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方法文章

产前暴露于Δ9-四氢大麻酚的临床前模型以评估其对神经发育结局的影响

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DOI：

10.3791/68119

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2025年2月28日

 ,  , 
1Departments of Pediatrics, University of New Mexico School of Medicine

本文内容

摘要

随着立法限制的变化，大麻素产品的可及性增加，因此建立研究这些暴露影响的模型变得至关重要，尤其是在妊娠期间。目前已开发出一种通过自愿摄入实现产前中等程度大麻素暴露的临床前模型，可支持更深入的研究。

摘要

随着美国越来越多的州将娱乐用大麻（大麻素）合法化，产前大麻素暴露（PCE）的发生频率正日益上升。妊娠期间使用大麻素制品已被发现与多种异常结局相关，但既往研究开展时，这些制品的效力约为当前产品的300%以下。鉴于大麻素使用率不断上升，了解PCE对胎儿神经发育以及后续婴儿和儿童发育可能产生的影响至关重要。既往研究表明，PCE会对子代的学习与记忆能力、行为技能、睡眠及注意力产生负面影响。本研究旨在通过在临床前模型中让妊娠动物自愿摄入大麻素制品中的精神活性成分——Δ9-四氢大麻酚（THC），以模拟PCE。本文详细阐述了在整个妊娠期实现中度PCE的操作流程。在该模型中，对照组摄入普通迷你巧克力/花生酱饼干，而PCE组则摄入含有THC的花生酱，并同时配以迷你巧克力饼干。该方法可为进一步研究PCE对发育结局的影响提供支持。

引言

随着产前使用大麻素类产品率的上升1，加之美国各地对大麻素类产品的合法化趋势日益扩大，亟需开展研究以更深入地了解其对胎儿发育的影响。Δ-9-四氢大麻酚（THC）是大麻素类产品中的精神活性成分，可轻易穿过胎盘屏障，并与内源性大麻素系统相互作用2,3。内源性大麻素系统在神经发育过程中发挥着关键作用，可能是导致发育异常的潜在通路。孕期使用大麻素类物质已被证实与出生体重降低4以及早产风险增加相关5,6。此外，还报道了其他发育异常，例如终生存在的社交行为缺陷和执行功能障碍7,8,9。

随着时间的推移，大麻素类物质的效价变化以及公众使用模式的改变，凸显了对产前暴露对胎儿发育潜在影响进行深入研究的必要性。妊娠期间使用大麻素类产品的现象日益增加，因为这些产品常被认为可缓解抑郁、压力、疼痛、睡眠障碍和恶心等症状10,11。Dickson 等人12开展了一项研究，调查了科罗拉多州400家大麻药房关于妊娠早期使用大麻产品的建议，发现约半数药房（50.5%）向孕妇推荐食用类大麻产品。人们通常认为食用类大麻产品可避免与吸烟相关的危害和健康风险13,14，这导致许多孕妇选择摄入食用类大麻产品。

食用物通过胃肠道递送大麻素，其中THC被吸收进入血液并被运输 通过 门静脉将物质输送至肝脏进行首过代谢。在肝脏中，酶将THC羟基化，生成11-羟基-Δ9-四氢大麻酚（11-OH-THC），这是一种强效的精神活性代谢产物，可轻易穿过血脑屏障。15尽管食用大麻的初始精神活性作用出现较慢（30–90 分钟），但所产生的“兴奋”持续时间更长，摄入后 2–4 小时达到峰值16,17大鼠中THC的药代动力学半衰期为1.3–7.3小时18,19.

鉴于妊娠期间四氢大麻酚（THC）的使用日益增多，而关于其对胎儿神经发育影响的数据却十分有限，因此建立了一种妊娠期自愿摄入THC的临床前模型。该模型更贴近于人类实际使用情况（通过口服缓解恶心），以进一步描述其对神经发育结局的影响。

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方案

本研究所述所有程序均经新墨西哥大学健康科学中心（UNM HSC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。所有实验均按照ARRIVE指南进行。Long-Evans（Blue Spruce，HsdBlu: LE）大鼠购自商业来源。所用雄性为经证实的成年种鼠，到达时为12周龄，开始繁殖方案时为15–16周龄。雌性大鼠到达时体重为125–150 g，年龄约为6–7周龄；在交配时年龄约为9–10周龄。必须确保所有待用雌鼠无既往妊娠史。动物到达后应至少给予一周时间以适应设施环境及新的饲养条件。本方案第一部分涉及妊娠前大麻素摄入，第二部分则聚焦于妊娠期间大麻素暴露。实验所用动物、试剂及设备的详细信息见于 材料表实验设计详见于 图1.

1. 孕前大麻素暴露

  1. 饲养与维护
    1. 将动物单只饲养于标准大鼠静态微隔离笼中，垫有垫料，温度保持在22 °C，采用12小时颠倒光照/黑暗循环（每日21:00至09:00光照）。
    2. 提供辐照食品的获取途径（参见 材料表）和自来水 随意摄取 在整个研究过程中。
  2. 材料与化学试剂准备
    1. 获取所有必需的材料和化学品（如清单中所列） 材料表).
    2. 将研究级THC保存在含有10 mg/mL或20 mg/mL溶于乙醇的THC的瓶中。
      注意：使用适当的个人防护装备（PPE），因为四氢大麻酚（THC）具有皮肤刺激性和吸入危险。应将THC存放于钢制柜中，因其被美国卫生与公共服务部和美国食品药品监督管理局列为一类管制物质。
  3. 基线测量
    1. 获取每只雌性大鼠的基线体重。
  4. THC 融合饼干的制备
    1. 每天14:00给药前30分钟制备饼干，以保持喂养时间一致。
    2. 将迷你巧克力饼干分开，在奶油中加入约半茶匙花生酱。
    3. 将所需剂量的THC（前2天为1.5 mg/kg，随后7天为3 mg/kg）与花生酱混合，再制作成饼干。
  5. 消耗评估
    1. 提供纯花生酱/迷你巧克力饼干，持续2至4天，直至大鼠稳定摄食。每日14:00移除笼中饮水，使用镊子将零食逐只喂给每只大鼠。
    2. 观察直至食物被完全消耗。如有必要，移除残留物。
      注意：以1.5 mg/kg剂量给予THC，持续2天，随后以3 mg/kg剂量给予7天。对于未立即摄食的大鼠，将食物置于笼内最长2小时。
    3. 仅继续使用表现出稳定食物摄入的大鼠。将摄入不稳定的大鼠从实验中剔除。
    4. 评估孕前持续2周的摄入情况。
  6. PCE后分组分配
    1. 将摄食量一致的大鼠随机分配至普通饼干（对照组）或含THC的饼干（PCE组）。
    2. 在交配前至少禁食饼干4天，以确保四氢大麻酚（THC）从其体内完全清除。

2. 妊娠期（产前）大麻素暴露

  1. 繁殖与妊娠确认
    1. 在将雌性大鼠与已验证的雄性繁殖鼠（雄鼠未接触过THC）共同饲养前，称量其体重以获得初始体重。
    2. 确保雌性大鼠在此期间不食用任何饼干。
    3. 通过观察阴道栓的存在来确认妊娠，通常在交配后24小时出现。
    4. 称量雌性大鼠体重后将其放回原笼中。此日定义为妊娠第（GD）1天。
  2. 妊娠期间THC给药
    1. 从GD 1开始，每天14:00给予普通饼干或含THC的饼干（3 mg/kg），持续整个妊娠期。
    2. 持续该处理方案，直至观察到母鼠出现筑巢行为准备分娩，此时停止THC暴露。
  3. 母体体重增长监测
    1. 每周称量母鼠体重两次，以评估母体体重增长。
      注：新获得的体重数据也用于计算每块饼干中应添加的THC剂量，并根据母鼠体重变化调整剂量。
  4. 停止THC暴露及分娩记录
    1. 当母鼠在预期分娩时间前后出现筑巢行为时，停止THC暴露操作。
    2. 幼崽出生后，记录活产仔鼠数量。
    3. 将出生当天定为出生后第（P）0天。
  5. 幼崽断奶与饲养
    1. 在出生后第（P）23天对幼崽进行断奶。
    2. 根据性别将断奶后的幼崽与同窝仔鼠合笼饲养。
  6. 母鼠安乐死
    1. 幼崽断奶后，按照机构批准的方案对母鼠实施安乐死（当不再需要时）。

3. 术后步骤

  1. 子代动物的饲养与监测
    1. 确保所有子代动物均处于适当的饲养环境中，维持适宜的温度、光照和通风条件。
    2. 定期监测幼仔的健康状况和发育情况，例如异常体重或发育迟缓（从出生后第1天开始）。
  2. 基线评估
    1. 如需要，在对子代动物开展实验前，评估其基线指标，如体重、反射功能或其他相关发育参数。
  3. 实验分组
    1. 将幼仔随机分配至各实验组，以尽量减少检测中的偏倚。
    2. 每次实验每窝幼仔使用数量限制在1–2只，以降低潜在的窝别效应。

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结果

为了建立大麻素（THC）的自主摄入模型，研究人员尝试了多种食物，以确定哪些食物对大鼠具有适口性，能够被快速且持续地摄入。

最初尝试使用无糖草莓味明胶块（1 立方毫米大小），包括含 THC 和不含 THC 的两种类型。随后增加了草莓糖浆调味剂的用量，并测试了三种不同浓度的 THC（2 mg/kg/剂量、3 mg/kg/剂量和 5 mg/kg/剂量）。大鼠并未持续摄入明胶块，且在较高 THC 浓度下迅速停止摄入。已知大鼠会拒绝味道苦涩或酸性的食物，这引发了对该模型是否适用于自愿摄入研究的担忧。

在与机构兽医协商后，尝试了多种其他零食，包括从亚马逊购买的涂有花生酱或奶酪的饼干、含花生酱的迷你巧克力饼干、含花生酱的奶酪饼干，以及含奶酪的鱼形饼干。雌性大鼠 consistently 摄取含花生酱的迷你巧克力饼干，通常在提供零食后 10–30 分钟内吃完。随后将 THC 添加到含花生酱的迷你巧克力饼干中，对照组与 THC 暴露组中摄取每日零食的母鼠比例相似（分别为 67% vs. 62%；p = 0.14）。

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讨论

本文所述的产前大麻素暴露（PCE）范式涉及怀孕大鼠母体自愿摄入四氢大麻酚（THC）。这是首个在临床前模型中通过自愿摄入方式向怀孕大鼠母体施用THC的研究。两组大鼠母体均摄取相同的标准大鼠饲料，以尽量减少组间在营养和热量摄入方面的潜在差异。动物模型的优势在于能够精确控制PCE的时间和剂量，便于研究目的的实现。

通过评估孕前摄入情况，筛选出达到预期THC摄入水平的大鼠，以用于后续摄入方案的各个阶段。该方法确保所有雌性大鼠在怀孕前均已具备THC摄入经验，从而更准确地模拟人类行为5，即个体通常在怀孕前已使用THC。在此模型中，产前大麻素暴露（PCE）贯穿整个妊娠发育期，大致相当于人类妊娠的前两个孕期。研究表明，大麻素的使用在第一孕期最为普遍，在第二孕期减少，并在第三孕期进一步下降1。

内源性大麻素受体在胎儿中直到妊娠5-6周才开始表达21。在此时期之前暴露可能不会直接影响胎儿大脑发育，尽管仍有...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢美国国家药物滥用研究所（NIDA）药物供应项目慷慨提供THC。本研究得到新墨西哥大学儿科系研究经费分配委员会资助及新生儿科的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5L0D PicoLab 实验室啮齿动物饲料，经辐照处理Purina LabDiet5L0D
纤维素/纸质垫料 BioFresh Comfort BeddingBioFresh VetNAhttps://biofreshvet.com/products/
数字厨房秤EtekcityEK4150
雌性大鼠，125–150 g Inotiv14005F
Long-Evans 大鼠（Blue Spruce，HsdBlu: LE）Inotiv14016M
N10 啮齿动物塑料笼底AncareN10PLF
N10 啮齿动物金属丝笼盖AncareN10SS
窄头镊子Fine Science Tools (FST)11002-14
OREO 迷你巧克力夹心饼干，Go Paks 包装，12 杯，每杯 3.5 盎司AmazonB0198TUO7W
经证实的成年繁殖用雄性大鼠 Inotiv14016M
大鼠用静态聚砜微隔离笼（R20）：
研究级 THC （仅限持有 DEA 许可证者获取，属一级管制药物） NIDANA https://nida.nih.gov/research/research-data-measures-resources/nida-drug-supply-program
SKIPPY 顺滑花生酱AmazonB0C75KZ28C
THC 消耗用品：

参考文献

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