口腔黏膜作为啮齿类动物大麻产品给药的替代方法

摘要

通过灌胃法对啮齿类动物进行口服给药可能引发与固定相关的应激反应。我们探索了大麻素提取物（富含CBD）的口腔黏膜/颊部给药方式，大鼠以每日3 mg/kg的剂量连续给药15天。给药时采用微量移液器经口给予，并使用温和接触技术对动物进行操作。

摘要

在大鼠等实验啮齿动物中，药物的口服给药通常采用灌胃法。尽管该方法有效，但反复操作可能导致动物因束缚而产生应激反应。为减轻这些不良影响并降低传统方法相关的发病率，我们探索了经口腔黏膜/颊部给予富含大麻二酚（CBD）的大麻提取物的方法。在本方法中，雄性大鼠每日接受中链甘油三酯（TCM，来源于椰子油）或富含CBD的大麻提取物处理，持续15天。每次给药时，通过温和的抚触固定技术使动物保持轻度固定状态，并使用微量移液器将油性制剂直接施用于口腔黏膜。给药剂量根据大麻提取物中的CBD浓度计算，标准化为3 mg/kg/天。为确保准确性，每日称量动物体重，以便根据治疗期间的体重变化调整剂量。该方法具有非侵入性和降低应激的优势，有望改善实验环境中的动物福利。富含CBD的大麻提取物治疗安全性良好，对动物海马组织的分析显示，GluA1和GFAP蛋白的表达水平发生改变，分别与谷氨酸能受体功能和神经炎症直接相关。这提示大麻提取物可能适用于存在谷氨酸能兴奋性毒性及星形胶质细胞增生的病理状态。

引言

在临床前研究的实验设计中，向实验动物施用药物及具有治疗潜力的物质仍然是一个关键环节。尽管常用方法包括腹腔注射、皮下注射或经口灌胃，但由于这些方法可能引发动物应激相关的福利问题，其临床转化能力常受到限制^1,2。此外，这些给药途径并不总能反映未来在人体中推荐使用的给药方式，可能影响研究结果在临床环境中的适用性。啮齿类动物尤其在这些研究中发挥着重要作用，作为模式生物用于模拟人类临床情况。为确保研究的有效性和可靠性，必须建立能够最大限度减少实验动物应激、并模拟人类用药方式的实验条件。此外，存在多种药物给药方案，选择时需仔细考量和周密规划，以优化物质在动物体内的递送效果，同时尽量减少操作可能带来的不良体验³。

在此背景下，目标是建立一种模拟大麻提取物经口黏膜给药的实验方案^4,5，类似于当前的临床实践^6,7,8,9，以便在大鼠中实施长期治疗¹⁰。通过情感性触觉进行固定 时，应轻柔地向后牵拉动物颈背部皮肤，并将其提起至尾部脱离笼内垫料，以模拟母鼠携带幼崽的方式。使用微量移液器将大麻提取物（一种油性溶液）精确地滴入动物口腔内，接触颊黏膜内壁，随后将大鼠放回笼中。该方法不仅旨在避免动物产生应激反应，从而可能改善实验动物的福利，同时也使临床前研究方法更贴近临床实际操作。研究显示，接受该口黏膜给药方案并使用大麻提取物处理的健康大鼠表现出显著的神经化学改变¹⁰，提示该治疗可能具有神经保护作用。具体而言，富含CBD的大麻提取物被发现可调节谷氨酸能突触的分子结构，调控星形胶质细胞中GFAP的表达，并改变小胶质细胞的形态。值得注意的是，这些神经化学和细胞层面的适应性变化并未伴随可观察到的行为学改变，突显了该治疗在生化层面产生的精细影响¹⁰。

大麻植物以其药用特性而广为人知，其应用可追溯至古代¹¹，但直到近几十年，其生化成分和药理潜力才得到更广泛的研究^12,13,14。主要的植物大麻素，如大麻二酚（CBD）和Δ⁹-四氢大麻酚（Δ⁹-THC），以及少量植物大麻素和萜烯类化合物，对多种疾病所描述的众多治疗效应具有重要作用^15,16,17。因此，基于大麻的产品在临床实践中已被批准并推荐用于多种临床状况^6,7,8,18。除了这些临床进展外，利用基于大麻的产品进行的临床前研究也显著增加^9,19,20,21。此类研究对于评估生理反应、潜在不良反应及行为变化具有重要价值²²。给药途径是研究中的关键因素，在文献中存在多种用于给予植物大麻素或基于大麻产品的治疗方式，例如吸入^23,24（或吸烟）、腹腔注射²⁵、微型泵输注^26,27,28以及灌胃²⁹。这些技术在操作复杂性、治疗持续时间和完成时间上各不相同，并产生不同的生理反应时间，从而影响动物行为。此外，这些技术应用中的错误可能导致治疗无效、研究中变异性过高，甚至导致个体死亡^{3,30,31,32,33,34}。

越来越多的证据表明，刺激机械感受传入神经不仅可以在啮齿类动物中，也可以在人类中作为减轻压力的靶点。因此，身体接触除了对神经刺激的直接影响外，还能调节心理特征，有助于改善由长期轻度应激所导致的功能损伤^35,36,37。该非侵入性方法通过减少动物运动限制的时间以及因过度操作而引发的继发性应激，有助于实现长期治疗，同时保障动物的生活质量和存活率。此外，该方法还可应用于其他啮齿类动物物种以及口服药物的研究。

方案

本研究遵循伦理标准进行。所有实验程序均经里约热内卢联邦大学（UFRJ）健康科学中心（CCS）动物研究伦理委员会（CEUA）批准；CEUA：079/22（方案编号 014/19，批准日期为 2019 年 3 月 27 日）。

1. 根据动物体重计算剂量

1. 在启动给药方案之前，将出生后45至60天的雄性Wistar大鼠（Rattus norvegicus）按实验分组。一组给予来源于椰子油的中链甘油三酯（MCT）作为对照组，另一组给予富含CBD的全谱大麻提取物。两种处理均每日给药一次，持续15天。大麻提取物的剂量标准化为3 mg/kg/天，并根据每只动物每日体重进行调整，以确保给药剂量准确。
2. 动物称重：将每只大鼠单独放入一个小容器中，置于天平上。等待重量（单位：g）稳定后记录数值，随后将动物从天平上移除。
3. 剂量计算：根据动物体重计算应给予的剂量。使用以下公式：
   剂量（mg）= [体重（g）× CBD浓度（mg/kg）] / 1,000
   ​注意：在本方案中，我们使用了CBD浓度为24 mg/mL的富含CBD的大麻提取物。例如，对于一只200 g的动物，给药总体积为25 µL，该体积较小，可置于颊内侧。
   1. 使用以下标准公式计算给药体积：
      体积（µL）= [D（mg/kg）× W（g）] / C（mg/mL）
      其中D = 给药剂量，W = 动物体重，C = 溶液浓度
4. 记录每只动物所需的给药剂量。

2. 动物固定 大麻提取物的给药与管理

1. 准备：给药时，将动物从笼中单独取出，以避免干扰。使用微量移液器吸取为每只动物计算好的大麻提取物剂量。
   注意：动物仅在给药过程中短暂隔离，以尽量减少干扰。大鼠并未长期单独饲养。
2. 固定：轻轻向后拉住动物颈背部皮肤以固定 动物。将其提起至尾部脱离笼内垫料表面，确保动物活动受到充分限制，但不造成伤害。
   注意：此步骤需掌握牢固但轻柔的力度，以避免引起动物应激。
   1. 若动物出现躁动，可将提起的动物轻轻晃动，使其安静下来。
3. 给药：将含有大麻提取物的移液器尖端小心插入动物口腔内侧颊部。确保动物能够吞咽大麻提取物。此步骤约需30秒。
   1. 由于微量移液器在动物口腔内的位置以及给药体积较小，动物吐出溶液的可能性较低。但如果发生吐出情况，切勿重复给药，以免造成过量。
      注意：本实验所用的富集CBD大麻提取物储备液配方中CBD浓度为24 mg/mL，溶剂为MCT（中链甘油三酯，来源于椰子油）。油类广泛用作难溶于水的药物（如源自大麻植物的CBD）提取物的溶剂。MCT是一种高效的载体，可提高这些制剂的生物利用度和稳定性^38,39,40。由于该油性溶液具有较高浓度和高黏度，仅需极小体积即可置于动物颊部内侧，且溢出可能性极低。尽管在某些情况下仍可能发生少量损失，且部分药液可能直接被吞咽而非经黏膜吸收，但该方法能高度可靠地模拟临床实践中的给药情况，尤其适用于儿童患者^6,7。
4. 确保每组处理均由同一操作者完成，且操作者不得使用任何带有香味的化妆品。

3. 给药后的护理与分析

1. 轻柔地释放动物，并将其放回群体中。
2. 给药后，需对动物进行短暂观察（约5–10分钟），以监测任何即刻的不良反应。这包括密切观察行为变化，特别是与大麻素四联征相关的症状（僵直、活动减少、眼睑下垂和低体温），这些可能提示对大麻提取物出现意外或过度反应。此外，还需监测动物是否出现呼吸困难（呼吸费力、喘息）和口腔刺激（炎症、流涎过多）的迹象。
3. 应特别关注胃肠道不适的征象，如呕吐或腹泻，因为这些症状可能影响动物福利，并可能干扰治疗效果⁴¹。需要指出的是，本研究中未观察到任何不良反应。
4. 为进一步评估15天治疗的影响，需进行一系列综合分析。包括使用旷场实验进行行为学评估，以检测运动活性；以及采用新物体识别实验评估短期记忆。
5. 处死动物后，采集海马组织进行Western blot分析，以定量与突触可塑性和胶质细胞活性相关的蛋白水平。同时进行免疫组织化学染色，以观察海马区小胶质细胞的形态及其吞噬活性，从而深入理解长期暴露于富集CBD的大麻提取物所诱导的细胞与分子层面的变化¹⁰。

4. 开放旷场实验方案

1. 将动物单独放置在方形旷场的中央。启动连接到计算机的摄像头进行录像。确保摄像头位于方形旷场正上方，以便能够观察到整个旷场区域。
2. 设置计时器为5分钟。每只大鼠需在旷场内自由探索。计时结束后，暂停计时器和录像。
3. 将动物从方形旷场中移除。

结果

该方法此前已被本研究团队使用。本研究探讨了富含大麻二酚（CBD）的大麻提取物对生长、行为及突触变化的长期影响。从青春期到成年早期，每日经口黏膜给予3 mg/kg剂量的富含CBD的大麻提取物并未对动物的生长产生不利影响。研究细致评估了尿量、食物和水摄入量以及体重增加等关键生理参数。双因素方差分析显示，时间对体重具有显著影响，但处理因素无显著影响（图1）。在治疗期结束时，对照组动物平均体重达到249.1 ± 5.7 g，而提取物处理组动物为258.6 ± 6.5 g¹⁰。

基于这些发现，实验结果验证了口腔黏膜给药方案是一种有效且耐受性良好的大麻提取物递送方法，适用于大鼠。每日以 3 mg/kg 剂量给予富含 CBD 的大麻提取物，并未对动物的生长或关键生理参数产生不良影响，进一步表明该方法不会引起显著应激反应。这一结论也得到了行为学评估的支持，例如在开放旷场实验中，给药组动物表现出正常的自主运动活动（图 2），提示口腔黏...

讨论

本文所述方案提供了一种针对大鼠经口黏膜给予大麻提取物的优化方法，其显著优势在于对操作者和动物本身均具有良好的舒适性，尤其保障了动物的福祉与安全，并能精确控制给药剂量以实现有效吸收。口黏膜给药途径经济且相对安全，部分动物可根据所给化合物的不同被训练为自愿配合⁴，从而减少传统灌胃方法通常带来的应激反应^30,33以及实验人员操作引起的干扰³。尽管腹腔注射的药代动力学特征与口服途径相似，但其并不能模拟人类使用大麻类产品的首选给药方式——后者主要通过口黏膜（跨黏膜）或口服途径给药，尤其是富含CBD的产品^42,43,44。此外，腹腔注射的物质必须无菌且无刺激性；若注射具有刺激性的物质，可能在啮齿类动物中引发疼痛性肠梗阻和腹膜炎

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
富含CBD的大麻提取物	Farmacannabis项目 - 里约热内卢联邦大学（UFRJ）	x	大麻素浓度：CBD = 24.0 mg/mL；Δ9-THC = 1.0 mg/mL；CBDA = 0.5 mg/mL；THCA和CBN未检出。
手套	NUGARD	CA 41.485	合成橡胶材料（丁腈）
微量移液器	Labmate pro/LabMate+	LMP-200	20-200 µL
中链甘油三酯（MCT）油溶液	MCT；Brain TCM，Puravida	7907981000102	用作溶剂载体
电子天平	123 util	1783912	最小和最大称量灵敏度分别为1 g和10 kg