方法文章

戊四氮诱导癫痫发作的行为学表征：超越Racine分级

2.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68112

⸱

2025年7月8日

 ,  , 
1Brain Institute, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

通讯作者： Claudio Marcos Queiroz <clausqueiroz@neuro.ufrn.br>

本文内容

摘要

该方案介绍了一种用于分析和可视化戊四氮诱导小鼠癫痫发作相关行为的创新方法。该方法超越了传统的Racine评分，能够更全面地评估发作期行为的多样性及其时间动态特征。

摘要

对癫痫动物模型中的发作行为进行详细表征至关重要。尽管目前存在多种诱导发作的实验方案，Racine量表仍是应用最广泛的发作量化方法。该量表最初用于评估在边缘系统结构电点燃过程中行为的逐步募集程度，此后已发展成为适用于不同病因模型中癫痫发作分类的标准方法。

然而，仔细观察戊四氮（PTZ）给药后的行为表现——一种常用的癫痫发作模型，可发现Racine分级法无法全面捕捉这种GABA能拮抗剂所诱导的全部行为改变。单次皮下注射高剂量PTZ后，小鼠首先出现非惊厥性行为，如肌张力减退、活动减少、行为静止和震颤。随后出现发作期行为，包括痉挛、肌阵挛性抽动和边缘系统性癫痫发作，但Racine分级法仅对后者进行量化。

为了克服这些局限性，采用了一种改进的方法，将视频标记与动物追踪相结合，以区分痉挛和肌阵挛与边缘性癫痫发作作为不同的行为表现。这些早期行为可能促进边缘系统结构的募集，最终触发边缘性癫痫发作。该方法易于实施，能够更全面地评估戊四氮（PTZ）诱导的急性癫痫发作。其应用价值在PTZ点燃模型中尤为明显，其中重复给予低剂量PTZ会导致痉挛、肌阵挛及边缘性癫痫发作严重程度随时间发生改变。该方法有望提高癫痫发作及癫痫研究的可重复性。

引言

行为学表征是癫痫及痫性发作活动病理生理学研究中最常用的观测指标，也广泛用于新型抗癫痫药物的筛选1,2。过去50年发表的大多数研究均采用Ronald J. Racine建立的渐进评分系统，用于描述杏仁核和海马点燃过程中的行为性痫性发作严重程度3。Racine量表在大鼠3和猫4中均显示出行为表现与脑电图阵发性电活动之间存在强相关性。该量表将痫性发作的行为表现分为五个渐进阶段：“(i) 口面部运动，(ii) 头部点头样动作，(iii) 前肢阵挛，(iv) 直立，以及 (v) 直立伴跌倒”3。由于其操作简便、易于解读、评分快速且具有良好的可重复性，即使在当今，Racine量表在癫痫和痫性发作研究中的应用仍在持续扩大（图1）。

年度引用次数趋势图；显示1970年至2024年间的增长趋势；出版物分析。
图1：Racine于1972年发表的研究每年获得的引用次数。请注意过去50年来引用次数的持续增长。2024年11月27日通过Web of Science检索显示，该研究共被引用6,040次，另有91条记录缺少“出版年份”信息。请点击此处查看此图的放大版本。

随后，该分级标准被应用于其他癫痫和惊厥的动物模型，包括使用药物诱导惊厥的模型。早期关于红藻氨酸诱导的惊厥5和癫痫持续状态（SE）6，以及局部7和全身性匹罗卡品诱导的癫痫持续状态（SE）8的研究，均采用Racine分级标准来量化诱发性和自发性惊厥。有趣的是，这些药物不仅诱发了如电刺激动物中所观察到的边缘系统惊厥（如Racine所述），还引发了一系列不同的行为表现，而这些行为在以往研究中描述较少或不够充分9。

研究人员在使用癫痫模型时，早期就已发现Racine量表在捕捉痫性发作行为多样性方面的局限性，尤其是在癫痫灶位于脑部非边缘系统区域的模型中。例如，Garcia-Cairasco是最早使用行为学工具评估听源性癫痫发作行为的研究者之一10，揭示了痫性发作行为的复杂性及其时间进程特征10,11。最近，Ivan Soltesz采用先进的视频深度分析和精细的时间编码方法，在电点燃大鼠模型中揭示了“隐匿的行为指纹”12。在这些研究基础上，本文提出了一种针对戊四氮诱导的小鼠急性癫痫发作的新型编码系统。

戊四氮（Pentylenetetrazole, PTZ）通过抑制GABA能神经传递13，导致神经元兴奋性升高以及神经元群体的同步激活14,15。在给予单次高剂量（40–80 mg/kg）全身性PTZ后，啮齿类动物表现出活动减少、非特异性胡须运动、全身痉挛和肌阵挛性抽动、口面部和前肢阵挛，以及完全发作的边缘系统癫痫16。与癫痫持续状态模型不同，PTZ引起的异常行为持续时间不超过1小时，并可自行缓解16,17,18。先前的研究者已提出针对大鼠17和小鼠18的Racine分级系统的修订版本。尽管这些研究试图更全面地反映发作期行为的多样性，但其新分级仅增加了一个或两个等级，分别对应“狂奔”和/或跳跃（6级，van Erum等18），以及导致呼吸停止的强直性伸展（7级，van Erum等18）。

本方案提出了一种量化和表征PTZ诱导的痫性发作行为的新方法，特别关注痉挛和肌阵挛。这些行为在全身性给予PTZ后最为常见，但在癫痫和惊厥研究中却常被忽视。因此，该方法通过提供识别痉挛和肌阵挛的具体标准，并在行为上将其与边缘性惊厥区分开来，填补了一项关键的方法学空白。结果表明，无论是单次还是重复给予PTZ，痉挛和肌阵挛均表现出独特的时间动态特征。该编码系统易于实施，可将异常活动的新参数整合到现有方法中，并为惊厥发生机制提供新的见解。最后，这一新策略有望在不同实验室之间实现痫性行为量化的标准化，提高研究的可重复性，并拓宽对惊厥机制的理解。

方案

所有实验程序均经北里奥格兰德联邦大学当地伦理委员会批准（方案编号 043/2022，许可证编号 307.043/2022）。本方案使用 3 至 4 月龄的雄性 C57BL/6 小鼠，根据已建立的 PTZ 诱导方案，建议样本量为 6–10 只动物16。

1. 观察区域的准备

  1. 使用一个方形或圆形的实验区域，其表面积至少为 10 x 10 cm，墙高 30 cm。确保实验区域光照充足。如有必要，使用红外照明以保证图像采集的饱和度（图 2A）。
  2. 在实验区域上方安装至少一台摄像机，使其能够俯视整个区域底部以及至少 10 cm 高的侧壁（以便完整捕捉小鼠直立行为而不裁剪头部，图 2B）。
  3. 如需获取正面视角，可增设第二台摄像机对准实验区域。此时应确保实验区域的一侧墙壁为透明材质。
  4. 确保环境温度（21–24 °C）和湿度（50–70%）与动物饲养设施条件一致，使用温湿度计进行监测并根据需要调整。
  5. 铺设适量垫料以覆盖实验区域底部，并确保动物与背景之间具有足够对比度以便观察。在整个实验过程中提供自由获取的水和饲料颗粒。
  6. 建议在光周期开始时启动实验（例如上午 7:00 至 10:00）。实验室内应维持恒定光照（900–1,100 lux），采用 12 小时光照/12 小时黑暗循环，光照从早上 6:00 开始。使用照度计检测靠近录像区域的光照条件，确保视频录制质量均匀一致。
  7. 将摄像机连接至视频记录设备，以每秒至少 24 帧（fps）的速度进行视频采集。

2. PTZ 溶液的配制

注意：癫痫样行为（即痉挛）可在剂量从 40 mg/kg 开始时诱发。在 60 mg/kg 及更高剂量下可观察到边缘系统癫痫发作。在 80 mg/kg 或更高剂量时，常出现伴随呼吸停止及死亡的强直性癫痫发作。在点燃实验方案中，采用 40 mg/kg 的剂量。

不同小鼠品系的剂量可能有所不同。建议进行预实验，以确定最适合研究问题的PTZ剂量。

  1. 通过系统注射向小鼠给予每公斤体重10 mL的剂量。因此，将PTZ粉末溶解于去离子水中，配制成终浓度为4或6 mg/mL的溶液（分别用于40和60 mg/kg的剂量）。
    注意：为减少实验变异，应为整个实验批次配制单一的PTZ溶液。

PTZ 给药

  1. 在将动物放入实验区域之前，使用天平测量其体重。
  2. 根据每只动物的体重计算所需PTZ溶液的体积。
    注意：对于60 mg/kg的剂量和30 g的体重，需向动物注射0.3 mL浓度为6 mg/mL的PTZ溶液。
  3. 在注射PTZ前至少记录1小时的行为。
    注意：此适应期可减少因新环境引起的活动和焦虑，同时可用于获取基础活动水平。
  4. 通过腹腔注射（i.p.）或皮下注射（s.c.）给予PTZ15,16。进行皮下注射时，用一只手固定动物，轻轻捏住其肩胛骨之间的皮肤（图2C）。
  5. 使用连接26½ G针头的1 mL注射器，将针头平行于动物体轴方向插入皮下空间，并缓慢将溶液注入皮下。注射完成后，轻轻拔出针头，同时用手按住针头退出处的皮肤，以避免因腔内压力导致溶液溢出（图2C）。
    ​注意：注射速度不可过快，否则溶液快速积聚可能导致注射部位溢出或拔针时泄漏。
  6. 记录任何泄漏情况，因其会影响痫性行为的表现。可考虑立即追加注射50 µL相同PTZ溶液。
  7. 将动物重新放回实验区域，进行1小时的连续视频记录。
  8. 在PTZ注射后1小时（或更长时间）停止记录，并复制文件用于后续处理（视频追踪和行为编码）。

Mouse tracking setup in behavioral experiment; diagrams show maze, monitoring system, data analysis.
图2实验装置与注射操作步骤 (A使用四个透明的方形实验区域，上方中央设有俯视摄像机，用于记录给药PTZ前后动物的行为并追踪其位置。B) 使用上述装置获得的一个代表性视频的截图 A. (C皮下注射PTZ的示例。将针头插入动物肩胛骨之间的皮下间隙。D行为数据采集与分析方法的示意图，用于本研究。 请点击此处以查看此图的放大版本。

4. 动物福利

  1. 如果癫痫发作持续超过5分钟，应立即移除并实施安乐死，以防止细胞死亡和脑组织损伤，尤其是在重复注射实验方案中。
  2. 在整个实验期间，每天监测动物的体重。
  3. 监测动物的一般状况，包括摄食情况、运动能力、姿势、理毛行为以及疼痛或痛苦的迹象。
  4. 根据需要给予抗炎治疗（布洛芬，5 mg/kg）及镇痛管理。必要时提供补充食物或水。
  5. 若动物出现无法通过个体补充在2天内恢复的超过20%的体重减轻、表皮病变，或任何对药物治疗无反应的慢性疼痛或不适症状，应予以移除。
  6. 所有动物的安乐死操作须遵循国际和机构伦理指南进行。

5. 软件安装、配置与使用

  1. 本研究中所述分析需使用 MouseLabTrack19 和 Solomon Coder。请下载并按照安装流程操作（参见 补充文件 1 和 补充文件 2）。
    注意：MouseLabTrack 在 MATLAB 框架下运行，而 Solomon Coder 是适用于 Windows 操作系统的可执行程序。两款软件均为开源软件。
  2. 在 Windows 开始菜单 中点击 Solomon，或搜索 Solomon Coder 并打开该软件。
    1. 若已有配置文件（参见 补充文件 3），请前往 文件 | 加载配置，屏幕将加载预设参数。
    2. 若无配置文件，
      1. 在空白区域右键单击以创建新按钮，再右键单击新创建的按钮以打开 配置 界面。
      2. 在 按钮名称 字段中，将按钮重命名为所需行为的名称。
      3. 在 按钮显示颜色 字段中，选择一种颜色。
      4. 在 类别 字段中，将 默认 重命名为 行为（该名称将作为列名）。
      5. 在 快捷键 字段中，分配一个键盘按键用于在视频分析过程中标记行为（例如按键“1”）。
      6. （可选）若事件为瞬时事件，请勾选快捷键上方的复选框，表示按键按下并释放时仅记录一次事件；若未勾选，则行为将持续记录直至按键释放。
    3. 要打开视频，请前往 文件 | 打开视频。
    4. 点击 播放 以开始播放视频。
    5. 当观察到行为时，点击鼠标左键或按下指定的键盘按键进行标记。
    6. 若要将数据保存为逗号分隔值（.csv）文件，请前往 分析 | 另存输出为；若要保存 Solomon 编码表（.arch 文件），请前往 文件 | 保存编码表。
  3. 打开并加载 MouseLabTracker 的步骤如下：
    1. 启动 MATLAB，在控制台中输入 `main()`，然后按 回车。
    2. 点击打开按钮以加载视频。加载完成后，相邻屏幕将显示视频，背景为绿色，动物呈白色。
    3. 指定视频中需分析的时间区间。点击 开始 以设定分析起始点，点击 结束 以设定分析终止点。
      注意：若未设置时间区间，软件将分析整个视频。
    4. 要配置追踪参数，请进入 追踪设置 选项卡。
      1. 选择 深色物体 / 浅色背景，表示动物颜色比背景更深。
      2. 如需调整动物数量，请进入 对象 并将数量更改为 1。
      3. 如需调整检测参数，请修改 阈值参数设置，使半径值保持在 30 至 40 之间。
      4. 通过点击 颜色 并选择适当颜色来定义动物的颜色。
      5. 要定义实验区域，请点击 定义区域，然后依次选择区域的左上角和右下角。
    5. 点击 追踪 以开始追踪过程。等待进度条达到 100%。
    6. 追踪完成后，点击 保存结果 以保存分析输出文件。

6. 编码行为

  1. 首先，在小鼠被放入观察区域后重新出现在视频画面中时，标记PTZ给药时间。此时刻作为时间零点，用于所有其他行为（包括潜伏期计算）的时间参考。
  2. 在PTZ注射后数分钟内观察痉挛和肌阵挛（图3），随后可能出现边缘性癫痫发作。痉挛表现为短暂、瞬时且快速的轴向肌肉收缩，包括双侧耳部屈曲、背部肌肉收缩、尾巴竖起（Straub尾）以及罕见的惊跳反应（图3A）。将痉挛编码为离散事件，将其与单个视频帧关联，不记录持续时间。
    注意：量化痉挛表现中不同身体部位的多样性和组合方式（见代表性结果部分）。
  3. 编码肌阵挛时，观察持续时间超过200 ms的事件；其特征为涉及头部、颈部和前爪的突然而强烈的肌阵挛性抽动。可能伴随震颤和身体姿势丧失（图3B）。亚分类包括伴有震颤的肌阵挛，或伴有向前、向左或向右姿势丧失的肌阵挛。持续时间通常为1至2秒。由于持续时间较长，单次肌阵挛事件需在多个时间单位中进行编码。
  4. 编码边缘性癫痫发作时，观察类似于Racine描述的事件，并使用Racine量表进行编码。其通常以行为静止或凝视开始，随后出现嗅觉和味觉自动症、口面部运动、前肢和/或头部肌阵挛、直立（伴或不伴跌倒）、狂奔或跳跃，以及伴有呼吸暂停的强直性发作。使用改良的Racine量表18对持续时间超过10–15秒、且可与痉挛和肌阵挛区分的边缘性癫痫发作进行亚分类。
  5. 根据实验方案增加其他行为类别，以实现更全面的行为筛查。
  6. 在单一时间帧标记记录会话的结束时间（PTZ注射后1小时）。若动物在强直性发作后死亡，用结束标记标明死亡时间。
    ​注意：编码表可在编码过程中的任意时间点保存，并可根据需要在软件中重新打开，以继续编码或进行修改。

癫痫发作期间小鼠行为分析；图中显示痉挛、肌阵挛和边缘系统发作阶段。
图 3：PTZ 给药后观察到的发作期行为快照。（A）这是 PTZ 注射后观察到的早期痉挛的代表性示例。所有帧均显示（采样速率为 30 fps）。请注意，该痉挛持续时间少于 200 ms，并沿头尾方向传播。在此示例中，未出现明显的尾巴抬高现象。（B）与前倾相关的肌阵挛的代表性示例。在此示例中，肌阵挛持续超过 1 秒，期间出现多次尾部和前肢阵挛。（C）边缘系统发作的代表性示例。在 Racine 1 期之前，小鼠表现出持续的肢体肌阵挛，包括身体姿势丧失。该序列展示了传统 Racine 评分标准的全部五个阶段。在此情况下，小鼠的评分为 5 分。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 数据分析与可视化

  1. 通过从编码表中记录的时间减去PTZ注射时间，计算每种行为类别（例如，痉挛、肌阵挛、癫痫发作等）首次出现的潜伏期。
  2. 计算每次肌阵挛和癫痫发作事件的持续时间，然后将其相加，得到每个类别的总持续时间。
  3. 通过将事件总数除以记录时长，计算每种行为的发生率。
  4. 通过计算连续事件之间的时间差，确定每种行为的事件间间隔。
  5. 在适用情况下，根据每次记录会话中痫性行为的时间分布定义发作期。针对每个发作期计算上述参数。
    注意：癫痫发作结束后会进入发作后抑制期，标志着本方案中一个发作期的结束；痫性行为再次出现则标志新发作期的开始。
    注意：若无癫痫发作，应根据痉挛和肌阵挛的时间分布对记录会话进行分类。
  6. 对每组数据使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。
  7. 对于多组之间的参数检验，采用单因素方差分析（ANOVA）；对于配对数据，根据数据结构使用配对t检验或重复测量方差分析。
  8. 设定统计学显著性为p值< 0.05。此外，将低于0.0001的p值四舍五入并报告为<0.0001。

结果

为了评估编码策略及其在记录PTZ诱导癫痫发作期间行为表现方面的能力，首先测试了三种剂量的PTZ，并观察其对C57BL/6小鼠的影响（分别为40、60和80 mg/kg，每组动物数N = 7、5和5）。在单次注射后，三种PTZ剂量下观察到的行为结果显示出明显的剂量依赖性差异。接受40 mg/kg PTZ处理的小鼠仅出现痉挛，但无边缘系统癫痫发作或肌阵挛。相比之下，接受60和80 mg/kg PTZ处理的小鼠则持续表现出痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作。接受40或60 mg/kg PTZ的小鼠死亡率为0%。然而，在80 mg/kg剂量下，死亡率高达80%，通常继发于强直性发作后的呼吸停止。基于这些结果，选择60 mg/kg剂量用于单次注射和每周注射，40 mg/kg用于每日注射。

接下来，对C57Bl/6小鼠（N = 15，60 mg/kg，皮下注射）给予单次PTZ注射，并在注射后1小时内分析其行为。PTZ给药可诱导一系列超出Racine分级所定义的边缘性癫痫发作的行为，包括痉挛和肌阵挛。这些行为可利用本文所介绍的编码系统进行便捷的表征分析（图3 和 图4；参见方案第5节）。图4 详细列出了该编码系统可提取的参数，包括每种痫性行为的潜伏期、事件次数、事件持续时间、事件间歇以及边缘性癫痫发作的严重程度。

痉挛、肌阵挛、边缘系统癫痫发作时间线图表；癫痫研究中PTZ注射分析。
图4：编码方案期间获得的参数。 在PTZ注射后应用的编码方案可用于计算每种痫性行为（包括痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作）的关键参数，如发作潜伏期、事件总次数、事件间间隔、肌阵挛和边缘系统癫痫发作的持续时间，以及边缘系统癫痫发作的严重程度。请点击此处查看该图的放大版本。

如上所述，痉挛的特征是突然发作且持续时间极短（<500 ms），表现为眼睛闭合、耳部屈曲、躯干僵硬以及尾巴上举（见图3A、图5A和补充视频S1）。根据痉挛发生时的身体姿势不同，并非所有身体部位都会参与。此外，痉挛的强度也可能存在差异。偶尔可观察到单次跳跃动作。根据参与的身体部位对痉挛进行亚分类发现，在75%的事件中出现了躯干收缩（图5B），而仅有少数事件（6%）仅涉及尾巴激活（即耳朵或躯干未参与）。

肌阵挛性抽动与痉挛一样具有突然发作的特点，但通常持续时间更长（1-2 秒，参见图3B和补充视频S1）。其表现形式多样，可表现为全身性颤抖和局部震颤（64%，图5C），和/或持续性的肢体阵挛。这种阵挛性活动通常以头部向下运动、闭眼和尾巴抬高开始，随后出现前肢阵挛和后肢伸展，推动身体向前或侧向移动。少数情况下，痉挛与肌阵挛之间的区别不明确；此类事件被归类为“模糊性事件”。

两名观察者之间的一致性百分比在亚分类中显示出中等程度的分类相似性（Cohen's Kappa = 0.65，95% 可信区间 [0.52, 0.78]）。尽管这种中等一致性反映了身体部位分类的复杂性，但在痉挛和肌阵挛的类别分类中达到了高度一致（Cohen's Kappa = 0.85，95% 可信区间 [0.78, 0.92]）。

癫痫发作模式的脑电图分析；图A-C显示事件数据，D-G展示统计结果。
图 5：PTZ 给药后痫性行为的时间动态可视化与定量分析。（A）一次典型实验过程的代表性示例。（B）痉挛亚类所占百分比。（C）肌阵挛亚类所占百分比。（D）首次出现痉挛、肌阵挛及边缘系统癫痫发作的潜伏期。（E）PTZ 注射后 1 小时内观察到的痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作的总次数。（F）痉挛与肌阵挛事件之间的中位事件间歇。（G）肌阵挛与边缘系统癫痫发作的中位持续时间。缩写：e = 耳部；tr = 躯干；tl = 尾部。请点击此处查看该图的放大版本。

在所有实验中，边缘系统癫痫发作仅在多次痉挛和肌阵挛之后出现，且仅在给予60 mg/kg PTZ后偶尔发生。这些癫痫发作始于突然而持续的全身性肌阵挛，随后逐渐减弱，进而表现出如Racine最初描述的边缘系统癫痫发作特征（见图3C和补充视频S1）。简而言之，动物会出现口面部运动或胡须震颤，随后出现头颈部阵挛、前肢阵挛、直立、以及直立伴跌倒。注意在边缘系统癫痫发作后出现行为停滞，但在痉挛和肌阵挛后则无此现象（图5A）。小鼠可能出现强直性癫痫发作，常导致呼吸停止和死亡（7期18，未示出）。对这些行为的量化分析揭示了PTZ诱发的痫样活动具有更广泛的多样性（图5D-G）。

痉挛、肌阵挛和边缘性癫痫发作首次出现的潜伏期之间存在统计学上的显著差异（F(2, 30) = 17.04，p < 0.0001，单因素方差分析，图5D），事后分析显示痉挛与肌阵挛之间存在显著差异（[Tukey HSD = -276.75，95% CI = [-546, -6]，Cohen's d = -1.35，p = 0.0436），以及痉挛与癫痫发作之间存在显著差异（Tukey HSD = -794.75，95% CI = [-1131, -458]，Cohen's d = -2.73，p < 0.0001）。不同痫性行为事件的总次数也存在显著差异（F(2, 42) = 35.70，p < 0.0001，单因素方差分析，图5E），事后分析显示痉挛与肌阵挛之间存在显著差异（Tukey HSD = 81.87，95% CI = [48, 115]，Cohen's d = 1.75，p < 0.0001），以及痉挛与癫痫发作之间存在显著差异（Tukey HSD = 113.66，95% CI = [79, 147]，Cohen's d = 2.82，p < 0.0001）。在计算痉挛和肌阵挛的事件间中位间隔时，未发现统计学差异（t(24) = 0.31，p = 0.7580，非配对T检验，图5F）。然而，肌阵挛与边缘性癫痫发作的中位持续时间存在显著差异，后者持续时间更长（t(16) = -17.83，p < 0.0001，95% CI = [-19, -14]，Cohen's d = -8.91，非配对T检验，图5G）。

基于性别的比较显示，雄性和雌性在肢体性癫痫发作的潜伏期上存在显著差异，雄性的潜伏期长于雌性（t(5) = 3.31，p = 0.0185，非配对 T 检验）。雄性较长的潜伏期可能解释了该组中观察到的痉挛和肌阵挛事件数量增加，因为更长的发作前时间窗允许更多事件发生。在事件间歇间隔、痉挛或肌阵挛的潜伏期，以及肢体性癫痫发作和肌阵挛的持续时间方面，未发现显著的性别差异，表明一旦这些事件被触发，其时间动态在两性之间具有可比性。此外，雄性和雌性在肢体性癫痫发作的发生率上相似（6/12 对比 5/10，OR = 1.00，p = 1.000，Fisher 精确检验），提示性别不影响癫痫发作的可能性。统计结果详见表1。

这些发现强调了痉挛和肌阵挛作为癫痫发作分析关键指标的重要性，因为它们在边缘系统癫痫发作前后频繁出现，凸显了其在理解癫痫发作进展和动态变化中的潜在作用。

雄性（均值 ± 标准差）雌性（均值 ± 标准差）t 值p 值
痉挛
潜伏期（s）169.88 ± 136.51158.84 ± 155.440.170.8628
事件次数95.0 ± 44.451.2 ± 18.23.110.0070
事件间间隔（s）22.62 ± 18.5618.98 ± 11.580.560.5811
肌阵挛
潜伏期（s）381.27 ± 272.81628.80 ± 574.96-0.820.4623
事件次数21.58 ± 32.692.50 ± 4.771.990.0699
持续时间（s）1.79 ± 0.431.62 ± 0.671.990.6510
事件间间隔（s）91.12 ± 82.5056.92 ± 41.720.820.4630
边缘系统癫痫发作
潜伏期（s）787.77 ± 362.68285.20 ± 71.303.310.0185
持续时间（s）10.28 ± 11.399.10 ± 9.660.260.7947

表1：痉挛与肌阵挛发作中的性别比较以及给予PTZ后对肢体和边缘性癫痫发作的评估。 雄性（n = 12）和雌性（n = 10）接受单次PTZ注射（60 mg/kg，皮下）。显示雄性和雌性的均值 ± 标准差，以及 t-统计量和 p非配对双尾检验的 p 值 t检测

为了在更精细的时间尺度上考察重复给予戊四氮（PTZ）对行为的影响，采用了两种重复注射方案。第一种方案中，PTZ剂量降低至40 mg/kg（皮下注射），在8天内每日给予一组10只动物（图6A）。该方法旨在评估低剂量PTZ重复给药的累积效应是否能够揭示痫性发作行为动态的细微变化。在整个观察期间，动物主要表现为痉挛，仅有一只动物在第8天出现两次惊厥发作，且第二次发作前数秒出现短暂的肌阵挛。数据分析显示，首次痉挛的潜伏期存在显著差异（F(7,63) = 5.11，p = 0.0001，重复测量方差分析，图6C），事后分析表明第1天与第8天之间存在明显差异（Tukey HSD = -160.06，95% CI [-283, -36]，Cohen's d = -2.30，p = 0.0032）。

此外，痉挛总次数在数日内显著增加，并在最后一天达到峰值（F(7,63) = 13.20，p < 0.0001，重复测量方差分析，图6D）。第1天与第8天之间的比较显示存在显著差异（Tukey HSD = 68.60，95% CI = [37, 99]，Cohen's d = -2.45，p < 0.0001）。最后，痉挛间期中位数显著缩短（F(7,63) = 11.06，p < 0.0001，重复测量方差分析，图6E），且事后分析表明第一天与最后一天之间存在明显差异（Tukey HSD = -79.82，95% CI [-120, -38]，Cohen's d = 2.62，p < 0.0001），提示随着PTZ注射的进行，痉挛在时间上更加集中，发生频率加快。

接下来，每周进行一次PTZ注射（60 mg/kg，皮下注射），持续3周，每次注射后观察并记录1小时的行为表现（N = 8）。图6B展示了其中一只代表性动物在3周内的行为编码结果。首次痉挛的潜伏期显著缩短（F(2,14) = 4.82，95% CI = [-227, 22]，Cohen's d = 0.91，p = 0.0255，重复测量方差分析，图6F）。相比之下，痉挛总次数在各周之间无显著变化（F(2,14) = 1.08，p = 0.3657，重复测量方差分析，图6G），而痉挛间歇时间则有所减少（F(2,14) = 5.21，p = 0.0203，重复测量方差分析，图6H），且第1周与第3周之间存在显著差异（Tukey HSD = 17.3，95% CI = [-32, -2]，Cohen's d = -1.22，p = 0.0211）。

有趣的是，边缘系统癫痫发作的潜伏期在数周内也表现出显著缩短（F(2,9) = 11.52，p = 0.0033，单因素方差分析，图6I），其中第1周与第3周之间差异显著（Tukey HSD = -787.85，95% CI = [-1247, -328]，Cohen's d = -4.17，p = 0.0026）。同时伴有边缘系统癫痫发作频率的增加，第1周仅有一半动物出现该事件，而第2周和第3周则达到100%（X²(2) = 9.60，p = 0.0082，卡方检验）。在这些变化中，数据显示在3周时间内，边缘系统癫痫发作的总持续时间也有所增加（F(2,9) = 8.44，p = 0.0086，单因素方差分析，图6J），事后分析显示第1周与第3周之间差异显著（Tukey HSD = -12.5，95% CI [3, 21]，Cohen's d = 2.38，p = 0.012）。总体而言，数据表明动物在数周内倾向于出现潜伏期缩短且持续时间更长的边缘系统癫痫发作。

PTZ 注射时间线、痉挛指标的箱线图、潜伏期、事件数和间隔的统计学数据。
图 6：痉挛和肌阵挛在两次重复注射方案中提供额外信息。（A）每日注射 40 mg/kg PTZ 的代表性示例，该方案在此例中导致痉挛数量逐渐增加，仅在观察的最后一天诱发肌阵挛和边缘系统癫痫发作。（B）每周注射一次方案中痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作演变的代表性示例。（C,D）每日注射方案中参数的量化：（C）首次痉挛的潜伏期，（D）痉挛总次数，以及（E）痉挛间中位间隔时间。（F-J）每周注射方案（60 mg/kg）中参数的量化：（F）首次痉挛的潜伏期，（G）痉挛总次数，（H）痉挛间中位间隔时间，（I）首次边缘系统癫痫发作的潜伏期，以及（J）边缘系统癫痫发作的总持续时间。请点击此处查看该图的放大版本。

在为期3周的实验中，肌阵挛性抽搐的潜伏期（F(2,6) = 2.36，p = 0.1743，单因素方差分析）、总次数（F(2,6) = 0.17，p = 0.8439，单因素方差分析）和持续时间（F(2,6) = 1.06，p = 0.4006，单因素方差分析）均未表现出显著差异。值得注意的是，边缘系统癫痫发作的严重程度每周趋于加重，其中8只动物中有3只在第三次注射后因强直性边缘系统癫痫发作引发呼吸和/或心脏骤停而死亡。

补充文件1：使用Solomon进行视频分析的操作说明。 请点击此处下载该文件。

补充文件2：使用MouseLabTrack进行视频追踪的操作说明。 请点击此处下载该文件。

补充文件3：Solomon中的一个配置文件示例。 请点击此处下载该文件。

补充视频 S1：PTZ 给药后观察到的代表性行为。 该视频显示了两种不同强度的痉挛——分别为剧烈和轻度痉挛，随后出现两次连续的肌阵挛，并最终发展为边缘系统癫痫发作。此序列表现了本研究中所描述和量化的一系列发作期运动行为谱。 请点击此处下载该文件。

讨论

本研究采用基于运动表征的行为分类方法，为分析癫痫发作动态提供了更全面的框架。该方法能够量化关键参数，包括痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作的潜伏期、持续时间和频率。每周注射PTZ的结果显示，反复暴露显著改变了边缘系统癫痫发作的时间特征和频率，首次痉挛和边缘系统癫痫发作的潜伏期明显缩短，同时边缘系统癫痫发作的持续时间延长。此外，每日注射较低剂量PTZ发现痉挛出现时间发生改变，表现为随时间推移，发作频率增加，事件间间隔和潜伏期缩短。

尽管在癫痫发作的起始、进展、终止和分类方面的研究已取得进展，但临床和实验性癫痫研究通常主要关注发作期（ictal periods），而忽视了发作前和发作后阶段。新兴证据表明，发作间期事件可显著影响发作期的网络动态20,21，这凸显了在癫痫研究中进行全面的、多阶段行为表征的必要性。

多年来，PTZ 已成为一种强效的促惊厥剂22，对新型抗癫痫药物的研发、筛选及疗效测试做出了重要贡献23早期对PTZ模型的应用包括评估药物的抗惊厥特性24,25 并确立PTZ作为癫痫发作进展和药物测试的模型26然而，尽管诱导方法存在差异27，无论是电刺激还是化学诱导的癫痫发作——以及所涉及的神经递质系统（胆碱能、谷氨酸能或GABA能）——化学诱导的行为性癫痫发作主要采用Racine评分标准进行评估。然而，大多数癫痫模型均依赖于Racine评分标准，该标准最初是为杏仁核点燃模型所建立的3 且已证明无法捕捉由其他方法诱发的发作期行为28传统的Racine评分虽然被广泛使用，但无法充分捕捉发作间期以外的行为，导致对发作间期行为的描述存在显著空白12.

在此基础上，Lüttjohann 及其合作者17对 Racine 量表进行了改良，用于描述急性戊四氮（PTZ）诱导的边缘系统癫痫发作期间观察到的行为，并将这些行为与大鼠的脑电图活动相关联。随后，类似的方法也被应用于小鼠，并进一步将行为与电生理学特征进行了关联18。这些研究扩展了PTZ诱导癫痫发作期间可观察行为的范围，包括识别出肌阵挛现象。尽管痉挛和肌阵挛是PTZ模型中已知的行为特征，但此前尚无研究对这些事件进行量化，或评估其在整个癫痫发作过程中的时间动态变化。虽然已有研究建立了将发作期行为归类为不同类别的系统，但这些行为事件并非完全独立。相反，它们代表了一系列连续的表型，常常相互重叠，导致某些事件难以明确界定。此外，确定参与这些行为的具体身体部位是一项复杂且耗时的任务，需要细致的观察。因此，在每次分类过程中，必须权衡可达到的细节程度与可用时间之间的利弊。

很少有研究对边缘系统癫痫发作的特征（如潜伏期和持续时间）进行详细分析，而针对癫痫发作之外行为的研究则更为稀少，其中不一致性和缺乏标准化方案等因素影响了诱导性癫痫发作的可重复性及表型表达29。此外，癫痫行为的主观性和人工评分耗时较长，且高度依赖观察者的专业经验以及在大量视频数据中行为的可视性。这种依赖性可能限制行为学研究的可重复性。新兴技术如半监督自动化分析方案12，有望实现高通量的行为分析，不仅可提高评分的准确性与一致性，还能促进对大规模数据集中癫痫相关行为的全面表征。

本研究的局限性之一是在某些戊四氮（PTZ）注射后未出现边缘系统癫痫发作。这一现象已有报道，即在特定条件下，戊四氮给药未能诱导出边缘系统癫痫发作，这凸显了该药物的剂量依赖性效应30。高剂量戊四氮注射与较高的死亡率相关，可能阻碍纵向研究的开展；而低剂量应用虽然更安全，但可观察到的边缘系统癫痫发作较少，且需要更长的实验周期和重复注射16。此外，边缘系统癫痫发作的表现因遗传背景不同而存在显著差异。例如，C57BL/6小鼠与其他品系相比，在行为学和癫痫表型上表现出明显不同，其发作严重程度和发生率均存在差异31。这些差异提示有必要评估本研究中描述的行为模式是否适用于不同小鼠品系和癫痫模型，从而提升研究结果的广泛适用性和可重复性。

在肢体性癫痫发作的潜伏期方面观察到显著的性别差异，雌性个体发作潜伏期较雄性更短。雌性潜伏期较短可能导致痉挛和肌阵挛发作次数减少，因为这些行为通常出现在肢体性癫痫发作之前，一旦癫痫活动开始，这些前驱症状即被抑制。在癫痫发作发生率、事件间歇时间以及痉挛和肌阵挛发作潜伏期方面未发现性别相关差异，表明在此模型中性别对这些事件的整体表现无显著影响。这些结果与先前研究部分一致，提示在特定剂量戊四氮（PTZ）下，雌性可能对肢体性癫痫发作更易感，尽管雄性表现出更严重的评分3233。

未来的研究应探讨此处描述的行为模式是否在其他癫痫和癫痫发作模型中得以保留，例如由匹罗卡品或红藻氨酸诱导的癫痫持续状态，这些模型通过不同的机制触发癫痫发作，因而可能产生不同的行为表型2,6,8。此类比较对于评估这些发现在不同癫痫诱导模型中的可重复性和普适性至关重要。

最后，仍需进一步研究以确定这些发作性事件——痉挛和肌阵挛——是否直接与边缘系统癫痫发作相关，或代表涉及不同神经环路的独立病理生理过程。明确它们在癫痫发作动态中的作用，有助于理解阵发性电活动在较短时间尺度（例如数分钟内）的演变过程，并为开发新的治疗干预措施提供依据。此外，痉挛和肌阵挛在新型抗癫痫药物的筛选与研发中的意义仍有待明确。

总体而言，该方案强调了由戊四氮（PTZ）诱导的发作期行为的复杂性与多样性，凸显出有必要建立一种超越传统癫痫发作评分方法的分类体系。通过对痉挛、肌阵挛和边缘性发作进行系统性表征，该方法为分析癫痫发作动态提供了全面的工具，揭示了不同行为之间独特的时间模式及其相互关系。本研究特别强调分析发作间期以外时段的重要性，这些时段常被忽视，却对理解癫痫发作的进展过程及潜在的神经网络动态至关重要。这些发现进一步证明了PTZ作为研究癫痫相关现象模型的价值，并为癫痫复杂行为表现的机制提供了新的见解。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分得到了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq，资助号 308110/2020-0 和 316441/2023-6）、南里奥格兰德联邦大学科研促进基金会（FAPERN，资助号 042/2022）以及高等级人才培养协调基金会（CAPES，资助号 #385/2019）和南里奥格兰德联邦大学科研处（Propesq-UFRN，资助号 PVP18039-2020）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液Fresenius Kabi Brasil Ltda74MK3168封闭式静脉用系统；注射用溶液，250 mL。
分析天平ShimadzuATY224最大称量：220 g，最小称量：10 mg，可读性：0.1 mg。序列号：1311070096
摄像头JortanJortan-8816AHD红外CCD摄像头，NTSC制式，2.0 MP分辨率，3.6 mm镜头，DC 12 V电源。
数字照度计MinipaMLM-1011用于测量以勒克斯（lux）为单位的光照强度。
皮下注射针头Descarpack353101规格26.5 G。
小鼠--雄性C57BL/6野生型小鼠，2至3月龄。
戊四氮Sigma-Aldrich (Merck)P6500-25G粉末状，中枢神经系统兴奋剂。购买量：25 g。储存条件：-25 °C。
软件：MouseLabTracker Giuliano Vilela-开源软件，参考文献：DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005。
网站：https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
软件：Solomon CoderAndrás Péter-开源软件，版本 v.19.08.02。
网站： https://solomon.andraspeter.com/
温湿度计HikariHK-T240用于测量温度和湿度。

参考文献

  1. Rogawski, M. A., Löscher, W. The neurobiology of antiepileptic drugs. Nat Rev Neurosci. 5 (7), 553-564 (2004).
  2. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  3. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  4. Delgado, J. M. R., Sevillano, M. Evolution of repeated hippocampal seizures in the cat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 13 (5), 722-733 (1961).
  5. Lothman, E. W., Collins, R. C. Kainic acid induced limbic seizures: metabolic, behavioral, electroencephalographic and neuropathological correlates. Brain Res. 218 (1-2), 299-318 (1981).
  6. Lévesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neurosci Biobehav Rev. 37 (10 Pt 2), 2887-2899 (2013).
  7. Castro, O. W., et al. Comparative neuroanatomical and temporal characterization of FluoroJade-positive neurodegeneration after status epilepticus induced by systemic and intrahippocampal pilocarpine in Wistar rats. Brain Res. 1374, 43-55 (2011).
  8. Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
  9. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  10. Garcia-Cairasco, N., et al. New insights into behavioral evaluation of audiogenic seizures. A comparison of two ethological methods. Behav Brain Res. 48 (1), 49-56 (1992).
  11. Garcia-Cairasco, N., Rossetti, F., Oliveira, J. A. C., Furtado, M. deA. Neuroethological study of status epilepticus induced by systemic pilocarpine in Wistar audiogenic rats (WAR strain). Epilepsy Behav. 5 (4), 455-463 (2004).
  12. Gschwind, T., et al. Hidden behavioral fingerprints in epilepsy. Neuron. 111 (9), 1440-1452.e5 (2023).
  13. Macdonald, R. L., Barker, J. L. Specific antagonism of GABA-mediated postsynaptic inhibition in cultured mammalian spinal cord neurons: a common mode of convulsant action. Neurology. 28 (4), 325-330 (1978).
  14. Dhir, A. Pentylenetetrazol (PTZ) kindling model of epilepsy. Curr Protoc Neurosci. 58 (1), 9.37.1-9.37.12 (2012).
  15. Samokhina, E., Samokhin, A. Neuropathological profile of the pentylenetetrazol (PTZ) kindling model. Int J Neurosci. 128 (11), 1086-1096 (2018).
  16. Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-induced kindling mouse model. J Vis Exp. (136), e56573(2018).
  17. Lüttjohann, A., Fabene, P. F., Van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  18. Van Erum, J., Van Dam, D., De Deyn, P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy Behav. 95, 51-55 (2019).
  19. Tort, A. B. L., et al. A simple webcam-based approach for the measurement of rodent locomotion and other behavioural parameters. J Neurosci Methods. 157 (1), 91-97 (2006).
  20. Gelinas, J. N., Khodagholy, D., Thesen, T., Devinsky, O., Buzsáki, G. Interictal epileptiform discharges induce hippocampal-cortical coupling in temporal lobe epilepsy. Nat Med. 22 (6), 641-648 (2016).
  21. Nizinska, K., et al. Behavioral characteristics as potential biomarkers of the development and phenotype of epilepsy in a rat model of temporal lobe epilepsy. Sci Rep. 11 (1), 8665(2021).
  22. Monteiro, ÁB., et al. Pentylenetetrazole: A review. Neurochem Int. 180, 105841(2024).
  23. Barker-Haliski, M., Steve White, H. Validated animal models for antiseizure drug (ASD) discovery: Advantages and potential pitfalls in ASD screening. Neuropharmacology. 167, 107750(2020).
  24. Santucci, V., et al. EEG effects of IV infusion of pentylenetetrazol in rats: A model for screening and classifying antiepileptic compounds. Psychopharmacology. 87 (3), 337-343 (1985).
  25. Swinyard, E. A., Brown, W. C., Goodman, L. S. Comparative assays of antiepileptic drugs in mice and rats. J Pharmacol Exp Ther. 106 (3), 319-330 (1952).
  26. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  27. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  28. McIntyre, D. C., Poulter, M. O., Gilby, K. Kindling: some old and some new. Epilepsy Res. 50 (1-2), 79-92 (2002).
  29. Yuskaitis, C. J., et al. Factors influencing the acute pentylenetetrazole-induced seizure paradigm and a literature review. Ann Clin Transl Neurol. 8 (7), 1388-1397 (2021).
  30. da Silva, L. F., Pereira, P., Elisabetsky, E. A Neuropharmacological analysis of PTZ-induced kindling in mice. Gen Pharmacol. 31 (1), 47-50 (1998).
  31. Copping, N. A., Adhikari, A., Petkova, S. P., Silverman, J. L. Genetic backgrounds have unique seizure response profiles and behavioral outcomes following convulsant administration. Epilepsy Behav. 101, 106547(2019).
  32. Medina, A. E., Manhães, A. C., Schmidt, S. L. Sex differences in sensitivity to seizures elicited by pentylenetetrazol in mice. Pharmacol Biochem Behav. 68 (3), 591-596 (2001).
  33. Pollo, M. L. M., Gimenes, C., Covolan, L. Male rats are more vulnerable to pentylenetetrazole-kindling model but females have more spatial memory-related deficits. Epilepsy Behav. 129, 108632(2022).

重印与许可

标签

GABA
戊四氮诱导癫痫发作的行为学表征：超越Racine分级
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。