管这些策略有效，但可能在脱靶位点引起 DNA 断裂9,10，并导致大规模的基因组结构突变11,12,13,14,15。基于 CRISPR 的替代性工具则能够在不改变 DNA 序列的前提下，实现对基因激活与抑制的可控调节。这些工具利用缺乏核酸酶活性的 Cas9（dCas9），使其根据 sgRNA 序列特异性结合目标 DNA 位点，并结合可改变染色质状态的效应蛋白16,17,18。效应蛋白（如表观遗传“书写器”、“阅读器”和“擦除器”）可直接与 dCas9 融合，或通过与 dCas9 融合的肽支架（如 SunTag）或 sgRNA 上的 RNA 支架（如 MS2-MCP 系统）进行招募16,17,18。可编程转录调控工具的实例包括 CRISPR 激活（CRISPRa）19,20,21 和 CRISPR 干扰（CRISPRi）22,23。CRISPRa 通过直接招募转录机器，增强目标基因的转录表达19；而 CRISPRi 则通过建立 H3K9me3 这一抑制性表观遗传标记来抑制转录22。

表观基因组编辑技术的进步使得这些工具在科学领域得到了广泛应用。不同效应结构域与蛋白质的融合极大地扩展了现有表观基因组编辑工具箱18,24,25,26,27,28,29,30。此外，表观基因组编辑器被用于解析表观遗传修饰31,32,33,34,35,36、效应因子37,38,39以及效应因子突变28,40,41在基因调控中的作用。具体而言，CRISPRi 和 CRISPRa 被用于多种生物学过程的功能基因组学筛选，包括细胞存活42和细胞命运决定43,44,45,46,47。此外，表观基因组编辑在体外（ex vivo）细胞工程和体内（in vivo）治疗方面具有潜在的治疗价值18。

本文介绍了在人类细胞系中应用两种基于dCas9的表观基因组编辑工具实现可编程转录抑制的方法：CRISPRi22 和 CRISPRoff48CRISPRi 是 dCas9 与锌指蛋白（如 ZNF10（KOX1）和 ZIM3）中的抑制性 KRAB 结构域融合而成的复合物22,23当CRISPRi靶向特定基因启动子时，KRAB结构域会招募H3K9me3甲基转移酶SETDB1，从而抑制目标基因的表达（图1A当CRISPRi短暂表达时，靶位点上已建立的H3K9me3不会被维持，基因表达随时间恢复32,48为了在功能基因组学等应用中使用CRISPRi实现稳定的基因敲低，必须在细胞中持续表达CRISPRi系统以及sgRNA。最近，CRISPRoff被设计用于可遗传的表观基因组编辑48CRISPRoff 是 dCas9 与 KRAB 结构域融合而成的单个蛋白 从头合成 DNA甲基转移酶复合物DNMT3A和DNMT3L。在人类细胞中短暂脉冲式引入CRISPRoff，可在靶基因位点诱导H3K9me3和DNA甲基化的沉积，从而通过维持DNA甲基化和H3K9me3实现对靶基因的长期抑制。图1B)48此外，表观基因组编辑可以被逆转。例如，通过CRISPRoff稳定沉默的基因可被TET1-dCas9重新激活，后者能够通过酶促作用去除靶位点的DNA甲基化标记。49.

本方案将详细介绍两种用于瞬时表达表观基因组编辑器的递送方法：质粒DNA转染和mRNA核转染。此外，我们还将阐述如何利用流式细胞术评估在两个内源性基因CLTA和CD55上的表观基因组编辑效率。这些方法可被调整并应用于其他表观基因组编辑实验，适用于不同的编辑器或靶向不同基因的研究。

CRISPR基因沉默示意图；通过转染和核转染方法进行表观基因组编辑。
图1：CRISPRi和CRISPRoff表观基因组编辑机制及工作流程示意图。（A）sgRNA转基因和CRISPRi表观基因组编辑器的线性示意图。通过引入CRISPRi和sgRNA，可在目标基因座上添加抑制性组蛋白标记H3K9me3，从而实现基因沉默。在加入CRISPRi后早期即可达到最高沉默水平，但目标基因通常在数次传代后重新激活。（B）sgRNA转基因和CRISPRoff表观基因组编辑器的线性示意图。将CRISPRoff引入靶向特定基因的细胞中，可在CpG位点同时诱导抑制性H3K9me3组蛋白修饰和DNA甲基化，从而沉默目标基因。CRISPRoff介导的沉默具有可遗传性——在转染早期即可实现高效沉默，并可持续维持多个细胞分裂周期。（C）通过转染方法进行表观基因组编辑的时间线概览。第0天，将细胞接种用于转染。第1天，通过转染将编辑器和向导质粒导入细胞。第3天，通过流式细胞术检测细胞中BFP的表达情况。BFP阳性细胞百分比被用作归一化因子，以确定每种条件下实验的最终沉默效率。从第6天开始，检测目标报告基因的沉默效果，因为此时将达到最高的沉默水平。（D）转染方法概览，其中表观基因组编辑器和sgRNA质粒以逐滴添加的方式加入细胞中。（E）通过核转染方法进行表观基因组编辑的时间线概览。在此方案中，于第0天将mRNA通过核转染导入细胞。在核转染后第3天，利用流式细胞术分析评估基因沉默效果。（F）核转染方案概览。将适量的细胞与mRNA混合后加入核转染杯中。若sgRNA也通过核转染引入，则可一并加入该混合物中。将转染杯放入核转染仪中，使用适当的脉冲程序将mRNA导入细胞。核转染完成后，将细胞接种并进行后续传代与分析。（G）用于表观基因组编辑的质粒转染与mRNA核转染策略的比较。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

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注意：补充文件 1 包含代表性数据中sgRNA设计、克隆及细胞系构建的详细信息。代表性结果部分还详细说明了对照实验的建议。

1. 将表达表观基因组编辑器的质粒转染至HEK293T细胞

注意：本实验方案描述了将编码 CRISPR 的质粒递送至 HEK293T 细胞的方法。我们已对细胞进行基因工程改造，使其表达一种靶向非必需基因 CLTA 启动子区域的单导向 RNA（sgRNA）（Addgene 217306），该基因内源性地与绿色荧光蛋白（GFP）融合。CLTA-GFP HEK 293T 细胞源自先前的一项研究50。在本示例中，表观基因组编辑器 直接与蓝色荧光蛋白（BFP）融合，这使我们能够量化转染效率，并确保对实验条件进行准确评估。该方法的有效性通过 CLTA-GFP 的沉默效果得以验证，可在单细胞水平上通过流式细胞术对蛋白表达量进行定量检测。

  1. 细胞培养
    1. 使用含10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺的高糖DMEM培养基培养HEK293T细胞，每2-3天传代一次，确保细胞融合度维持在60%-70%之间。
      注意：为确保最佳转染效率，必须将细胞融合度控制在70%以下，可通过显微镜每日观察监测。
  2. 第0天：为转染接种HEK293T细胞
    1. 转染前一天，使用台盼蓝活/死染色法结合自动细胞计数仪计数细胞，并在96孔板中每孔接种约1.5 × 104个活细胞，每孔终体积保持为200 µL。次日细胞应达到60%-70%融合度。
      注意：该步骤也可高效地在24孔板或6孔板中进行。转染所需的细胞数量和DNA用量请参见表1。
  3. 第1天：将CRISPRoff和CRISPRi质粒转染至HEK293T细胞
    1. 将表观基因组编辑器质粒（Addgene 167981）按每孔150 ng分装至PCR条管中，总体积为3 µL。质粒稀释液可在PCR条管中预先配制。
      注意：若同时共转染表观基因组编辑器质粒和sgRNA质粒，建议尝试编辑器:sgRNA质粒的摩尔比为3:4。该比例可能需要优化，以获得最高的表观基因组编辑效率。
    2. 转染前约30-60分钟，将转染试剂和最低必需培养基（MEM）预热至室温。每孔加入0.6 µL转染试剂和20 µL最低必需培养基，混匀后室温孵育15分钟。
      注意：若进行多个样本的转染，可预先配制转染试剂与最低必需培养基的主混合液。
    3. 将20.6 µL转染试剂与最低必需培养基的混合液加入含有3 µL质粒DNA的各PCR条管中，室温静置15分钟。
    4. 缓慢将混合液逐滴加入已接种细胞的孔板中，并轻轻敲击孔板使液体均匀分散。设置未转染的对照组，以便在后续分析中提供适当的基线对照。
      注意：向接种细胞中添加转染混合液时，必须逐滴轻柔操作，以尽量减少对细胞的扰动，否则可能影响转染效率。
  4. 第2天：检测转染效果
    1. 在10倍物镜下用显微镜观察细胞，判断是否呈现蓝色荧光蛋白（BFP）阳性，阳性信号表明转染成功。观察过程中应避免扰动细胞。
  5. 第3天：将96孔板细胞传代，并利用BFP标记评估转染效率
    注意：成功的转染应使至少30%的细胞呈BFP阳性。然而，在使用dCas9、CRISPRi和CRISPRoff时，我们通常在转染后两天内检测到超过60%的细胞呈BFP阳性 。转染效率与质粒大小呈负相关，因此不同的表观基因组编辑器可能导致不同的转染效率。
    1. 使用前约30-60分钟，将胰蛋白酶和含10% FBS及1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺的DMEM预热至室温。
    2. 吸除各孔中的培养基，注意不要吸走贴壁细胞。每孔加入50 µL胰蛋白酶，于37 °C孵育2-3分钟。
      注意：观察到部分细胞漂浮是正常现象，尤其是在使用CRISPRoff转染后。我们推测这种细胞死亡可能与DNMT3A-3L过表达引起的毒性有关。
    3. 每孔加入150 µL完全DMEM以终止胰蛋白酶消化作用，反复吹打使细胞重悬，并按第5天达到适当融合度的要求进行传代（例如，将约20 µL细胞悬液加入96孔板每孔200 µL培养基中）。
    4. 取50 µL重悬的细胞用于流式细胞术，以评估转染效率。

2. 将表观基因组编辑器 mRNA 转染至 K-562 细胞

注意：本节详细说明将CRISPRoff mRNA核转染至K-562细胞的过程。为简化操作，我们已预先对K-562细胞进行基因改造，使其持续表达靶向内源性CD55基因启动子的sgRNA（Addgene 217306）。直接向细胞递送CRISPRoff mRNA可在实现类似基因沉默效率的同时，降低质粒DNA方法所伴随的细胞毒性。此外，核转染还可用于在转染难度较高的细胞系（如K-562细胞）中导入表观基因组编辑构件。

  1. 细胞培养
    1. 在进行核转染之前，将 K-562 细胞维持在含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1× 青霉素-链霉素-谷氨酰胺的 RPMI 培养基的培养瓶中。每天传代一次，确保细胞密度保持在 60%–70%。
    2. 在核转染当天，将 CRISPRoff mRNA 在无菌、无 RNase 的微量离心管中解冻并轻轻涡旋混匀，随后将 mRNA 置于冰上保存。每 2.0 × 105 个细胞使用 2 µg mRNA，加入条状核转染杯的每个孔中。确保 mRNA 体积不超过总核转染体积的 10%（即 22 µL）。
      注意：也可在更大的核转染杯中对更多细胞和 mRNA 进行核转染。建议根据所用细胞数量按比例增加 mRNA 用量。例如，当在大容量核转染杯中对 1 × 106 个细胞进行核转染时，建议使用 10 µg mRNA，总核转染体积为 100 µL。此外，可优化 mRNA 剂量以确保高效的编辑效率。我们通常每 2.0 × 105 个细胞使用 2–5 µg 编辑器 mRNA 以获得高效结果。在定量前，应去除 mRNA 合成过程中未被整合的游离核苷酸。
    3. 根据制造商说明书配制核转染溶液，并在核转染前于室温下预热 15 分钟。
      注意：不同细胞类型可能需要不同或经优化的核转染溶液。
    4. 使用自动细胞计数仪结合台盼蓝活/死染色对 K-562 细胞进行收集和计数。对于条状核转染杯中的核转染，将约 2.0 × 105 个细胞分装至无菌微量离心管中，每样本一份。
    5. 在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用室温 PBS 洗涤细胞一次，条件为 500 × g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。
    6. 通过从 22 µL 中减去 mRNA 体积，计算用于重悬细胞的核转染液量。用相应体积的核转染液重悬细胞。
    7. 将细胞悬液加入含 2 µg CRISPRoff mRNA 的溶液中（体积由步骤 2.1.2 确定），并将混合液转移至核转染杯中，注意避免产生气泡，因为气泡可能影响核转染效率。轻轻敲击核转染杯，确保细胞沉降至底部。
    8. 使用 4D-Nucleofector 系统并选择合适的脉冲程序进行核转染。推荐对 K-562 细胞使用 FF-120 程序。
      注意：不同细胞类型可能需要优化脉冲程序。如需进一步优化，请咨询设备制造商。
    9. 核转染后，向每个小型核转染杯孔中加入 80 µL RPMI 培养基，并将细胞在 37 °C 下静置 15 分钟。
    10. 将细胞悬液转移至 24 孔板的一个孔中，该孔内已含有 400 µL 预热的 RPMI 培养基（适用于小型核转染杯）。
      注意：核转染后细胞特别脆弱，应轻柔地从核转染杯转移至培养孔中。
    11. 核转染后第 2 天：按照第 3 节所述方法，使用 CD55 抗体进行表面标志物染色，并通过流式细胞仪检测 CD55 APC 荧光，以评估表观基因组编辑效率。
      注意：为检测核转染是否成功，建议使用 GFP 或 mCherry mRNA 进行一次核转染。核转染后第 2 天对这些细胞进行流式细胞分析，以确认核转染成功。我们通常可检测到 90% 至 100% 的细胞表达 GFP 或 mCherry。另一种替代方法是使用已知能有效沉默多种靶基因的 CRISPRi mRNA 进行核转染。在第 2 天进行流式细胞分析时，CRISPRi 处理的样本应显示超过 90% 的细胞中靶基因被沉默。

3. 表面标志物染色

注意：本部分详细说明在 K-562 细胞中进行表观基因组编辑后 CD55 蛋白水平的定量方法。我们通过抗体染色和流式细胞术（见下文第 4 节）对单个细胞中 CD55 表达水平的下降进行定量，以评估 CRISPRoff 介导的基因敲低效率。此外，也可采用其他技术（包括逆转录定量 PCR 或蛋白质印迹）在转录本和蛋白水平上进一步验证敲低效果。

  1. 使用自动细胞计数仪计数细胞，并将约 5.0 × 105 至 1.0 × 106 个细胞加入微量离心管中，在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
    注意：染色时可使用更多或更少的细胞，但可能需要相应调整抗体浓度。
  2. 弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，加入 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻重悬沉淀。
  3. 再次在 500 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入用 PBS 稀释至所需浓度的抗体。对于 CD55 染色，将 1 µL 纯化的抗人 CD55 抗体（0.5 mg/mL 储存液）加入 49 µL PBS 中。
  4. 轻轻吹打混匀细胞，在室温避光条件下孵育 25 分钟。孵育结束后，在 500 × g 条件下再次离心 5 分钟，弃去上清液。
  5. 加入 500 µL PBS 重悬沉淀，以洗去多余的抗体。在 500 × g 条件下离心 5 分钟，弃去 PBS 上清液。将细胞重悬于 100 µL 至 200 µL 新鲜 PBS 中，转移至 96 孔板，用于流式细胞术分析。

4. 流式细胞术

注意：本实验方案是针对使用 BD FACSymphony A1 细胞分析仪编写的。具体操作可能因所使用的流式细胞仪型号不同而有所差异。我们建议参考您所使用仪器的用户手册以获取详细信息。

  1. 在开启流式细胞仪之前，检查废液容器是否未满，并确保鞘液充足。打开靠近鞘液的主电源开关（绿色）。
  2. 使用背面的开关打开酶标仪，然后按下右侧的绿色按钮启动设备，并确保设备已设置为96孔板读板模式。
  3. 打开计算机并登录。启动软件，使用您的用户名和密码登录。
  4. 设置实验。通过选择创建新实验 实验 > 新实验双击当前名称以重命名实验。
  5. 通过点击添加一个孔板 实验 > 新培养板选择要使用的孔板格式。若要添加特定孔位进行运行，请单击孔板上相应孔的位置，然后单击 蓝色注射器 （此时孔位应显示为蓝色）。如有需要，可同时选择多个孔位进行添加。
  6. 通过右键单击为每个孔添加特定名称 样本 在平板显示屏右侧，然后选择 实验设计布局这将打开一个页面，列出您选择的所有孔。要重命名孔，请单击一次并输入所需的名称。单击 好的 完成后。
  7. 在全局工作表中为实验添加图谱和适当的门控。我们建议首先绘制前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）的图。然后通过点击创建一个用于活细胞的任意门控，以便后续优化。 多边形工具.
  8. 右键单击此门控区域，然后单击 深入分析这将创建一个新的图，仅显示来自该活细胞门的细胞。
  9. 将此新图的坐标轴更改为 FSC-A 与前向散射高度 (FSC-H) 并创建单细胞门控。
    1. 如果在细胞中组成型表达sgRNA，且慢病毒同时编码一种荧光蛋白，则可进一步对单细胞门控进行细分，通过检测该荧光蛋白的表达来间接反映sgRNA的表达情况（示例：PE-CF594-A vs FSC-A）。
  10. 在最终的设门步骤（针对单细胞或表达sgRNA的细胞）中，右键单击并选择 深入探究. 创建一个门用于检测报告基因的表达（示例：BB515-A 对比 FSC-A）。
    1. 如果使用转染细胞，并且有方法检测转染效率（例如通过BFP表达），请右键单击 报告基因表达图谱 并单击 重复将坐标轴更改为 BV421-A 与 FSC-A。为 BFP 阳性细胞创建一个任意门。
  11. 在细胞仪显示界面的“参数”选项卡中，移除所有未使用的参数。
  12. 设置机器并准备运行时，请单击 运行 在流式细胞仪控制面板上，该按钮应显示为绿色。在软件中，点击顶部面板的 HTS，然后选择 Prime。完成后，放入样品板，确保其在仪器中位置正确，并且盖子处于打开状态。
  13. 运行时，选择所有要运行的孔，并确保正确设置对照。通过双击选择孔，将样品体积更改为 10 µL，然后单击 获取数据 在采集仪表板中。这将运行样本但不会记录数据。在样本运行过程中，根据需要调整激光电压。此外，调整门控。
    注意：我们建议运行一个对所有检测颜色均为阴性的样本和一个对所有颜色均为阳性的样本，以确保激光参数和设门设置恰当。
  14. 检查激光设置后，单击 平板面板中的样本 并确认运行参数已设置为所需值。
  15. 点击 运行酶标板 在采集仪表板中运行并记录所有孔的数据。完成后，取出培养板以清洁仪器。
  16. 向一个新的96孔板中，向最上面四行加入10%次氯酸钠溶液，向2O 至下方四个孔。前往 高通量筛选 > 清洁完成后，关闭程序，并按照绿色侧边按钮开启的相反顺序将其关闭 > 酶标仪 > 绿色转型由废弃物驱动。
  17. 向含有细胞的96孔板中加入20%漂白剂，随后弃去。

5. 数据分析

注意：本方法概述了通过流式细胞术定量表观基因组编辑的设门策略和数据处理流程。设门策略以视觉化方式呈现，并结合数据分析生成的示例图谱，参见图2和图3。

  1. FlowJo 设门设置
    1. 通过将所有 FSC 文件拖放到新工作表中，将其加载到 FlowJo 中。
    2. 单击 All Samples 开始设门。这将确保门可以轻松应用于所有样本。
    3. 通过双击文件打开一个对照样本（例如未转染或未核转染的样本）。
    4. 在 FSC-A 与 SSC-A 图中使用多边形工具创建活细胞门。在所有样本列表中，样本名称下方现在应出现一个“Live Cells”标签。右键单击此门并选择 Copy Analysis to Group，以将此门应用于所有样本（图 2A，图 3A）。
    5. 双击 Live cells 门以深入分析活细胞。将坐标轴更改为 FSC-A 与 FSC-H（图 2B，图 3B）。
    6. 绘制多边形以仅对单细胞设门。按照第 4 步的方法将此门应用于所有样本（图 2B，图 3B）。
      注：如果组成型表达带有荧光报告基因的 sgRNA 构建体，则需对该荧光颜色进一步设门，以便分析仅聚焦于表达 sgRNA 的细胞。例如，若细胞含有来自 pLG1 骨架的 sgRNA，则可创建针对 mCherry 阳性细胞的门（PE-CF594-A 与 FSC-A）（图 2C，图 3C）。
    7. 双击 Last Setup Gate（单细胞或向导RNA表达细胞）。
    8. 如果进行质粒转染，且表观基因组编辑器编码 BFP 融合蛋白，则为第 2 天的样本创建 BFP 阳性细胞门（示例：BV421-A 与 FSC-A）（图 2D）。
    9. 创建报告基因表达门（示例：BB515-A 与 FSC-A 用于筛选 GFP 阴性细胞），并将此门应用于所有样本（图 2E，图 3D）。
  2. 转染分析
    1. 完成设门设置后，单击上方面板中的 Table Editor。拖入待分析的细胞群（示例：BFP 阳性、GFP 阴性）。
    2. 在表格编辑器面板中，单击 Create Table。将这些数据复制到电子表格中以进行归一化计算。
  3. 数据处理
    1. 从所有其他样本中减去对照样本中报告基因阴性细胞（例如 GFP 阴性）的数量。可能存在一定的背景报告基因沉默，因此此步骤可消除数据中的背景噪声。
    2. 所有数值将归一化至第 2 天测得的 BFP 阳性细胞百分比（成功转染的细胞）。为此，取该数值除以第 2 天 BFP 阳性细胞的百分比，再乘以 100。该计算得到编辑细胞的转染效率归一化值。数据现已准备好绘图。我们建议使用折线图展示表观基因组编辑的时间进程，如 图 2F 所示。
  4. 核转染分析
    1. 完成设门设置后，单击上方面板中的 Table Editor。拖入待分析的细胞群（示例：APC 阴性）。
    2. 在表格编辑器面板中，单击 Create Table。将这些数据复制到电子表格编辑器中以进行归一化计算。
  5. 数据处理
    1. 从所有其他样本中减去对照样本中报告基因阴性细胞（例如 APC 阴性）的数量。可能存在一定的背景报告基因沉默，因此此步骤可消除数据中的背景噪声。数据现已准备好绘图。我们建议使用折线图展示表观基因组编辑的时间进程。
      注：可使用统计学方法量化两种不同表观基因组编辑器之间沉默效果的差异。我们建议所有转染和核转染实验均设置技术重复三次，以便进行统计分析。在绘制随时间变化的沉默折线图时，应标出技术重复的标准差。可在特定时间点进行 Student t 检验，以比较两种表观基因组编辑器的沉默效果。样本应视为非配对且方差不等。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在所有表观基因组编辑实验中，适当的对照对于评估表观基因组编辑效率至关重要。我们建议使用一种对照sgRNA，其序列不靶向人类基因组中的任何位点。使用非靶向引导对照可确保在靶位点观察到的变化是由表观基因组编辑器特异性靶向该位点所引起，而非仅仅由于表观基因组编辑器的过表达或非特异性结合所致。此外，对于基于报告基因的实验，我们建议使用仅表达dCas9的对照，以确保报告基因表达的变化源于表观基因组编辑器的融合蛋白功能，而不是由于dCas9结合靶位点后造成空间位阻，暂时阻碍转录所致（图2F）。

对于转染实验，我们建议使用带有额外荧光蛋白融合的表观基因组编辑器，例如BFP。这种融合可通过显微镜和流式细胞术观察成功转染表观基因组编辑器的细胞。成功转染的细胞在转染后两天会高水平表达BFP（图2D）。对成功转导细胞的定量可用于后续天数中表观基因组编辑效率的归一化分析（图2F）。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案详细介绍了两种不同的CRISPR表观基因组编辑器瞬时递送方法：质粒DNA转染和mRNA核转染。这两种技术各自具有独特的优点、缺点和一般性注意事项（图1F）。

质粒DNA转染可导致表观基因组编辑器高效表达，我们在表观基因组编辑器构建体中引入了BFP融合蛋白，可通过流式细胞术检测并量化转染效率。此外，BFP表达可用于分选表达表观基因组编辑器的细胞，或在后续时间点用于标准化沉默数据的归一化处理，具体方法详见本实验方案。然而，需要注意的是，转染效率通常无法达到100%，因此细胞群体中将存在接受编辑器与未接受编辑器的异质性，除非对细胞进行分选。此外，质粒DNA递送可能触发细胞质中双链DNA介导的免疫反应，导致免疫通路激活和细胞毒性。最后，质粒DNA转染并不适用于所有细胞类型，可能需要采用核转染方式递送质粒。

与质粒DNA转染不同，mRNA核转染适用于多种细胞类型，且通常具有较高的递送效率。编辑用mRNA可使用市售的体外（in vitro）mRNA合成试剂...

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披露

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J.K.N. 是与 CRISPRoff/on 技术相关的专利发明人，这些专利由加利福尼亚大学董事会提交申请。

致谢

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感谢 Nuñez 实验室的成员，特别是 Rithu Pattali 和 Izaiah Ornelas，在本手稿所述方案的开发与优化过程中所提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4D-核转染仪LonzaAAF-1003
96孔组织培养板Corning3596
96孔U型底板Corning351177
APC抗人CD55抗体BioLegend311312
BD FACSymphony A1流式细胞仪BD Biosciences
漂白剂Waxie11003428432
离心机Eppendorf5425
Countess全自动细胞计数仪Thermo ScientificCountess 3
CRISPRoff转染质粒Addgene 167981
流式细胞术稀释液2血液学试剂（鞘液）Thermo Scientific23-029-361
DMEM高糖培养基Thermo Scientific11965118
DPBSGibco14-190-250
Eppendorf管Thomas scientific1159M35
FBSAvantor Seradigm89510-186
Lonza Walkersville SF细胞系4D-核转染仪X试剂盒LFisher ScientificNC0281111
mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA体外转录试剂盒Thermo FisherAM1345
Opti-MEMGibco31985070
PCR条状管USA Scientific 1402-4700
青霉素-链霉素-谷氨酰胺Gibco10378016
pLG1 sgRNA表达质粒Addgene 217306
RPMI 1640Gibco22-400-105
SF细胞系96孔核转染® 试剂盒LonzaV4SC-2096
组织培养孵育箱PHCbiMCO-170AICUVDL-PA
TransIT-LTI转染试剂MirusMIR 2306
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Gibco25200114

参考文献

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dCas9 CRISPRoff CRISPRi

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