方法文章

鼻内给予十八烷基神经肽类似物在MPTP诱导的帕金森病小鼠模型中的神经保护作用

DOI：

10.3791/68122

⸱

2025年8月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Sciences of Tunis, LR18ES03, Laboratory of Neurophysiology Cellular Physiopathology and Biomolecule Valorization, University Tunis El Manar, 2Inserm U1239 NorDiC, Laboratory of Neuroendocrine, Endocrine and Germinal Differentiation and Communication, PRIMACEN, Univ Rouen Normandie, 3Confocal Microscopy Unit, Faculty of Medicine of Tunis, University Tunis El Manar

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鼻内给药可将生物活性分子直接递送至大脑，为脑室内给药方法提供了一种非侵入性的替代方案。本研究证明，在帕金森病小鼠模型中，鼻内给予环状OP类似物cyclo(1-8)OP可显著对抗MPTP诱导的纹状体氧化损伤和细胞凋亡，展现出强大的神经保护作用，提示其具有潜在治疗价值。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种神经退行性疾病，目前的治疗方法主要为对症治疗，缺乏根治效果。十八碳神经肽（Octadecaneuropeptide, ODN）是一种由星形胶质细胞特异性产生的肽类物质，可保护神经元免受氧化应激性细胞损伤和凋亡 体外 和 体内 帕金森病（PD）模型。然而，寡脱氧核苷酸（ODN）无法穿过血脑屏障（BBB），需通过脑室内注射才能进入大脑，这为其治疗应用带来了重大挑战。本研究探讨环孢素(1-8)OP是一种寡核苷酸类似物，通过鼻内（IN）给药途径递送以绕过血脑屏障 体内 帕金森病模型。实验选用雄性C57BL/6J小鼠，分为四组：假手术组、MPTP组（20 mg/kg体重，腹腔注射）、环孢素(1-8)OP-（10 ng/10 µL，脑内注射），以及 MPTP + 环己巴比妥(1-8)经OP处理的动物。在第0天（D0），动物每隔2小时接受一次腹腔注射，共注射三次，每次100 µL MPTP溶液（MPTP组和MPTP + 环己烯亚胺组）(1-8)经OP处理的小鼠）或生理盐水（假手术组和环磷酰胺(1-8)经OP处理的小鼠）。末次注射后1小时，给予10 µL环孢素鼻内滴注(1-8)OP（环磷酰胺）(1-8)OP- 和 MPTP + 环孢素(1-8)经鼻给予OP处理的小鼠）或生理盐水（假手术和MPTP处理的小鼠）。在第7天进行圆筒实验以评估运动功能。随后处死动物，取出纹状体并采用RT-qPCR分析caspase-3基因表达水平。组织样本还用于测定抗氧化酶活性、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）以及羰基化蛋白含量。单次经鼻给予10 ng环孢素(1-8)OP在最后一次MPTP给药后1小时给予，可防止给药后7天纹状体中的神经毒性。Cyclo(1-8)OP介导的神经保护作用与显著抑制MPTP诱导的纹状体中caspase-3表达相关。此外，环孢素(1-8)OP 恢复了抗氧化酶的活性，防止了纹状体中活性氧、脂质过氧化产物和蛋白质羰基化的积累。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是支配纹状体的黑质中多巴胺能神经元进行性丧失。这种神经元的丢失会导致显著的神经系统症状，包括严重的运动障碍，如肌肉僵直、运动不能和运动迟缓1。随着人口老龄化，帕金森病等神经退行性疾病的患病率持续上升，已成为重大的公共卫生挑战2。目前对帕金森病的治疗主要依赖多巴胺能类似物和脑内高频刺激疗法3,4。然而，这些疗法缺乏神经保护作用，无法阻止疾病进展，因此迫切需要开发新的策略以预防神经元丢失、促进神经再生并延缓疾病发展5。

十八碳酰胺肽（ODN）是一种来源于86个氨基酸前体——地西泮结合抑制剂（DBI）蛋白水解加工的肽段6，主要由哺乳动物中枢神经系统中的星形胶质细胞表达。ODN一级结构在进化上的高度保守性提示其具有重要的生物学功能。研究表明，ODN能够调控摄食、睡眠、攻击行为以及与焦虑相关的行为等多种关键生理功能7。除调节作用外，大量研究已证实ODN在多种与神经元变性相关的神经系统疾病中具有神经保护作用。例如，ODN在帕金森病（PD）模型中可保护多巴胺能神经元8，并在啮齿类动物卒中模型中减小梗死体积，促进功能恢复9。ODN的一个关键特性是其通过抗凋亡、抗炎、抗氧化和免疫调节活性，拮抗脑损伤过程中激活的多种有害过程10,11,12。此外，ODN还可能在卒中后的亚急性及恢复期发挥作用，促进神经发生和神经可塑性9。在将肽类或其类似物开发为治疗药物的潜在临床应用中，选择最佳给药途径至关重要，以防止其在血液中快速降解，并最大限度减少首过效应。在多种递送策略中，经鼻（IN）给药作为一种有前景的非侵入性替代方案脱颖而出，可使某些生物活性分子绕过血脑屏障（BBB）直接递送至脑组织13,14,15。该途径避免了侵入性的立体定位注射，并相较于外周器官显著提高了药物在脑内的生物分布。例如，垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）在经鼻滴注给药时，相较于静脉注射，表现出更强的脑内摄取效率和神经保护效果，在卒中模型中显著减小梗死体积并改善功能恢复9。

尽管经鼻给药（IN）是一种微创且高效的给药技术，可通过绕过血脑屏障（BBB）将治疗剂直接递送至大脑，但其有效性仍依赖于多个实际参数，包括给药剂量和总体积。在啮齿类动物中，为避免吸入或药液溢流至胃肠道，每侧鼻孔的推荐给药体积通常为10至25 µL16,17。鼻腔吸收效率还受到动物体型、鼻腔表面积、黏膜纤毛清除速率以及化合物特性（如脂溶性和分子量）的影响18,19。在实验方案设计过程中应充分考虑这些限制因素，以确保临床前模型中的可重复性和转化相关性。

一项体内研究显示，脑室内（ICV）注射低剂量的ODN具有显著的神经保护作用，尤其可防止MPTP处理小鼠中多巴胺能神经元的退化8。本研究旨在评估经鼻（IN）给予ODN类似物cyclo(1-8)OP的可行性和有效性，作为将神经保护肽类似物递送至大脑的非侵入性替代方法，特别是确定该给药途径是否能够防止MPTP处理小鼠模型（一种公认的帕金森病模型）中多巴胺能神经元的丢失并改善运动功能。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有实验均遵循美国兽医协会指南，并经巴斯德研究所医学伦理委员会批准（批准号：FST/LNFP/Pro 160220）。10周龄雄性C57BL/6J小鼠购自突尼斯巴斯德研究所。小鼠每笼3只，饲养于温度可控的房间（21 °C ± 1 °C），光照周期为12小时明/12小时暗，自由摄食饮水，适应环境1周。所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.

1. 治疗步骤

  1. 将动物分为四组：假手术组（n = 9）、MPTP组（n = 9）、cyclo(1-8)OP-（n = 9），以及 MPTP + 环孢素(1-8)经OP处理（n = 9）。
  2. 在治疗第1天（D0）以2小时为间隔，通过腹腔（IP）注射三次MPTP（20 mg/kg体重），每次溶于100 µL 0.9% NaCl中。末次MPTP注射后1小时，经鼻内（IN）给予10 µL环孢素(1-8)OP（10 ng）或生理盐水。
  3. 用生理盐水替代MPTP注射对照动物，可选择是否联合使用环己酰亚胺(1-8)OP（骨保护素）图1).
  4. 在第7天（D7），对小鼠进行筒状实验。随后通过腹腔注射戊巴比妥使小鼠深度麻醉，并按照机构批准的方案处死小鼠，取脑组织用于实时PCR和生物化学分析20 (图2).

2. 注射步骤

  1. 腹腔注射
    1. 小心固定小鼠体位，并在操作过程中使其头部保持不动。
    2. 将小鼠头部朝下放置，以使内脏器官在重力作用下自然移位，从而尽量减少与针头的接触。
    3. 以45度角将针头插入下腹部。
    4. 在同一侧进行三次100 µL的注射，每次注射间隔2小时，均在同一天内完成。
    5. 假手术组和cyclo(1-8)OP组注射0.9%生理盐水，MPTP组和MPTP + cyclo(1-8)OP组注射MPTP溶液（20 mg/kg体重）。
  2. 鼻内给药
    注意：所选剂量（10 ng）基于先前一项研究，该研究证实了脑室内注射ODN8具有神经保护作用。总给药体积为10 µL，每侧鼻孔滴入5 µL，该参数依据已建立的鼻内给药方案确定18,21。此体积远低于小鼠鼻腔的平均容量（0.032 cm3），可有效降低鼻孔阻塞或窒息风险，确保安全且高效的鼻腔吸收22。
    1. 牢固抓住小鼠颈背部皮肤，使其鼻部朝上，以便精确给药并尽量减少头部移动。
    2. 将动物倒置，使其腹面朝向天花板，颈部与地面平行。确保小鼠头部被牢固固定，防止垂直或水平方向移动。
    3. 将移液器尖端对准小鼠鼻孔，缓慢按压活塞以形成小液滴。
    4. 在每侧鼻孔附近各放置一个5 µL（总体积的一半）的液滴。
    5. 让小鼠自然吸入溶液。
    6. 重复上述步骤以确保给药一致，MPTP + cyclo(1-8)OP组和cyclo(1-8)OP组均给予10 µL cyclo(1-8)OP（10 ng）。
    7. 在整个操作过程中密切观察小鼠口腔。若发现液体出现在口腔中，可能提示鼻腔吸收不完全。这可能是由于液滴体积不当、给药过快或吸入不足，导致溶液积聚于鼻咽部并随后经口腔流出所致。
    8. 必要时可通过减小液滴体积，并在给予额外剂量前留出充足时间供其吸入，以降低该风险。
    9. 避免立即追加给药，以防总体积过大。
    10. 记录任何错位的给药情况，并仔细注明是否有液体排出。
    11. 在继续后续给药前，确保每只小鼠已完全吸入两个液滴（每侧鼻孔各一个）。
    12. 通过鼻内注射亚甲蓝溶液，确认嗅球靶向的准确性。
    13. 通过肉眼观察蓝色染料的沉积和扩散情况，评估给药准确性。

3. 圆筒实验

  1. 使用一个透明圆柱体，高 20 cm，直径 15 cm，将其置于桌子中央。
  2. 在圆柱体周围放置三块黑色纸板（距离 4–8 cm），以尽量减少环境光照的影响。圆柱体一侧保持开放，用于视频录制。
  3. 将摄像机置于距离圆柱体 40–60 cm 处，以完整捕捉其视野。
  4. 将小鼠放入圆柱体中，并立即开始录制，持续 5 分钟。
  5. 每只小鼠完成测试后，用水清洗圆柱体，喷洒 70% 乙醇以去除气味，擦干后再进行下一只小鼠的测试。
  6. 以半速回放录像，以便进行详细观察。
  7. 统计小鼠将前爪抬起接触圆柱体内壁的次数，以评估其探索行为23。

4. 生化实验用脑组织提取物的制备

  1. 使用戊巴比妥（40 mg/kg，腹腔注射）麻醉动物，然后按照机构批准的方案进行断头处死。
  2. 分离纹状体组织，每克组织加入2 mL TBS缓冲液，使用裂解缓冲液（1% Triton X-100、50 mM Tris-HCl、10 mM EDTA）进行匀浆。
  3. 在4 °C条件下，以14,000 × g离心15分钟。
  4. 使用双缩脲比色法试剂盒测定蛋白质浓度，并将分装样品储存在−20 °C，以备后续分析。

5. 细胞内活性氧生成的检测

  1. 在避光条件下，将脑组织提取物与 10 µM 的 DCFH2-DA 在 37 °C 孵育 30 分钟。
  2. 去除上清液，并用 PBS（0.1 M，pH 7.4，37 °C）洗涤两次。
  3. 使用酶标仪在激发波长 485 nm 和发射波长 538 nm 下测定荧光强度。

6. 氧化应激标志物的检测

  1. 丙二醛
    1. 将 20 µL 样品（约 50 µg 蛋白质）与 125 µL 20% TCA 和 50 µL 0.67% TBA 混合。
    2. 在 95 °C 下孵育 30 分钟，然后在 4 °C 下迅速冷却。
    3. 加入 800 µL 丁醇，涡旋混匀，于 4 °C 下以 3000 × g 离心 10 分钟。
    4. 在 532 nm 处测定吸光度，并使用消光系数（1.65 × 105 M-1cm-1）计算 MDA 水平。
  2. 蛋白质羰基测定
    1. 将 200 µL DNPH 与 50 µL 蛋白质样品混合，孵育 1 小时。
    2. 加入 250 µL 20% TCA，在冰上冷却 10 分钟。
    3. 于 4 °C 下以 3000 × g 离心 10 分钟，用 10% TCA 洗涤沉淀，再用乙醇:乙酸乙酯（v/v）洗涤。
    4. 将沉淀重悬于 250 µL 6 M 盐酸胍中，在 370 nm 处测定吸光度。
    5. 使用消光系数（22,000 M-1cm-1）计算 PCO 水平24。

7. 抗氧化酶活性的测定

  1. 超氧化物歧化酶活性测定
    1. 将样品（约 50 µg）与牛过氧化氢酶（0.4 U/L）、DL-肾上腺素（5 mg/mL）以及 Na2CO3/NaHCO3 缓冲液（62.5 mM，pH 10.2）共同孵育。
    2. 使用分光光度计在 480 nm 处每隔 60 秒测量一次肾上腺素氧化情况，持续 300 秒25。
  2. 过氧化氢酶活性测定
    1. 将样品与 90 mM H2O2 的 PBS 溶液混合。
    2. 在 3 分钟内每隔 30 秒监测一次 240 nm 处 H2O2 吸光度的下降。
    3. 利用消光系数（40 M-1cm-1）计算 CAT 活性。

8. 实时荧光定量PCR分析

  1. 使用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法从小鼠纹状体中提取总RNA。
  2. 用DNase I处理RNA以去除基因组DNA，并在260 nm处测定RNA浓度。
  3. 使用1 µg总RNA和一步法定量RT-PCR试剂盒进行定量反转录PCR。
  4. 采用SYBR Green PCR主混合液及引物（表1）扩增cDNA。
  5. 以GAPDH为内参，采用2−ΔΔCt法计算cDNA的相对表达水平26。

9. 统计分析

  1. 使用 GraphPad 软件进行统计分析。
  2. 单次比较采用 Student t 检验；对于多次比较，根据情况采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），并随后进行 Bonferroni 事后检验。在所有情况下，以 P 值小于或等于 0.05 为具有统计学显著性。

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结果

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MPTP 给药后，小鼠表现出典型的帕金森病症状，包括竖直且僵硬的斯特劳布尾、竖毛、活动减少以及脊柱弯曲等姿势异常，证实 MPTP 模型成功建立（图3）。使用亚甲蓝验证鼻内给药，小鼠在给药后10分钟处死, 在目标嗅球及脑区显示出有效的染料分布，支持了该方法的精确性（图4).

行为学评估显示，与对照组相比，MPTP处理的小鼠前爪抬起次数显著减少，反映出MPTP诱导的帕金森病特征性的运动功能缺陷。相比之下，经鼻给予环状(1-8)OP（10 ng/10 µL）可恢复运动功能，前爪抬起次数几乎恢复至对照组水平，提示环状(1-8)OP可能改善此类运动障碍（图5）。所给予剂量（10 ng溶于10 µL载体中）对应的环状(1-8)OP摩尔数为11.2 pmol。

已知...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

先前的研究表明，脑室内注射ODN可拮抗MPTP诱导的黑质纹状体多巴胺能神经元变性、氧化损伤及神经炎症8本研究评估了经鼻递送寡核苷酸类似物环状ODN的疗效(1-8)OP，用于预防MPTP诱导的运动障碍、氧化损伤和神经毒性 体内 使用C57BL/6J小鼠的帕金森病模型。

结果表明，MPTP处理的小鼠表现出典型的帕金森病症状27包括僵直且上翘的斯特劳布尾、竖毛、运动不能以及姿势异常（如脊柱弯曲），从而证实了在MPTP小鼠模型中成功诱导出帕金森样运动症状。为验证经鼻（IN）给药途径的有效性，采用亚甲蓝进行给药，结果显示染料在目标嗅球及脑组织中有效分布，支持该方法的准确性及其在向中枢神经系统递送治疗剂方面的潜在适用性。经鼻给药作为一种有前景且高效的脑部药物递送途径，尤其适用于需要快速起效或绕过血脑屏障（BBB）的情况。28,29该方法利用嗅觉...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文报道工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由神经生理学、细胞病理生理学与生物分子价值化实验室（LR18ES03）、NorDiC Inserm U1239、法国-突尼斯CMCU-Campus France/PHC Utique 24G0807/50283RD交流项目（资助Olfa Masmoudi-Kouki和Jérôme Leprince）、“地平线-玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动”计划（MSCA）PsyCoMed项目资助协议编号：101086247，以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议编号No 101034329提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2',7'-二氯荧光素 DCFH2-DASigma Aldrich064M4008V
Bio-Rad 分光光度计 Bio-Rad Laboratories, Philadelphia, PA, USA
丁醇
相机
牛肝过氧化氢酶SIGMA life scienceSLBZ7596
cyclo(1-8)OPINSERM U1239 NorDiC, Rouen
圆筒试验（带刻度烧杯）
DNPH 
EDTA plusThermo Scientific 11836714
70% 乙醇
乙醇-乙酸乙酯溶液
GraphPad 软件 La Jolla, CA, USA
盐酸胍GeneON5CCAE310
H2O2 PharmaghrebAEQ10101-D
2 ml 胰岛素注射器
L-肾上腺素 MP Biomedicals151065
亚甲蓝 Thermo Scientific Chemicals10455081
微量移液器 
微孔板读数仪 Synergy LX-AgilentSynergy LX-Agilent
MPTPMedChemExpressHY-15608
MPTP
Na2CO3/NaHCO3 缓冲液 
0.9% NaCl
一步法 Q-RT PCR 试剂盒 New England Biolabs
戊巴比妥 Sigma Aldrich
Synergy LX Nanodrop 2000 分光光度计 Biotek Agilent
硫代巴比妥酸（TBA, 0.67%） LOBA CHEMIE PVT.LTD626500025
吸头
三氯乙酸（TCA, 20%）Sisco Research laboratories SRL6740608
Tri-Reagent Sigma AldrichMFCD00213058
Tris-HClThermo Scientific J22638.K2
Triton X-100Thermo Scientific A16046.AE

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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