通过咪喹莫特建立银屑病小鼠模型

摘要

本文介绍了一种利用咪喹莫特建立的高效且稳定的银屑病小鼠模型。此外，我们还详细描述了用于评估银屑病严重程度的方法学。

摘要

银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，其特征为皮肤增厚、浸润、脱屑和红斑。该疾病的发病机制极为复杂，涉及遗传、免疫和环境等多种因素的相互作用。为了研究银屑病的发病机制，研究人员已开发出多种动物模型。然而，由于方法学的差异，这些模型的构建在一致性方面面临挑战。本研究建立并全面评估了一种使用咪喹莫特（IMQ）诱导的高效且稳定的银屑病小鼠模型。采用8周龄的SPF级雌性C57BL/6J小鼠建立银屑病模型。在适应环境一周后，剔除脱毛区域皮肤有刺激或损伤的小鼠。从第2天开始，每天在脱毛的颈部和背部区域涂抹5%咪喹莫特乳膏（62.5 mg/d），连续7天。实验期间每日进行体重测量、皮肤摄影、皮肤评分及行为学观察。实验结束后，进行脾脏指数测定、皮肤组织学分析、血清细胞因子检测以及皮肤mRNA水平检测。结果显示，IMQ组小鼠出现了典型的银屑病样症状，包括红斑、脱屑和皮肤增厚，同时伴有抓挠行为增加、体重减轻、脾脏指数升高及皮肤厚度增加。血清中TNF-α、IL-23和IL-17A水平显著升高，皮肤中IL-23、IL-17A、IL-17F和IFN-γ的mRNA表达水平也明显上调。相比之下，对照组未出现上述变化。通过优化IMQ诱导时间、标准化给药方案，并动态监测皮肤变化，本研究旨在为科研人员提供一个构建可靠银屑病模型的标准化框架。

引言

银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性全身皮肤疾病，其中斑块型银屑病是最主要的临床表现形式¹。其临床特征通常包括皮肤浸润、增厚、鳞屑和红斑²，还可引发多种并发症，如银屑病关节炎、抑郁、代谢综合征和心血管疾病¹。此外，银屑病常伴有慢性瘙痒³。全球范围内，银屑病影响约2%至3%的人口⁴，且发病率呈上升趋势。因此，建立能够紧密模拟人类银屑病病理特征的可靠动物模型，对于揭示其发病机制并开发新的治疗策略至关重要。

在皮肤科研究领域，银屑病因其复杂的发病机制而受到广泛关注，其发病机制涉及遗传、免疫和环境因素之间的相互作用，为深入研究带来了巨大挑战¹。目前研究表明，银屑病的发病主要由T细胞介导，活化的T细胞可刺激角质形成细胞过度增殖，并在其分化过程中改变细胞因子的分泌⁵。在此过程中，白细胞介素（IL）-23/IL-17轴发挥着关键作用。IL-23促进Th17细胞的分化与活化，后者产生IL-17A和IL-17F等细胞因子，在银屑病的发生发展中起重要作用^6,7,8。目前，银屑病的发病机制涵盖多种分子改变，涉及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-23/IL-17轴、IL-37等细胞因子，核因子-κB（NF-κB）、Janus激酶-信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）等细胞内信号通路。此外，还与糖类相关分子、三羧酸循环（TCA）、氨基酸、脂质代谢通路以及表观遗传调控因子（包括DNA甲基化和组蛋白修饰）密切相关。这些靶点之间错综复杂、相互作用，共同推动银屑病的发生与发展⁹。

在当前的银屑病研究中，研究人员采用了多种动物模型，包括自发性模型、同种异体移植模型、转基因或基因敲除模型以及化学诱导模型等¹⁰。这些动物模型在银屑病研究中发挥着至关重要的作用，科学家已利用小鼠、豚鼠和斑马鱼等多种物种构建了银屑病模型^11,12,13。然而，这些模型均存在一定的局限性，包括遗传复杂性、物种差异、伦理问题以及成本因素¹⁴。

咪喹莫特（Imiquimod, IMQ）作为Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）的激动剂，可引发皮肤炎症和免疫细胞浸润，同时促进角质形成细胞增殖及真皮血管增强¹³。已有研究 报道 ，在人体局部使用IMQ可诱导银屑病的发生¹⁵。临床观察也发现，IMQ会加重银屑病患者的症状⁷。在小鼠银屑病模型中，持续给予5%浓度的IMQ可重现人类银屑病的皮肤表现，如红斑和鳞屑；此外，其他症状也与人类斑块型银屑病高度相似，包括表皮增厚（acanthosis）和角化不全（parakeratosis）等表皮改变、新生血管形成等。由IMQ诱导的银屑病小鼠模型还可模拟慢性瘙痒症状⁴。在该模型中，还可观察到T细胞、中性粒细胞和树突状细胞等炎症细胞的浸润^2,16。IMQ诱导的皮肤病变主要依赖于TNF-α-IL-23/IL-17轴，表明基于IMQ的银屑病小鼠模型可用于进一步研究人类银屑病的发病机制⁹。

本研究中采用的咪喹莫特（IMQ）诱导的小鼠银屑病模型适用于C57BL/6和BALB/c等小鼠品系，这两种品系分别具有Th1和Th2倾向性⁷。该模型稳定且高效，具有成本低、实验周期短、操作简便、症状明显和成功率高等优点。在实验中，我们详细描述了多种用于监测银屑病进展的方法，包括皮肤评分和行为学检测。此外，我们还通过组织病理学分析、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）进一步验证了实验结果。该模型不仅适用于银屑病发病机制的研究，也适用于新治疗策略的临床前评估，是科研工作中一项有价值的工具。

方案

以下动物使用方案已通过广西中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查批准（DW20191220-153）。所购小鼠的动物合格证号为SCXK（湘）2024-0009。本研究中，将8周龄C57BL/6J雌性小鼠（SPF级）随机分组，每组6只。饲养笼置于温度可控的房间内（23 ± 2 °C，12小时光照/黑暗循环），自由摄食和饮水。实验流程图见图1。对照组小鼠除不使用咪喹莫特乳膏诱导外，其余处理均与咪喹莫特组相同。

1. 动物准备

1. 在动物适应环境一周后开始建模。实验开始前，使用75%乙醇溶液仔细消毒实验台。
2. 使用记号笔清晰标记小鼠尾巴，确保个体可识别。
3. 使用剃毛器剃除所有小鼠颈部和背部约4 cm × 3 cm面积的毛发（第0天；图2A）。用棉签蘸取适量脱毛膏，均匀涂抹于已剃除毛发的皮肤区域（图2B）。
4. 涂抹脱毛膏后，等待约15秒。脱毛膏在小鼠皮肤表面停留的最佳时间为15–20秒，随后轻柔快速地擦拭去除。
5. 使用新的棉签蘸水，沿小鼠尾部至头部方向反复擦拭以清除残留毛发。用医用吸水纸轻轻擦干局部皮肤。
6. 脱毛后24小时检查小鼠皮肤状况，剔除脱毛区域受损的个体。

2. IMQ诱导的银屑病小鼠模型

1. 确保剃毛或脱毛造成的轻微皮肤损伤已完全恢复。
2. 从第2个开始^nd 第天，以62.5 mg的剂量外用5%咪喹莫特乳膏⁷预先将1 mL注射器完全填充咪喹莫特乳膏，并使用平柄勺将相当于每日62.5 mg咪喹莫特剂量的药物涂抹于小鼠脱毛区域的皮肤图2C）。涂抹时，应确保咪喹莫特乳膏尽可能均匀地覆盖脱毛区域，且涂抹范围小于脱毛区域。
3. 涂抹药物后，将小鼠放入空笼中，等待15分钟。待药物完全吸收后，将小鼠放回饲养笼。连续给药7天。

3. 银屑病小鼠的体重分析

1. 将一个洁净的烧杯放在电子天平上归零。然后，轻轻地将小鼠放入烧杯中，并记录天平显示的稳定读数。
2. 从第1天（首次涂抹IMQ的前一天）开始，每天称量小鼠体重，直至第8天。将每只小鼠每天的体重与其第1天的体重进行比较。

4. 银屑病小鼠的皮肤表征

1. 将小鼠置于白色背景上，并放置直尺。保持小鼠身体伸直，避免头部收缩或身体大幅摆动（图3）。
2. 从第1天开始，每天在相同光照强度下对小鼠给药部位拍摄高分辨率照片，并记录小鼠的皮肤特征。
3. 每次拍照时，应保持相机与小鼠之间的距离一致，相机放大倍数一致，并将直尺垂直于相机放置。

5. 皮肤评分

1. 从第1天到第8天，每天使用改良的小鼠银屑病面积和严重程度指数（Psoriasis Area and Severity Index, PASI）¹⁷ 评估银屑病皮炎的严重程度。采用三名研究人员以双盲法独立对红斑、鳞屑和皮肤厚度进行评分，评分范围为0至4分，并取三者算术平均值。PASI评分标准参见表1。
   PASI评分 = 红斑 + 鳞屑 + 皮肤厚度

6. 小鼠行为学观察

1. 在与步骤4相同的安静、正常光照、室温环境下，将每只小鼠放入一个独立的丙烯酸盒（10 cm × 10 cm）中，盒底铺有少量玉米芯垫料。
2. 使用黑色隔板分隔每个盒子并遮挡视线。经过15分钟的适应期后，对动物行为进行1小时的视频记录。
3. 从第1天到第8天，每天在固定时间录制行为视频。将摄像镜头垂直于丙烯酸盒放置，并确保完整捕捉盒内小鼠的所有活动。
4. 将小鼠抬起后肢搔抓颈部和背部后又放下的行为记录为一次瘙痒行为。

7. 采集血液并通过ELISA检测血清中细胞因子水平

1. 用镊子迅速摘除小鼠眼球，并在第9天收集血液。
2. 将血液在4 °C静置4小时，然后在4 °C条件下，以3000 x g离心30分钟，分离血清。收集血清并储存在-80 °C，以备后续使用。
3. 根据制造商说明书，使用相应的ELISA试剂盒定量检测血清中TNF-α、IL-17A和IL-23的水平¹⁸。

8. 皮肤和脾脏的取样

1. 根据相关动物实验伦理委员会的规定，在第9天采血后，通过脱位小鼠颈椎处死小鼠。
2. 处死后，将小鼠背部皮肤病变组织切成两部分。将其中一部分浸入含4%多聚甲醛溶液的5 mL离心管中固定保存；另一部分皮肤组织则分离后分装，于-80 °C保存以备后续使用。
3. 用灭菌剪刀沿小鼠腹部中线剪开皮肤，暴露腹腔，找到脾脏并完整取出。用无菌生理盐水清洗样品，然后放入生理盐水中称重，并记录数据。

9. 皮肤切片的组织学分析

1. 将皮肤组织从多聚甲醛中取出，放入包埋盒中。
2. 对皮肤进行以下处理：使用75%至100%的梯度酒精（浓度由低到高），其中100%酒精使用三个容器，每个容器中室温放置30分钟；使用两个容器的二甲苯，每个容器中室温放置30分钟；使用三个容器的熔点为56–58 °C的石蜡，每个容器中室温放置1小时。
3. 包埋处理后的皮肤组织：将浸透石蜡的皮肤组织直立放入石蜡模具中。当包埋用石蜡温度比石蜡熔点高5–7 °C时，倒入熔化的石蜡，迅速转移至冷冻台，快速冷却并固化成蜡块。
4. 将蜡块冷冻至0 °C，从包埋盒中取出，固定在切片机的夹持台上，切片厚度为3 µm。
5. 用镊子夹取切片，在45 °C温水中展片，将切片贴附于载玻片光滑面的中央，并用铅笔在磨砂区域标记病理编号。将载玻片倾斜45°片刻，使水分流出，随后放入62 °C烘箱中烘烤30分钟。
6. 苏木精-伊红（HE）染色：将切片依次放入二甲苯中5分钟，再放入另一缸二甲苯中5分钟，无水乙醇中1分钟，95%乙醇中1分钟，85%乙醇中1分钟，75%乙醇中1分钟；用自来水冲洗1分钟，苏木精染液染色5分钟，再用流水冲洗1分钟以去除多余苏木精。
7. 在1%盐酸乙醇中浸泡3秒，水洗20秒，用温水返蓝5分钟，流水冲洗2分钟，0.5%伊红染色1分钟，95%乙醇中浸泡2秒，再在95%乙醇中2分钟，无水乙醇中4分钟，另一缸无水乙醇中4分钟，二甲苯中4分钟，另一缸二甲苯中4分钟，最后一缸二甲苯中4分钟。待切片自然干燥后，用中性树胶封片。
8. 在显微镜下观察切片，于400倍放大倍数下随机选取三个视野拍照。每张图片使用Image J软件随机测量五个位置的表皮厚度，记录并分析数据。

10. 通过RT-qPCR检测皮肤中IL-17A、IL-17F、IL-23和IFN-γ的mRNA水平

1. 取约100 mg保存在-80 °C冰箱中的皮肤组织，采用Trizol法提取RNA。
2. 根据反转录试剂盒（VAZYME，中国）说明书将RNA反转录为cDNA。
3. 按照说明书配置PCR反应体系，并在荧光定量PCR仪上按照指定的反应程序（表2）和引物序列（表3）进行实时荧光定量PCR。
4. 收集实时荧光定量PCR数据，采用qPCR算法（2-ΔΔCt法）对结果进行计算与分析。

结果

连续给予咪喹莫特（IMQ）后，IMQ组小鼠背部皮肤出现类似银屑病的临床症状（图4），IMQ诱导区域表现出红斑、鳞屑和增厚等典型特征（图5）。相比之下，对照组未出现与IMQ组相似的任何症状。与对照组相比，IMQ组从第3天开始出现红斑及轻微鳞屑（图5A、C）。至第5天，这些小鼠形成浸润性斑块，表面鳞屑增多（图5E）。到第8天，皮肤红斑加重，表面覆盖广泛鳞屑，表皮显著增厚，并出现类似人类银屑病皮损的病变（图5B、D、F），导致总评分显著升高（图5G、H）。

对小鼠自发搔抓行为的观察和统计分析显示，与对照组相比，IMQ组小鼠从第4天开始...

讨论

我们的研究利用IMQ诱导类银屑病皮肤病变，从而构建银屑病模型。该模型可用于研究银屑病发病机制，并为该疾病的治疗方案开发提供理论依据。在van der Fits的研究中⁷在初次给予咪喹莫特（IMQ）诱导时，诱导时间设定为5天或6天。然而，Jabeen 等人提出，IMQ诱导的银屑病模型严重程度在第6天时将达到最大值^th 天至第8天^th 使用咪喹莫特后的第1天¹⁶考虑到这一点，我们通过将咪喹莫特（IMQ）诱导时间延长至7天来优化实验方案。这一调整有助于更全面地呈现银屑病症状，相较于先前的方案，更有利于展示银屑病的典型特征。

既往研究^7,20,21表明，大多数研究人员采用咪喹莫特（IMQ）、普萘洛尔和十二烷基硫酸钠（SLS）等化学试剂诱导银屑病模型。这三种试剂均可直...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5% 咪喹莫特乳膏	Sichuan Medshine Pharmaceutical Co.	40220602
75% 乙醇	XUE HUAN	20240401
分析天平	sartorius	SQP
脱毛膏	Reckitt Benckiser	20240612 08X
电子秤	Yingheng Technology	7915
医用卫生纸	JD	20221208
剃须刀	HORD shenjian	AUX-C6S
无菌棉签	Beilun River	20230728