利用质粒DNA转染和mRNA核转染递送在人类细胞中进行CRISPR表观基因组编辑

摘要

本方案描述了利用质粒DNA转染和mRNA核转染技术，在人源细胞系中进行基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的表观基因组编辑的方法。

摘要

表观遗传学是指组蛋白蛋白和DNA的化学修饰，这些修饰可以调控基因的表达。人类表观基因组在细胞分化和衰老过程中会动态变化，许多疾病与异常的表观基因组模式相关。CRISPR技术的最新进展推动了可编程工具的发展，能够在基因组特定位点编辑表观遗传修饰，从而实现对人类细胞中表观遗传修饰的精确重写。基于CRISPR的表观基因组编辑器依赖于无催化活性的dCas9与表观遗传修饰因子的偶联，最终实现对哺乳动物基因组中靶向基因的程序化抑制或激活。与传统的基因组编辑方法不同，表观基因组编辑无需造成DNA断裂或改变人类基因组序列，因此是一种更安全的调控 基因表达的替代方法。在本实验方案中，我们重点介绍两种利用质粒DNA转染和编码CRISPR表观基因组编辑器的mRNA进行核转染的方法，以在人类细胞系中实现dCas9介导的表观基因组编辑。我们展示了利用CRISPR干扰（CRISPRi）可瞬时抑制基因表达的可编程表观基因组编辑，以及利用CRISPRoff实现对基因持续数周的持久沉默——CRISPRoff是dCas9与KRAB结构域及de novo DNA甲基转移酶复合物的融合体。此外，我们还提供了定量检测靶基因表观基因组编辑效果的方法指导，以及根据实验条件选择合适表观基因组编辑工具的关键考虑因素。

引言

尽管我们体内每个细胞的基因组内容几乎相同，但每种细胞类型的转录谱却存在显著差异。DNA和组蛋白上的表观遗传修饰是转录表达的关键调控因素。与致密且无转录活性的异染色质相比，具有转录活性的常染色质具有独特的表观遗传标记。例如，异染色质区域的特征是存在抑制性组蛋白修饰，包括组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化（H3K9me3）、组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），以及基因启动子区域胞嘧啶与鸟嘌呤相邻位点（CpG）的DNA甲基化¹。基因组中活跃表达的区域通常由组蛋白乙酰化以及组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）来界定¹。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术革命催生了大量能够程序化改变基因组序列的工具。CRISPR 技术基于一种原核生物防御机制，可在可编程的目标序列处切割核酸。CRISPR 核酸酶^2,3,4、碱基编辑器^5,6 和先导编辑器^7,8<....

方案

注意：补充文件 1 包含代表性数据中sgRNA设计、克隆及细胞系构建的详细信息。代表性结果部分还详细说明了对照实验的建议。

1. 将表达表观基因组编辑器的质粒转染至HEK293T细胞

注意：本实验方案描述了将编码 CRISPR 的质粒递送至 HEK293T 细胞的方法。我们已对细胞进行基因工程改造，使其表达一种靶向非必需基因 CLTA 启动子区域的单导向 RNA（sgRNA）（Addgene 217306），该基因内源性地与绿色荧光蛋白（GFP）融合。CLTA-GFP HEK 293T 细胞源自先前的一项研究⁵⁰。在本示例中，表观基因组编辑器 直接与蓝色荧光蛋白（BFP）融合，这使我们能够量化转染效率，并确保对实验条件进行准确评估。该方法的有效性通过 CLTA-GFP 的沉默效果得以验证，可在单细胞水平上通过流式细胞术对蛋白表达量进行定量检测。

1. 细胞培养
   1. 使用含10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺的高糖DMEM培养基培养HEK293T细胞，每2-3天传代一次，确保细胞融合度维持在60%-70%之间。
      注意：为确保最佳转染效率，必须将细胞融合度控制在70%以下，可通过显微镜每日观察监测。
   ....

结果

在所有表观基因组编辑实验中，适当的对照对于评估表观基因组编辑效率至关重要。我们建议使用一种对照sgRNA，其序列不靶向人类基因组中的任何位点。使用非靶向引导对照可确保在靶位点观察到的变化是由表观基因组编辑器特异性靶向该位点所引起，而非仅仅由于表观基因组编辑器的过表达或非特异性结合所致。此外，对于基于报告基因的实验，我们建议使用仅表达dCas9的对照，以确保报告基因表达的变化源于表观基因组编辑器的融合蛋白功能，而不是由于dCas9结合靶位点后造成空间位阻，暂时阻碍转录所致（图2F）。

对于转染实验，我们建议使用带有额外荧光蛋白融合的表观基因组编辑器，例如BFP。这种融合可通过显微镜和流式细胞术观察成功转染表观基因组编辑器的细胞。成功转染的细胞在转染后两天会高水平表达BFP（图2D）。对成功转导细胞的定量可用于后续天数中表观基因组编辑效率的归一化分析（图2F）。

讨论

本方案详细介绍了两种不同的CRISPR表观基因组编辑器瞬时递送方法：质粒DNA转染和mRNA核转染。这两种技术各自具有独特的优点、缺点和一般性注意事项（图1F）。

质粒DNA转染可导致表观基因组编辑器高效表达，我们在表观基因组编辑器构建体中引入了BFP融合蛋白，可通过流式细胞术检测并量化转染效率。此外，BFP表达可用于分选表达表观基因组编辑器的细胞，或在后续时间点用于标准化沉默数据的归一化处理，具体方法详见本实验方案。然而，需要注意的是，转染效率通常无法达到100%，因此细胞群体中将存在接受编辑器与未接受编辑器的异质性，除非对细胞进行分选。此外，质粒DNA递送可能触发细胞质中双链DNA介导的免疫反应，导致免疫通路激活和细胞毒性。最后，质粒DNA转染并不适用于所有细胞类型，可能需要采用核转染方式递送质粒。

与质粒DNA转染不同，mRNA核转染适用于多种细胞类型，且通常具有较高的递送效率。编辑用mRNA可使用市售的体外（in vitro）mRNA合成试剂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4D-核转染仪	Lonza	AAF-1003
96孔组织培养板	Corning	3596
96孔U型底板	Corning	351177
APC抗人CD55抗体	BioLegend	311312
BD FACSymphony A1流式细胞仪	BD Biosciences
漂白剂	Waxie	11003428432
离心机	Eppendorf	5425
Countess全自动细胞计数仪	Thermo Scientific	Countess 3
CRISPRoff转染质粒	Addgene	167981
流式细胞术稀释液2血液学试剂（鞘液）	Thermo Scientific	23-029-361
DMEM高糖培养基	Thermo Scientific	11965118
DPBS	Gibco	14-190-250
Eppendorf管	Thomas scientific	1159M35
FBS	Avantor Seradigm	89510-186
Lonza Walkersville SF细胞系4D-核转染仪X试剂盒L	Fisher Scientific	NC0281111
mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA体外转录试剂盒	Thermo Fisher	AM1345
Opti-MEM	Gibco	31985070
PCR条状管	USA Scientific	1402-4700
青霉素-链霉素-谷氨酰胺	Gibco	10378016
pLG1 sgRNA表达质粒	Addgene	217306
RPMI 1640	Gibco	22-400-105
SF细胞系96孔核转染® 试剂盒	Lonza	V4SC-2096
组织培养孵育箱	PHCbi	MCO-170AICUVDL-PA
TransIT-LTI转染试剂	Mirus	MIR 2306
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Gibco	25200114