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方法文章

戊四氮诱导癫痫发作的行为学表征：超越Racine分级

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DOI：

10.3791/68112

⸱

2025年7月8日

 ,  , 
1Brain Institute, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

通讯作者： Claudio Marcos Queiroz <clausqueiroz@neuro.ufrn.br>

本文内容

摘要

该方案介绍了一种用于分析和可视化戊四氮诱导小鼠癫痫发作相关行为的创新方法。该方法超越了传统的Racine评分，能够更全面地评估发作期行为的多样性及其时间动态特征。

摘要

对癫痫动物模型中的发作行为进行详细表征至关重要。尽管目前存在多种诱导发作的实验方案，Racine量表仍是应用最广泛的发作量化方法。该量表最初用于评估在边缘系统结构电点燃过程中行为的逐步募集程度，此后已发展成为适用于不同病因模型中癫痫发作分类的标准方法。

然而，仔细观察戊四氮（PTZ）给药后的行为表现——一种常用的癫痫发作模型，可发现Racine分级法无法全面捕捉这种GABA能拮抗剂所诱导的全部行为改变。单次皮下注射高剂量PTZ后，小鼠首先出现非惊厥性行为，如肌张力减退、活动减少、行为静止和震颤。随后出现发作期行为，包括痉挛、肌阵挛性抽动和边缘系统性癫痫发作，但Racine分级法仅对后者进行量化。

为了克服这些局限性，采用了一种改进的方法，将视频标记与动物追踪相结合，以区分痉挛和肌阵挛与边缘性癫痫发作作为不同的行为表现。这些早期行为可能促进边缘系统结构的募集，最终触发边缘性癫痫发作。该方法易于实施，能够更全面地评估戊四氮（PTZ）诱导的急性癫痫发作。其应用价值在PTZ点燃模型中尤为明显，其中重复给予低剂量PTZ会导致痉挛、肌阵挛及边缘性癫痫发作严重程度随时间发生改变。该方法有望提高癫痫发作及癫痫研究的可重复性。

引言

行为学表征是癫痫及痫性发作活动病理生理学研究中最常用的观测指标，也广泛用于新型抗癫痫药物的筛选1,2。过去50年发表的大多数研究均采用Ronald J. Racine建立的渐进评分系统，用于描述杏仁核和海马点燃过程中的行为性痫性发作严重程度3。Racine量表在大鼠3和猫4中均显示出行为表现与脑电图阵发性电活动之间存在强相关性。该量表将痫性发作的行为表现分为五个渐进阶段：“(i) 口面部运动，(ii) 头部点头样动作，(iii) 前肢阵挛，(iv) 直立，以及 (v) 直立伴跌倒”3。由于其操作简便、易于解读、评分快速且具有良好的可重复性，即使在当今，Racine量表在癫痫和痫性发作研究中的应用仍在持续扩大（图1）。

年度引用次数趋势图；显示1970年至2024年间的增长趋势；出版物分析。
图1：Racine于1972年发表的研究每年获得的引用次数。请注意过去50年来引用次数的持续增长。2024年11月27日通过Web of Science检索显示，该研究共被引用6,040次，另有91条记录缺少“出版年份”信息。请点击此处查看此图的放大版本。

随后，该分级标准被应用于其他癫痫和惊厥的动物模型，包括使用药物诱导惊厥的模型。早期关于红藻氨酸诱导的惊厥5和癫痫持续状态（SE）6，以及局部7和全身性匹罗卡品诱导的癫痫持续状态（SE）8的研究，均采用Racine分级标准来量化诱发性和自发性惊厥。有趣的是，这些药物不仅诱发了如电刺激动物中所观察到的边缘系统惊厥（如Racine所述），还引发了一系列不同的行为表现，而这些行为在以往研究中描述较少或不够充分9。

研究人员在使用癫痫模型时，早期就已发现Racine量表在捕捉痫性发作行为多样性方面的局限性，尤其是在癫痫灶位于脑部非边缘系统区域的模型中。例如，Garcia-Cairasco是最早使用行为学工具评估听源性癫痫发作行为的研究者之一10，揭示了痫性发作行为的复杂性及其时间进程特征10,11。最近，Ivan Soltesz采用先进的视频深度分析和精细的时间编码方法，在电点燃大鼠模型中揭示了“隐匿的行为指纹”12。在这些研究基础上，本文提出了一种针对戊四氮诱导的小鼠急性癫痫发作的新型编码系统。

戊四氮（Pentylenetetrazole, PTZ）通过抑制GABA能神经传递13，导致神经元兴奋性升高以及神经元群体的同步激活14,15。在给予单次高剂量（40–80 mg/kg）全身性PTZ后，啮齿类动物表现出活动减少、非特异性胡须运动、全身痉挛和肌阵挛性抽动、口面部和前肢阵挛，以及完全发作的边缘系统癫痫16。与癫痫持续状态模型不同，PTZ引起的异常行为持续时间不超过1小时，并可自行缓解16,17,18。先前的研究者已提出针对大鼠17和小鼠18的Racine分级系统的修订版本。尽管这些研究试图更全面地反映发作期行为的多样性，但其新分级仅增加了一个或两个等级，分别对应“狂奔”和/或跳跃（6级，van Erum等18），以及导致呼吸停止的强直性伸展（7级，van Erum等18）。

本方案提出了一种量化和表征PTZ诱导的痫性发作行为的新方法，特别关注痉挛和肌阵挛。这些行为在全身性给予PTZ后最为常见，但在癫痫和惊厥研究中却常被忽视。因此，该方法通过提供识别痉挛和肌阵挛的具体标准，并在行为上将其与边缘性惊厥区分开来，填补了一项关键的方法学空白。结果表明，无论是单次还是重复给予PTZ，痉挛和肌阵挛均表现出独特的时间动态特征。该编码系统易于实施，可将异常活动的新参数整合到现有方法中，并为惊厥发生机制提供新的见解。最后，这一新策略有望在不同实验室之间实现痫性行为量化的标准化，提高研究的可重复性，并拓宽对惊厥机制的理解。

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方案

所有实验程序均经北里奥格兰德联邦大学当地伦理委员会批准（方案编号 043/2022，许可证编号 307.043/2022）。本方案使用 3 至 4 月龄的雄性 C57BL/6 小鼠，根据已建立的 PTZ 诱导方案，建议样本量为 6–10 只动物16。

1. 观察区域的准备

  1. 使用一个方形或圆形的实验区域，其表面积至少为 10 x 10 cm，墙高 30 cm。确保实验区域光照充足。如有必要，使用红外照明以保证图像采集的饱和度（图 2A）。
  2. 在实验区域上方安装至少一台摄像机，使其能够俯视整个区域底部以及至少 10 cm 高的侧壁（以便完整捕捉小鼠直立行为而不裁剪头部，图 2B）。
  3. 如需获取正面视角，可增设第二台摄像机对准实验区域。此时应确保实验区域的一侧墙壁为透明材质。
  4. 确保环境温度（21–24 °C）和湿度（50–70%）与动物饲养设施条件一致，使用温湿度计进行监测并根据需要调整。
  5. 铺设适量垫料以覆盖实验区域底部，并确保动物与背景之间具有足够对比度以便观察。在整个实验过程中提供自由获取的水和饲料颗粒。
  6. 建议在光周期开始时启动实验（例如上午 7:00 至 10:00）。实验室内应维持恒定光照（900–1,100 lux），采用 12 小时光照/12 小时黑暗循环，光照从早上 6:00 开始。使用照度计检测靠近录像区域的光照条件，确保视频录制质量均匀一致。
  7. 将摄像机连接至视频记录设备，以每秒至少 24 帧（fps）的速度进行视频采集。

2. PTZ 溶液的配制

注意：癫痫样行为（即痉挛）可在剂量从 40 mg/kg 开始时诱发。在 60 mg/kg 及更高剂量下可观察到边缘系统癫痫发作。在 80 mg/kg 或更高剂量时，常出现伴随呼吸停止及死亡的强直性癫痫发作。在点燃实验方案中，采用 40 mg/kg 的剂量。

不同小鼠品系的剂量可能有所不同。建议进行预实验，以确定最适合研究问题的PTZ剂量。

  1. 通过系统注射向小鼠给予每公斤体重10 mL的剂量。因此，将PTZ粉末溶解于去离子水中，配制成终浓度为4或6 mg/mL的溶液（分别用于40和60 mg/kg的剂量）。
    注意：为减少实验变异，应为整个实验批次配制单一的PTZ溶液。

PTZ 给药

  1. 在将动物放入实验区域之前，使用天平测量其体重。
  2. 根据每只动物的体重计算所需PTZ溶液的体积。
    注意：对于60 mg/kg的剂量和30 g的体重，需向动物注射0.3 mL浓度为6 mg/mL的PTZ溶液。
  3. 在注射PTZ前至少记录1小时的行为。
    注意：此适应期可减少因新环境引起的活动和焦虑，同时可用于获取基础活动水平。
  4. 通过腹腔注射（i.p.）或皮下注射（s.c.）给予PTZ15,16。进行皮下注射时，用一只手固定动物，轻轻捏住其肩胛骨之间的皮肤（图2C）。
  5. 使用连接26½ G针头的1 mL注射器，将针头平行于动物体轴方向插入皮下空间，并缓慢将溶液注入皮下。注射完成后，轻轻拔出针头，同时用手按住针头退出处的皮肤，以避免因腔内压力导致溶液溢出（图2C）。
    ​注意：注射速度不可过快，否则溶液快速积聚可能导致注射部位溢出或拔针时泄漏。
  6. 记录任何泄漏情况，因其会影响痫性行为的表现。可考虑立即追加注射50 µL相同PTZ溶液。
  7. 将动物重新放回实验区域，进行1小时的连续视频记录。
  8. 在PTZ注射后1小时（或更长时间）停止记录，并复制文件用于后续处理（视频追踪和行为编码）。

Mouse tracking setup in behavioral experiment; diagrams show maze, monitoring system, data analysis.
图2实验装置与注射操作步骤 (A使用四个透明的方形实验区域，上方中央设有俯视摄像机，用于记录给药PTZ前后动物的行为并追踪其位置。B) 使用上述装置获得的一个代表性视频的截图 A. (C皮下注射PTZ的示例。将针头插入动物肩胛骨之间的皮下间隙。D行为数据采集与分析方法的示意图，用于本研究。 请点击此处以查看此图的放大版本。

4. 动物福利

  1. 如果癫痫发作持续超过5分钟，应立即移除并实施安乐死，以防止细胞死亡和脑组织损伤，尤其是在重复注射实验方案中。
  2. 在整个实验期间，每天监测动物的体重。
  3. 监测动物的一般状况，包括摄食情况、运动能力、姿势、理毛行为以及疼痛或痛苦的迹象。
  4. 根据需要给予抗炎治疗（布洛芬，5 mg/kg）及镇痛管理。必要时提供补充食物或水。
  5. 若动物出现无法通过个体补充在2天内恢复的超过20%的体重减轻、表皮病变，或任何对药物治疗无反应的慢性疼痛或不适症状，应予以移除。
  6. 所有动物的安乐死操作须遵循国际和机构伦理指南进行。

5. 软件安装、配置与使用

  1. 本研究中所述分析需使用 MouseLabTrack19 和 Solomon Coder。请下载并按照安装流程操作（参见 补充文件 1 和 补充文件 2）。
    注意：MouseLabTrack 在 MATLAB 框架下运行，而 Solomon Coder 是适用于 Windows 操作系统的可执行程序。两款软件均为开源软件。
  2. 在 Windows 开始菜单 中点击 Solomon，或搜索 Solomon Coder 并打开该软件。
    1. 若已有配置文件（参见 补充文件 3），请前往 文件 | 加载配置，屏幕将加载预设参数。
    2. 若无配置文件，
      1. 在空白区域右键单击以创建新按钮，再右键单击新创建的按钮以打开 配置 界面。
      2. 在 按钮名称 字段中，将按钮重命名为所需行为的名称。
      3. 在 按钮显示颜色 字段中，选择一种颜色。
      4. 在 类别 字段中，将 默认 重命名为 行为（该名称将作为列名）。
      5. 在 快捷键 字段中，分配一个键盘按键用于在视频分析过程中标记行为（例如按键“1”）。
      6. （可选）若事件为瞬时事件，请勾选快捷键上方的复选框，表示按键按下并释放时仅记录一次事件；若未勾选，则行为将持续记录直至按键释放。
    3. 要打开视频，请前往 文件 | 打开视频。
    4. 点击 播放 以开始播放视频。
    5. 当观察到行为时，点击鼠标左键或按下指定的键盘按键进行标记。
    6. 若要将数据保存为逗号分隔值（.csv）文件，请前往 分析 | 另存输出为；若要保存 Solomon 编码表（.arch 文件），请前往 文件 | 保存编码表。
  3. 打开并加载 MouseLabTracker 的步骤如下：
    1. 启动 MATLAB，在控制台中输入 `main()`，然后按 回车。
    2. 点击打开按钮以加载视频。加载完成后，相邻屏幕将显示视频，背景为绿色，动物呈白色。
    3. 指定视频中需分析的时间区间。点击 开始 以设定分析起始点，点击 结束 以设定分析终止点。
      注意：若未设置时间区间，软件将分析整个视频。
    4. 要配置追踪参数，请进入 追踪设置 选项卡。
      1. 选择 深色物体 / 浅色背景，表示动物颜色比背景更深。
      2. 如需调整动物数量，请进入 对象 并将数量更改为 1。
      3. 如需调整检测参数，请修改 阈值参数设置，使半径值保持在 30 至 40 之间。
      4. 通过点击 颜色 并选择适当颜色来定义动物的颜色。
      5. 要定义实验区域，请点击 定义区域，然后依次选择区域的左上角和右下角。
    5. 点击 追踪 以开始追踪过程。等待进度条达到 100%。
    6. 追踪完成后，点击 保存结果 以保存分析输出文件。

6. 编码行为

  1. 首先，在小鼠被放入观察区域后重新出现在视频画面中时，标记PTZ给药时间。此时刻作为时间零点，用于所有其他行为（包括潜伏期计算）的时间参考。
  2. 在PTZ注射后数分钟内观察痉挛和肌阵挛（图3），随后可能出现边缘性癫痫发作。痉挛表现为短暂、瞬时且快速的轴向肌肉收缩，包括双侧耳部屈曲、背部肌肉收缩、尾巴竖起（Straub尾）以及罕见的惊跳反应（图3A）。将痉挛编码为离散事件，将其与单个视频帧关联，不记录持续时间。
    注意：量化痉挛表现中不同身体部位的多样性和组合方式（见代表性结果部分）。
  3. 编码肌阵挛时，观察持续时间超过200 ms的事件；其特征为涉及头部、颈部和前爪的突然而强烈的肌阵挛性抽动。可能伴随震颤和身体姿势丧失（图3B）。亚分类包括伴有震颤的肌阵挛，或伴有向前、向左或向右姿势丧失的肌阵挛。持续时间通常为1至2秒。由于持续时间较长，单次肌阵挛事件需在多个时间单位中进行编码。
  4. 编码边缘性癫痫发作时，观察类似于Racine描述的事件，并使用Racine量表进行编码。其通常以行为静止或凝视开始，随后出现嗅觉和味觉自动症、口面部运动、前肢和/或头部肌阵挛、直立（伴或不伴跌倒）、狂奔或跳跃，以及伴有呼吸暂停的强直性发作。使用改良的Racine量表18对持续时间超过10–15秒、且可与痉挛和肌阵挛区分的边缘性癫痫发作进行亚分类。
  5. 根据实验方案增加其他行为类别，以实现更全面的行为筛查。
  6. 在单一时间帧标记记录会话的结束时间（PTZ注射后1小时）。若动物在强直性发作后死亡，用结束标记标明死亡时间。
    ​注意：编码表可在编码过程中的任意时间点保存，并可根据需要在软件中重新打开，以继续编码或进行修改。

癫痫发作期间小鼠行为分析；图中显示痉挛、肌阵挛和边缘系统发作阶段。
图 3：PTZ 给药后观察到的发作期行为快照。（A）这是 PTZ 注射后观察到的早期痉挛的代表性示例。所有帧均显示（采样速率为 30 fps）。请注意，该痉挛持续时间少于 200 ms，并沿头尾方向传播。在此示例中，未出现明显的尾巴抬高现象。（B）与前倾相关的肌阵挛的代表性示例。在此示例中，肌阵挛持续超过 1 秒，期间出现多次尾部和前肢阵挛。（C）边缘系统发作的代表性示例。在 Racine 1 期之前，小鼠表现出持续的肢体肌阵挛，包括身体姿势丧失。该序列展示了传统 Racine 评分标准的全部五个阶段。在此情况下，小鼠的评分为 5 分。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 数据分析与可视化

  1. 通过从编码表中记录的时间减去PTZ注射时间，计算每种行为类别（例如，痉挛、肌阵挛、癫痫发作等）首次出现的潜伏期。
  2. 计算每次肌阵挛和癫痫发作事件的持续时间，然后将其相加，得到每个类别的总持续时间。
  3. 通过将事件总数除以记录时长，计算每种行为的发生率。
  4. 通过计算连续事件之间的时间差，确定每种行为的事件间间隔。
  5. 在适用情况下，根据每次记录会话中痫性行为的时间分布定义发作期。针对每个发作期计算上述参数。
    注意：癫痫发作结束后会进入发作后抑制期，标志着本方案中一个发作期的结束；痫性行为再次出现则标志新发作期的开始。
    注意：若无癫痫发作，应根据痉挛和肌阵挛的时间分布对记录会话进行分类。
  6. 对每组数据使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。
  7. 对于多组之间的参数检验，采用单因素方差分析（ANOVA）；对于配对数据，根据数据结构使用配对t检验或重复测量方差分析。
  8. 设定统计学显著性为p值< 0.05。此外，将低于0.0001的p值四舍五入并报告为<0.0001。

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结果

为了评估编码策略及其在记录PTZ诱导癫痫发作期间行为表现方面的能力，首先测试了三种剂量的PTZ，并观察其对C57BL/6小鼠的影响（分别为40、60和80 mg/kg，每组动物数N = 7、5和5）。在单次注射后，三种PTZ剂量下观察到的行为结果显示出明显的剂量依赖性差异。接受40 mg/kg PTZ处理的小鼠仅出现痉挛，但无边缘系统癫痫发作或肌阵挛。相比之下，接受60和80 mg/kg PTZ处理的小鼠则持续表现出痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作。接受40或60 mg/kg PTZ的小鼠死亡率为0%。然而，在80 mg/kg剂量下，死亡率高达80%，通常继发于强直性发作后的呼吸停止。基于这些结果，选择60 mg/kg剂量用于单次注射和每周注射，40 mg/kg用于每日注射。

接下来，对C57Bl/6小鼠（N = 15，60 mg/kg，皮下注射）给予单次PTZ注射，并在注射后1小时内分析其行为。PTZ给药可诱导一系列超出Racine分级所定义的边缘性癫痫发作的行为，包括痉挛和肌阵挛。这些行为可利用本文所介绍的编码系统进行便捷的表征分析（图3...

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讨论

本研究采用基于运动表征的行为分类方法，为分析癫痫发作动态提供了更全面的框架。该方法能够量化关键参数，包括痉挛、肌阵挛和边缘系统癫痫发作的潜伏期、持续时间和频率。每周注射PTZ的结果显示，反复暴露显著改变了边缘系统癫痫发作的时间特征和频率，首次痉挛和边缘系统癫痫发作的潜伏期明显缩短，同时边缘系统癫痫发作的持续时间延长。此外，每日注射较低剂量PTZ发现痉挛出现时间发生改变，表现为随时间推移，发作频率增加，事件间间隔和潜伏期缩短。

尽管在癫痫发作的起始、进展、终止和分类方面的研究已取得进展，但临床和实验性癫痫研究通常主要关注发作期（ictal periods），而忽视了发作前和发作后阶段。新兴证据表明，发作间期事件可显著影响发作期的网络动态20,21，这凸显了在癫痫研究中进行全面的、多阶段行为表征的必要性。

多年来，PTZ 已成为一种强效的促惊厥剂22，对新型抗癫痫药物...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分得到了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq，资助号 308110/2020-0 和 316441/2023-6）、南里奥格兰德联邦大学科研促进基金会（FAPERN，资助号 042/2022）以及高等级人才培养协调基金会（CAPES，资助号 #385/2019）和南里奥格兰德联邦大学科研处（Propesq-UFRN，资助号 PVP18039-2020）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液Fresenius Kabi Brasil Ltda74MK3168封闭式静脉用系统；注射用溶液，250 mL。
分析天平ShimadzuATY224最大称量：220 g，最小称量：10 mg，可读性：0.1 mg。序列号：1311070096
摄像头JortanJortan-8816AHD红外CCD摄像头，NTSC制式，2.0 MP分辨率，3.6 mm镜头，DC 12 V电源。
数字照度计MinipaMLM-1011用于测量以勒克斯（lux）为单位的光照强度。
皮下注射针头Descarpack353101规格26.5 G。
小鼠--雄性C57BL/6野生型小鼠，2至3月龄。
戊四氮Sigma-Aldrich (Merck)P6500-25G粉末状，中枢神经系统兴奋剂。购买量：25 g。储存条件：-25 °C。
软件：MouseLabTracker Giuliano Vilela-开源软件，参考文献：DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005。
网站：https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
软件：Solomon CoderAndrás Péter-开源软件，版本 v.19.08.02。
网站： https://solomon.andraspeter.com/
温湿度计HikariHK-T240用于测量温度和湿度。

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