一种用于大鼠针灸治疗的新固定方法

摘要

本文介绍一种新的大鼠固定方法，该方法有助于对大鼠背部进行针灸和艾灸操作。

摘要

研究人员在进行与针灸相关的动物实验时，常常面临动物难以控制的问题。目前已有一些方法用于防止动物离开治疗区域，但这些固定方法的效果与人类接受治疗时的状态存在差异。因此，我们发明了一种新的固定方法，可在治疗过程中使大鼠保持俯卧、安静且清醒的状态。

该设备由一个多孔塑料固定平台、一块方形棉布以及若干用于固定大鼠的束缚带组成。首先，将束缚带穿入固定平台中。每根束缚带穿过同一行上的两个孔，两个孔之间间隔两个孔位。放置第一根束缚带后，以相同方式将另一根束缚带穿入平台，确保两根束缚带之间间隔四行。其次，抓住大鼠尾巴，将其引导至由两根束缚带形成的通道中，并用方形棉布覆盖大鼠头部。第三，收紧颈部的束缚带以固定头部和前肢；然后抓住大鼠后肢，并收紧另一根束缚带以固定腰部和后肢。

该方法无需麻醉。设备结构简单，易于操作。为评估其有效性和安全性，我们对60只大鼠实施了该操作。所有大鼠均顺利完成针灸治疗，未出现并发症。尽管有14只大鼠在操作过程中出现短暂挣扎，但未观察到任何不良反应。结果表明，该方法在使用上是有效且安全的。

引言

手术建模和体外干预均需要适当的动物固定方法，以确保动物处于最便于操作且相对舒适的位置。本文重点介绍针灸干预中的动物固定方法。针灸在治疗多种疾病方面具有显著疗效^1,2。针灸作用机制的研究已受到广泛关注，目前，针灸与艾灸是国内外研究的热点课题。针灸治疗的病理机制仍需进一步探索，除临床试验外，还需要基础研究的支持^3,4。在针灸与艾灸的基础研究中，动物固定是一项重要的技术步骤。

目前常用的固定方法包括束缚、麻醉、摇晃、高台固定等其他固定方法。以下概述了这些方法的优缺点。

实施麻醉固定法的第一步是对大鼠进行麻醉。使用该方法时，研究人员面临大鼠可能死亡的风险。此外，麻醉后也可在无约束状态下直接进行操作⁵。使用袜兔平台固定法时，研究人员将大鼠头部套入经修剪的袜子中，前肢从袜子上的孔洞伸出，并用橡皮筋将四肢固定在兔台上。该方法便于对四肢穴位进行定位。研究人员需根据针灸部位对袜子进行修剪，但操作过程较为复杂⁶。一些研究人员开发了一种艾灸固定装置，由固定座、固定夹和艾条 holder 三部分组成。该装置可实现多个穴位的同时艾灸，并维持相对恒定的温度。然而，该方法的固定状态与人类临床治疗情况存在显著差异⁷。用布包裹大鼠并用夹子悬挂，可显著降低束缚带来的影响。但悬挂用的布料需预先裁剪以暴露穴位，这使得治疗部位的暴露变得不便⁸。一些研究人员使用绑带、绳索以及带有自锁式尼龙搭扣的迷你背心，将大鼠固定在网状笼盖上。该装置制作成本低、实用性高且操作简便，但需要两人以上协作完成固定过程⁹。部分研究人员采用金属丝网制成的躯体固定圆筒，用固定夹夹住大鼠四肢，并用固定棒固定其颈部。该方法可实现牢固的束缚。使用此法时，研究人员可更方便地对大鼠进行操作，因其全身穴位均得以暴露。但问题在于圆筒尺寸可能与大鼠体型不匹配。此外，该方法施加的应激较强，大鼠更易发生窒息¹⁰。高台固定法利用了大鼠恐高的特性。研究人员将大鼠置于距地面50 cm的高台踏板上，大鼠可保持自然的俯卧姿势，无需额外束缚。该方法可用于对大鼠头部和背部进行针刺操作。由于该方法能真实模拟治疗环境，实验结果具有较高的参考价值。但由于大鼠在高处会产生恐惧，其精神状态会发生异常，因此该方法不适用于精神类疾病的研究，并可能影响实验结果¹¹。一些研究人员采用可调节的固定平台和绑带来固定大鼠，从而暴露较大的治疗区域。然而，仍难以完全复制临床治疗场景¹²。

目前迫切需要解决固定方法无法准确模拟临床治疗条件的问题。我们已尽一切努力还原人类临床治疗的实际条件。本文所述方法属于束缚法范畴，所用设备包括固定平台和固定带，并辅以棉布协助操作。该设备操作相对简便。与其他方法相比，该方法能更充分地暴露大鼠背部的穴位，从而提高治疗效率。

为测试该设备的可靠性，实验共使用60只大鼠。将全部60只大鼠分为两组，每组30只：电针组和温针组。治疗过程中大鼠保持安静，其活动对操作影响较小。在电针组中，22只大鼠在治疗过程中安静配合，未出现挣扎行为。共有8只大鼠在操作过程中出现挣扎，其中6只导致针具脱落。温针组中有24只大鼠在治疗期间保持安静。其余6只大鼠出现挣扎行为，但均未导致艾球脱落。这些出现挣扎的大鼠在覆盖安抚后也可恢复平静。最终，所有大鼠均顺利完成治疗。

方案

本工作得到中国国家自然科学基金（编号 82205287）的支持。本研究中使用的实验方案在实施实验前已通过北京中医药大学动物实验伦理与使用委员会（编号 BUCM-2024052704-2223）的审查和批准。所有演示的操作步骤必须经过机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

本研究中所用设备的详细信息见材料表。该方案可分为四个部分：实验准备、固定过程、处理操作以及设备拆卸。

1. 实验准备（图1）

1. 准备多孔塑料固定平台。该固定平台长500 mm，宽300 mm，高5 mm。其上的孔长7 mm，宽3.2 mm。相邻两孔之间的距离为7 mm。此设备用于固定大鼠。
2. 准备固定带。每条固定带长300 mm，宽4.8 mm。固定带呈锯齿状，末端带有扣环，插入后可锁定。
3. 准备好一块方形棉布。该棉布为30 cm × 30 cm的正方形，用于遮挡实验动物的视线。
4. 准备电针仪。使用该设备进行电针治疗操作。
5. 准备针灸针（直径0.25 mm，长度25 mm）。
6. 准备一副实验室级乳胶手套。这些手套是实验的基本防护措施。
7. 准备一副防咬割手套，用于在实验过程中保护研究人员免受大鼠咬伤。
8. 使用艾绒制作直径为5 mm的艾球，供后续艾灸治疗使用。
9. 为防止大鼠烫伤，裁剪若干边长为2 cm的正方形纸片。
10. 准备好无菌纱布，用于包裹大鼠尾巴，以确保电针治疗过程中的导电性。
11. 固定前准备：在接触大鼠前，应佩戴实验室级乳胶手套和防咬割手套，以防被大鼠咬伤。

图1：操作所需设备。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 固定过程

1. 将两条固定带穿过固定平台。每条固定带通过同一排中相隔两个孔的两个孔插入，两条固定带之间相隔四排。此间距与大鼠体径相匹配，可在治疗期间限制其侧向移动（图2）。根据大鼠体型和治疗部位需要，可适当调整间距。
2. 用一只手抓住大鼠尾巴，大鼠会本能地向前移动（图3A）。
3. 将大鼠置于由两条固定带形成的通道入口处，大鼠会自行钻入通道内（图3B）。
4. 用一块方形棉布覆盖大鼠头部，并用同一只手固定其颈部；另一只手抓住大鼠尾巴和后肢。该方法可确保大鼠保持稳定姿势（图3C）。
5. 用固定头部的手轻轻按压大鼠头颈部，另一只手将固定带插入扣具并拉紧。确保固定带位于头部和前肢的尾侧，以限制其头部活动（图3D、E）。
6. 用一只手握住大鼠尾巴，确保固定带位于后肢前方，然后拉紧扣具以限制腰部活动（图3F）。固定后的大鼠如图3G所示。
7. 对大鼠进行针灸操作时，该固定方法可确保治疗过程中的稳定性。若大鼠仍剧烈挣扎，可轻柔地用布覆盖其头部，遮蔽其全部视野并使其处于黑暗环境中，有助于安抚大鼠。
   1. 以DU20、BL17和BL23为例，选择合适的固定间距可更好暴露穴位：DU20位于头部正中，BL17位于两条固定带之间，BL23位于固定带尾侧，可收紧大鼠腰部。
   2. 将针旋转刺入穴位（图4A）。完成针灸治疗的大鼠如图4B、C所示。

图 2：固定平台与固定带的组装。 图中显示了插入固定带后的固定平台。每条固定带通过同一排中相隔两个孔的两个孔插入，且各固定带之间在垂直方向上相隔四排。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：大鼠固定过程。（A）抓住大鼠的尾巴。（B）让大鼠向前逃入通道中。（C）用棉布覆盖大鼠头部，按压其颈部并抓住其尾巴和后肢。（D、E）收紧背部的固定带。（F、G）收紧腰部的固定带。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：大鼠针灸操作。本针灸实验选取DU20、BL17和BL23作为针灸穴位。 （A）将针插入穴位。（B、C）图中显示大鼠完成治疗的情况。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 电针治疗

1. 完成针刺后连接电针仪。打开电针设备，按下连续波按钮以选择电刺激模式，并旋转旋钮将电流强度调节至 1 mA，频率调节至 2 Hz（图 5A）。
2. 以督脉20（DU20）、膀胱经17（BL17）和膀胱经23（BL23）为例，按图 5所示连接三对电极。具体而言，将同侧的BL17与BL23连接为一对电极（图 5B、C）。将用生理盐水浸湿的纱布包裹的电极尾端连接至头部的DU20（图 5D、E）。三对电极之间的电流方向保持一致。
3. 旋转定时旋钮，将治疗时间设定为 15 min。

图 5：大鼠电针操作。（A）设置参数为连续波，并调节电流强度和频率。（B、C）同侧配对 BL17 与 BL23 穴位。（D、E）用生理盐水浸湿的纱布包裹尾巴，并连接至 DU20 穴位。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 温针灸治疗

1. 若需进行温针灸治疗，请准备以下物品：艾绒、针灸针（0.25 mm × 25 mm，与之前所用相同）以及若干方形纸片。此外，在治疗开始前应预先准备好一些艾球（图1）。
2. 取一张方形纸片，小心地用针在纸片中心位置穿刺一个小孔（图6A），随后将针插入预定的穴位（图6B）。
   注：为便于说明，本研究选择的穴位为BL23。
3. 小心地将艾球放置于针上，然后将其点燃（图6C-E）。

图6：大鼠温针灸操作示意图。（A）取一张方形纸片，并用针在其中心穿孔。（B）将针插入穴位。（C）将艾绒球置于针上。（D、E）图中显示大鼠完成治疗的情况。请点击此处查看此图的放大版本。

5. 仪器设备的拆卸

1. 拆卸电针设备
   1. 电针治疗结束后，关闭电针仪，然后小心地将电极夹从针灸针上取下。最后，轻柔地将针灸针从治疗部位拔出。
2. 拆卸温针设备
   1. 温针治疗结束后，小心清除艾球残留的灰烬，并将其浸入水中妥善处理。随后轻柔拔出针具，并去除附着的纸片。
3. 拆卸固定装置
   1. 用一块方形棉布覆盖大鼠头部，同时放松固定带。先松开固定大鼠腰部的束缚带，然后用一只手牢固地抓住大鼠的后肢和髋部区域。
   2. 用另一只手松开固定在大鼠颈部的束缚带，然后抓住其尾巴，轻柔地将大鼠从固定装置中拉出。

结果

为了评估固定方法的有效性，我们对总共60只大鼠进行了试验，将其分为两组：电针组30只大鼠，温针组30只大鼠。治疗操作分别为电针和温针。

在将针插入穴位后，针灸师对每根针进行提插和捻转操作以达到得气。在操作过程中，观察到20只大鼠出现挣扎，其中7只将针甩脱。对于轻度挣扎的大鼠，通过安抚并结合棉布覆盖可较快恢复平静；而对于出现剧烈挣扎的大鼠，则暂停针灸操作5分钟，待其恢复平静后继续进行。

在电针过程中，30只大鼠中有22只保持安静并成功完成了治疗。其中，8只大鼠出现挣扎行为，导致6只大鼠的针脱落。出于伦理考虑，电针期间未固定大鼠尾巴。通过电极连接督脉20穴（DU20）和大鼠尾巴。电刺激引起轻微的身体反应，大鼠尾巴偶尔出现抖动。在30只大鼠中，有5只出现尾巴抖动，其中3只导致纱布脱落。在我们重新包扎大鼠尾巴上的纱布后，它们未再出现尾巴抖动现象。

在温针灸组中，30只大鼠中有24只在整个治疗过程中保持安静。尽管有6只大鼠出现挣扎，但针具和艾球均未脱落。实施覆盖与安抚方法后，所有大...

讨论

大鼠倾向于栖息在黑暗环境中。当有遮蔽时，它们会感到安全，并对刺激表现出较为平静的反应，应激水平较低。本文所述方法正是利用了大鼠的这些特性。该固定方法的优势可总结如下：（i）该方法可最大程度地减少实验动物所经历的应激反应和疼痛，符合动物伦理的3R原则，即减少（Reduction）、优化（Refinement）和替代（Replacement）¹³。（ii）遮蔽装置可降低大鼠的应激反应，确保固定牢固，有效防止大鼠咬伤操作人员。（iii）该方法充分暴露大鼠的头部和背部，使针灸操作更加便利。较大的暴露面积使研究人员能够同时在多个部位进行操作。（iv）通过使大鼠保持俯卧位，该方法更准确地模拟了人类针灸治疗的实际场景。固定后的大鼠在治疗过程中情绪稳定，从而保证了实验结果的高度可靠性。（v）该方法适用于不同穴位和体型，因为固定带的位置可调节。研究人员可根据大鼠的体型和治疗部位需要调整间距。具体数据见Table 2。（vi）该方法可由单名研究人员轻松完成，固定一只大鼠仅需三分钟或更短时间，从而减少了人力和时间消耗。

该...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针灸针	北京中研太和医疗器械有限公司	20222200133	针灸针的规格为直径 0.25 mm，长度 25 mm。
防咬手套	临沂市兰山区绿大洲劳动防护用品厂	H0315103941	用于在实验过程中保护研究人员免受大鼠咬伤。
电针仪	苏州医疗用品厂有限公司	20172200675	该设备用于实施电针治疗操作。
实验室级乳胶手套	中宏普林医疗用品有限公司	268237719221	这些手套是实验中最基本的防护措施。
艾绒	北京同仁堂兴安健康科技有限公司	152200000000613	艾绒用于制作直径为 5 mm 的艾炷，供后续艾灸治疗使用。
多孔塑料固定平台	滁州华信塑料工业有限公司	341124000005877	固定平台长 500 mm，宽 300 mm，高 5 mm。其上的孔洞长 7 mm，宽 3.2 mm，相邻两孔之间的距离为 7 mm。该设备用作固定大鼠的平台。
固定绑带	浙江利泰塑胶有限公司	331003000001553	每条固定绑带长 300 mm，宽 4.8 mm。绑带呈锯齿状，末端带有扣具，插入后可锁定。
方形棉布	无印良品（上海）有限公司	WYLP20241105_1	方形棉布尺寸为 30 cm ´ 30 cm，用于遮挡实验动物的视线。
方形纸片	得力集团有限公司	7752-1114	为防止大鼠烫伤，研究人员裁剪了一些规格为 2 cm ´ 2 cm 的方形纸片。
无菌纱布	江西中淦医疗器械有限公司	20172140084	无菌纱布用于包裹大鼠尾巴，以确保电针治疗过程中的导电性。