戊四氮诱导癫痫发作的行为学表征：超越Racine分级

摘要

该方案介绍了一种用于分析和可视化戊四氮诱导小鼠癫痫发作相关行为的创新方法。该方法超越了传统的Racine评分，能够更全面地评估发作期行为的多样性及其时间动态特征。

摘要

对癫痫动物模型中的发作行为进行详细表征至关重要。尽管目前存在多种诱导发作的实验方案，Racine量表仍是应用最广泛的发作量化方法。该量表最初用于评估在边缘系统结构电点燃过程中行为的逐步募集程度，此后已发展成为适用于不同病因模型中癫痫发作分类的标准方法。

然而，仔细观察戊四氮（PTZ）给药后的行为表现——一种常用的癫痫发作模型，可发现Racine分级法无法全面捕捉这种GABA能拮抗剂所诱导的全部行为改变。单次皮下注射高剂量PTZ后，小鼠首先出现非惊厥性行为，如肌张力减退、活动减少、行为静止和震颤。随后出现发作期行为，包括痉挛、肌阵挛性抽动和边缘系统性癫痫发作，但Racine分级法仅对后者进行量化。

为了克服这些局限性，采用了一种改进的方法，将视频标记与动物追踪相结合，以区分痉挛和肌阵挛与边缘性癫痫发作作为不同的行为表现。这些早期行为可能促进边缘系统结构的募集，最终触发边缘性癫痫发作。该方法易于实施，能够更全面地评估戊四氮（PTZ）诱导的急性癫痫发作。其应用价值在PTZ点燃模型中尤为明显，其中重复给予低剂量PTZ会导致痉挛、肌阵挛及边缘性癫痫发作严重程度随时间发生改变。该方法有望提高癫痫发作及癫痫研究的可重复性。

引言

行为学表征是癫痫及痫性发作活动病理生理学研究中最常用的观测指标，也广泛用于新型抗癫痫药物的筛选^1,2。过去50年发表的大多数研究均采用Ronald J. Racine建立的渐进评分系统，用于描述杏仁核和海马点燃过程中的行为性痫性发作严重程度³。Racine量表在大鼠³和猫⁴中均显示出行为表现与脑电图阵发性电活动之间存在强相关性。该量表将痫性发作的行为表现分为五个渐进阶段：“(i) 口面部运动，(ii) 头部点头样动作，(iii) 前肢阵挛，(iv) 直立，以及 (v) 直立伴跌倒”³。由于其操作简便、易于解读、评分快速且具有良好的可重复性，即使在当今，Racine量表在癫痫和痫性发作研究中的应用仍在持续扩大（图1）。

方案

所有实验程序均经北里奥格兰德联邦大学当地伦理委员会批准（方案编号 043/2022，许可证编号 307.043/2022）。本方案使用 3 至 4 月龄的雄性 C57BL/6 小鼠，根据已建立的 PTZ 诱导方案，建议样本量为 6–10 只动物¹⁶。

1. 观察区域的准备

1. 使用一个方形或圆形的实验区域，其表面积至少为 10 x 10 cm，墙高 30 cm。确保实验区域光照充足。如有必要，使用红外照明以保证图像采集的饱和度（图 2A）。
2. 在实验区域上方安装至少一台摄像机，使其能够俯视整个区域底部以及至少 10 cm 高的侧壁（以便完整捕捉小鼠直立行为而不裁剪头部，图 2B）。
3. 如需获取正面视角，可增设第二台摄像机对准实验区域。此时应确保实验区域的一侧墙壁为透明材质。
4. 确保环境温度（21–24 °C）和湿度（50–70%）与动物饲养设施条件一致，使用温湿度计进行监测并根据需要调整。
5. 铺设适量垫料以覆盖实验区域底部，并确保动物与背景之间具有足够对比度以便观察。在整个实验过程中提供自由获取的水和饲料颗粒。
6. 建议在光周期开始时启动实验（例如上午 7:00 至 10....

结果

为了评估编码策略及其在记录PTZ诱导癫痫发作期间行为表现方面的能力，首先测试了三种剂量的PTZ，并观察其对C57BL/6小鼠的影响（分别为40、60和80 mg/kg，每组动物数N = 7、5和5）。在单次注射后，三种PTZ剂量下观察到的行为结果显示出明显的剂量依赖性差异。接受40 mg/kg PTZ处理的小鼠仅出现痉挛，但无边缘系统癫痫发作或肌阵挛。相比之下，接受60和80 mg/kg PTZ处理的小鼠则持续表现出痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作。接受40或60 mg/kg PTZ的小鼠死亡率为0%。然而，在80 mg/kg剂量下，死亡率高达80%，通常继发于强直性发作后的呼吸停止。基于这些结果，选择60 mg/kg剂量用于单次注射和每周注射，40 mg/kg用于每日注射。

接下来，对C57Bl/6小鼠（N = 15，60 mg/kg，皮下注射）给予单次PTZ注射，并在注射后1小时内分析其行为。PTZ给药可诱导一系列超出Racine分级所定义的边缘性癫痫发作的行为，包括痉挛和肌阵挛。这些行为可利用本文所介绍的编码系统进行便捷的表征分析（图3.......

讨论

本研究采用基于运动表征的行为分类方法，为分析癫痫发作动态提供了更全面的框架。该方法能够量化关键参数，包括痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作的潜伏期、持续时间和频率。每周注射PTZ的结果显示，反复暴露显著改变了边缘系统癫痫发作的时间特征和频率，首次痉挛和边缘系统癫痫发作的潜伏期明显缩短，同时边缘系统癫痫发作的持续时间延长。此外，每日注射较低剂量PTZ发现痉挛出现时间发生改变，表现为随时间推移，发作频率增加，事件间间隔和潜伏期缩短。

尽管在癫痫发作的起始、进展、终止和分类方面的研究已取得进展，但临床和实验性癫痫研究通常主要关注发作期（ictal periods），而忽视了发作前和发作后阶段。新兴证据表明，发作间期事件可显著影响发作期的网络动态^20,21，这凸显了在癫痫研究中进行全面的、多阶段行为表征的必要性。

多年来，PTZ 已成为一种强效的促惊厥剂²²，对新型抗癫痫药物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠溶液	Fresenius Kabi Brasil Ltda	74MK3168	封闭式静脉用系统；注射用溶液，250 mL。
分析天平	Shimadzu	ATY224	最大称量：220 g，最小称量：10 mg，可读性：0.1 mg。序列号：1311070096
摄像头	Jortan	Jortan-8816AHD	红外CCD摄像头，NTSC制式，2.0 MP分辨率，3.6 mm镜头，DC 12 V电源。
数字照度计	Minipa	MLM-1011	用于测量以勒克斯（lux）为单位的光照强度。
皮下注射针头	Descarpack	353101	规格26.5 G。
小鼠	-	-	雄性C57BL/6野生型小鼠，2至3月龄。
戊四氮	Sigma-Aldrich (Merck)	P6500-25G	粉末状，中枢神经系统兴奋剂。购买量：25 g。储存条件：-25 °C。
软件：MouseLabTracker	Giuliano Vilela	-	开源软件，参考文献：DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005。 网站：https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
软件：Solomon Coder	András Péter	-	开源软件，版本 v.19.08.02。 网站： https://solomon.andraspeter.com/
温湿度计	Hikari	HK-T240	用于测量温度和湿度。