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在 体外调整基于活性肌动蛋白组装体的收缩性和变形模式：从二维活性网络到液晶滴

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

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1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

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Erratum Notice

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了从纯化蛋白质制备准二维 （2D） 纠缠、交联和液晶肌动蛋白组装体的方法。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于肌动蛋白细胞骨架的材料作为模型细胞材料被广泛研究，以阐明细胞力学的物理机制，例如形状调节和力产生，以及有趣的软聚合物材料。在这种方法中，我们详细介绍了使用纯化蛋白 在体外 创建基于肌动蛋白的组装体，用于荧光显微镜研究。我们在样品室中聚合长肌动蛋白丝，并使用聚合物耗尽剂将细丝挤成二维 （2D） 纠缠网络，以对抗用表面活性剂层钝化的表面。在三磷酸腺苷 （ATP） 存在下添加骨骼肌肌球蛋白 II 丝会诱导肌动蛋白网络的收缩。通过将肌动蛋白丝与交联剂捆绑在一起，我们调整了组装体的收缩性，从弯曲的材料过渡到在微尺度上滑动的材料。通过在加帽蛋白存在下共聚肌动蛋白来减少肌动蛋白丝的长度，我们将材料从 2D 网络调整为液晶。分散的短肌动蛋白丝的交联导致三维 （3D） 液晶液滴的形成。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

活性生物材料是各种生理过程中机械过程的基础，包括细胞内运输、细胞迁移、细胞形状调节和生物力产生 1,2,3。细胞骨架系统的体外组装体由在缓冲液中自组装的纯化和工程化蛋白质组分构建而成，是表征基本生物物理和生化过程的成熟工具 4,5,6,7。这些简化的模型系统允许在没有复杂细胞环境的情况下研究蛋白质，从而可以确定各个组分的作用。除了支持基础生物学研究外，体外细胞骨架组装体还被广泛开发为实验系统，用于研究液晶和活性或不平衡材料 8,9,10,11,12,13,14,15。

肌动蛋白是细胞骨架组装体中的关键生物聚合物，通过运动和聚合驱动的力调节细胞力学和动力学 3,16。荧光显微镜实验允许在运动驱动的收缩和交联蛋白的肌动蛋白捆绑等过程中可视化肌动蛋白网络结构变化。当三维肌动蛋白被嵌入的运动蛋白重塑时，对它们进行成像阐明了肌动蛋白交联剂在网络收缩和模式形成中的作用 12,17,18,19。然而，准二维肌动蛋白网络克服了成像方面的挑战，具有足够的时空分辨率来捕获网络结构变化。此外，高密度、准二维肌动蛋白结构更接近细胞组装体，例如细胞的致密肌动蛋白皮层20。产生准二维肌动蛋白结构的策略包括肌动蛋白成核蛋白附着在盖玻片上 21,22，肌动蛋白通过接头分子偶联到表面 10,23,24，在盖玻片表面形成附着在珠子上的致密肌动蛋白束25,26，以及用分子拥挤剂在盖玻片表面浓缩肌动蛋白丝10，27.

在这里，我们详细介绍了一种创建可重复的基于肌动蛋白的模型组装体的方法，以及如何对其进行修改以准备从有源网络到准 2D 液晶和向列液滴的变化。我们以前使用类似的方法研究了添加交联剂的短肌动蛋白丝的相分离液晶液滴的形成 11，肌球蛋白 II 产生的肌动蛋白网络变形模式（例如，丝状屈曲或相对滑动）与丝交联和连接的变化28，肌球蛋白 II 在具有不同间距和柔度的肌动蛋白束上产生的力的差异29， 和肌球蛋白 II 转运30。使用交联蛋白和肌动蛋白加帽蛋白可以系统地改变肌动蛋白丝的长度和组装结构。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：蛋白质和标记：出于本协议的目的，假设研究人员从纯化的蛋白质储备开始，当适合荧光显微镜研究时，这些蛋白质被荧光标记。这些蛋白质可以在实验室31、32、33、34、35、36、37 中购买或纯化并进行荧光标记。在该方案中，使用已在液氮中冷冻并储存在 -80 °C 的蛋白质储备液。蛋白质通常可以通过类似的方法进行标记。该蛋白质可以作为纯化步骤标记，也可以从冷冻原液中标记。在进行标记之前，在冰上解冻冷冻蛋白质原液。以下是用马来酰亚胺官能化荧光团（改编自38）荧光标记骨骼肌肌球蛋白 II （肌球蛋白） 的方法。

1. 制备荧光标记的肌球蛋白

  1. 从 ~2 mL 浓度为 5-10 mg/mL 的肌球蛋白开始。
    注意：在该方案中，使用了使用已发表的方法35 从鸡肌肉中纯化的骨骼肌肌球蛋白 II。将肌球蛋白储存在肌球蛋白储存缓冲液（25 mM KPO4、0.6 M KCl、10 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）、1 mM 二硫苏糖醇 （DTT），pH 6.6）中，纯化后直接从冷冻原液中储存。始终保持肌球蛋白低温以防止运动活动丧失很重要。
  2. 将 DTT 添加到解冻的肌球蛋白溶液中，终浓度为 10 mM。使用 1 M DTT 储备溶液限制体积。
    注：DTT 还原肌球蛋白中半胱氨酸上的巯基，使它们准备好与马来酰亚胺反应进行标记。
  3. 为防止干扰标记反应，通过在 4 °C 下在 50 mM HEPES、500 mM KCl、1 mM EDTA（pH 7.6）中透析过夜来去除 DTT。
  4. 透析后，将肌球蛋白溶液在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 15 分钟以沉淀任何聚集体。收集上清液。
  5. 使用分光光度计测定上清液中肌球蛋白的浓度。使用骨骼肌肌球蛋白38 在 280 nm 处的消光系数 ~148,000 M -1cm -1 估计肌球蛋白浓度。该消光系数假设“单体”由一条重链、一条必需轻链和一条调节轻链组成。
  6. 通过将粉末状荧光基团重悬于干燥的二甲基亚砜 （DMSO） 中至浓度为 5 mM 荧光基团来制备用于标记反应的荧光基团。
    注意：任何带有马来酰亚胺反应性基团的荧光基团都应该有效。使用了 Alexa 647 马来酰亚胺。DMSO 具有吸湿性并会积聚水分。“干”DMSO 是指储存在环境中以防止水积聚的 DMSO。为确保溶剂是干燥的 DMSO，此步骤使用新开封的 DMSO 安瓿瓶。不要将 DMSO 溶液放在冰上。DMSO 的熔点为 19 °C，因此移液39 必须在室温下（或略高）才能移液。
    注意：DMSO 可以穿透手套，因此最好戴双层丁腈手套并注意防止溢出。
  7. 为了准备添加荧光团的肌球蛋白，请短暂地将肌球蛋白溶液从冰上取下，让它升温至室温 （RT）。
    注意：不要将肌球蛋白留在 RT 中的时间超过必要的时间。在荧光团悬浮在 DMSO 中后执行此步骤。
  8. 一旦肌球蛋白溶液接近 RT，就将荧光团溶液添加到肌球蛋白中并快速混合，使荧光团：肌球蛋白的摩尔比为 5：1。一旦肌球蛋白溶液与荧光团混合，就将其置于冰上。
  9. 在冰上避光孵育 1 小时，然后通过添加 DTT 至浓度为 1 mM 来终止反应。使用 1 M DTT 原液以尽量减少添加的体积。
  10. 去除未反应的荧光基团。请使用下面描述的两种方法之一：
    1. 选项 1：
      1. 通过将肌球蛋白缓慢稀释到 F 缓冲液（10 mM 咪唑、50 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM EGTA、4 mM ATP，pH 7.5）中聚合肌球蛋白。这大约是 10 倍稀释，具体取决于步骤 1.8 中添加的染料体积。
      2. 在冰上孵育 20 分钟。在 4 °C 的冷冻离心机中以 8,000 x g 旋转 10 分钟以沉淀。
      3. 弃去含有游离染料的上清液，并用肌球蛋白储存缓冲液（来自步骤 1）重悬/解聚肌球蛋白。要去除任何残留的染料，使用 10 kD 截止透析杯透析到 5 mM 2-[4-（2-磺酰乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸 （PIPES）、0.45 M KCl、pH 7.0（体积过量 >100 倍）中透析 3 次，每次 15 分钟。
    2. 选项 2：
      1. 使用脱盐柱将缓冲液置换成 5 mM PIPES，0.45 M KCl，pH 7.0，按照色谱柱制造商提供的标准方案。
  11. 通过使用分光光度计测量肌球蛋白和荧光团的浓度，使用 280 nm 处肌球蛋白的消光系数和制造商报告的荧光团来估计荧光团与蛋白质的比率。比率通常为 2-4。
    注意：标记的肌球蛋白现在可以在液氮中快速冷冻等分试样。将等分试样储存在 -80 °C 下进行长期储存。

2. 可选：去除非活性肌球蛋白的程序

注意：肌球蛋白可以在实验中直接从解冻的等分试样中使用，但肌球蛋白的一部分将处于非活性状态。以下程序描述了如何去除失活的肌球蛋白。这是一个可选步骤，但它对于可重复性至关重要。肌球蛋白等分试样在解冻后使用约 3 天，储存在 4 °C 或冰上。

  1. 聚合未标记的鬼笔环肽稳定的肌动蛋白：
    1. 混合 10 μL 10x F 缓冲液、1 μL 100 mM ATP 和 ddH2O，使最终体积（包括步骤 2.1.2 中的肌动蛋白）在微量离心管中为 100 μL。
    2. 加入肌动蛋白单体至终浓度为 20 μM 并加入移液器混合物。
    3. 为了稳定肌动蛋白丝，使用 100 μM 鬼笔环肽的甲醇和移液管混合物加入鬼笔环肽至终浓度为 6.7 μM。
      注意：鬼笔环肽是一种毒素40。避免溢出和污染。
    4. 在冰上孵育 20 分钟，让肌动蛋白聚合。聚合后，将肌动蛋白储存在 4 °C 以备将来旋转。
  2. 移液管将 10 μL 鬼笔环肽稳定的肌动蛋白、3 μL 10x F 缓冲液、0.3 μL 100 mM ATP、6 μL 2 M KCl 和 ddH2O 混合至最终体积为 30 μL（包括与下一步添加肌球蛋白相关的体积）在冰上的微量离心管中。
  3. 从制备的原液中加入二聚体标记的肌球蛋白至所需浓度，保持肌球蛋白与肌动蛋白的摩尔比为 ≤ 1：6。
  4. 将所得溶液以 100,000 x g 冷 （4 °C） 离心 30 分钟。失活的肌球蛋白将与肌动蛋白丝结合并保持结合。失活的肌球蛋白和肌动蛋白丝在离心过程中会形成颗粒。
  5. 去除上清液（含有活性肌球蛋白）并将其储存在4°C以用于实验。
  6. 使用相同的分光光度法估计肌球蛋白浓度，以测量标记后的肌球蛋白浓度。
    注：在上清液中残留的蛋白质和 ATP 浓度下，280 nm 吸光度峰被 260 nm ATP 吸光度峰掩盖，因此通过与荧光团相关的吸光度或相对荧光测量来测量浓度更准确。

3. 制备表面活性剂溶液

注：表面活性剂溶液也可以购买预混合并即用型。

  1. 从干净的玻璃样品瓶开始。用水和乙醇冲洗样品瓶，以去除油中的潜在污染物，油是表面活性剂的溶剂。使用带有聚四氟乙烯 （PTFE） 内衬瓶盖的硼硅酸盐玻璃样品瓶。
  2. 使用移液管吸头吸取 5-20 mg 含氟表面活性剂，并存放在玻璃瓶底部附近。使用亚毫克精度的天平按重量测量表面活性剂的量。
  3. 吸取适当体积的氟化油，制成 2 wt% 的溶液，然后关闭样品瓶。
    注意：油会挥发，因此在测量后立即关闭样品瓶。
  4. 低速涡旋混合。
    注意：该溶液现在可以在 4 °C 下储存数周。表面活性剂的年龄和质量会影响肌动蛋白的拥挤和外观。肌动蛋白出现斑点、粘附在表面或不拥挤到表面可能表明需要新的表面活性剂溶液。在氮气下储存可以延长保质期。

4. 准备样品室（三个选项）

注意：本节提供了构建三个标准样品室的程序，用于制备显微镜样品。以下两部分包括准备实际样品和钝化样品室以进行样品加载。

  1. 选项 1：流通池
    注：在许多实验室中，简单的流通池是制备显微镜样品的标准方法。对于该方案，它特别适用于包裹在乳液滴剂中的样品。使用本协议中描述的表面活性剂表面涂层可能很难实现大、平坦的视野，因此对于 2D 样品，选项 2 和 3 通常更具可重复性。通道几何形状也可能导致以后添加的成分混合不均匀，例如肌球蛋白。
    1. 将 2 条彼此平行的双面胶带沿显微镜载玻片的宽度放置，以形成流通池通道的边界。在两片胶带之间形成的通道应约为 2 mm 宽。
      注意：较小的通道有助于防止乳剂卡在通道的起始部分。为了形成良好的密封，请使用长度略大于载玻片宽度的胶带，并在构建流通池后进行修剪。
    2. 将盖玻片放在磁带通道上。确保盖玻片垂直于显微镜载玻片。为此，请使用 30 mm x 40 mm 的盖玻片，因为它在放置在载玻片上时会提供较小的悬垂。
    3. 为了形成良好的密封并消除胶带和盖玻片之间的气穴，请按下盖玻片与双面胶带接触的区域。
      注意：小心不要在按压边缘时弄坏盖玻片。用圆形物体（如带帽的记号笔的末端）摩擦该区域，可以很好地压下胶带。
    4. 使用剃须刀片修剪显微镜载玻片和盖玻片上多余的胶带，使唯一可见的胶带位于样品通道内。
      注意：请小心完成此步骤，因为在尝试取下胶带时很容易意外打破盖玻片。
  2. 选项 2：将圆筒放在未处理的盖玻片上
    注意：此选项适用于 2D 平面样品。便于在显微镜实验期间的不同时间添加组分。该样品室不应用于乳剂，乳剂是乳剂而不是沉淀物，使成像变得困难。
    1. 用水、乙醇和水冲洗盖玻片和玻璃克隆筒。风干。
    2. 使用一层薄薄的 5 分钟环氧树脂，将玻璃克隆圆筒粘附在盖玻片上。
      注意： 在环氧树脂干燥时，通过在圆柱体顶部放置一个干净的物体来对圆柱体施加力是有帮助的。一个小的培养皿盖或盖玻片盒可以很好地工作。
  3. 选项 3：硅烷涂层盖玻片上的圆筒
    注：此选项可重现地在腔室中心产生一个大的平面区域，并减少样品的体积流量。为了实现这一点，在盖玻片上创建了一个被亲水区域包围的疏水区域，这导致最终样品在钝化的受限区域上具有肌动蛋白网络，其中肌动蛋白锚定在腔室边缘的亲水区域。该样品室不应用于乳剂，乳剂在缓冲液中涂抹乳剂而不是沉淀物，使成像变得困难。
    1. 准备带有硅烷涂层的盖玻片，使其具有疏水性。
      1. 将干净的玻璃盖玻片装入不锈钢架中。如果需要，通过在洗涤剂或乙醇中超声处理来预清洁玻璃。
      2. 在玻璃染色皿中，将三甲氧基（辛基）硅烷稀释成 2% 的异丙醇溶液。
      3. 将盖玻片浸入溶液中 10 分钟。
      4. 冲洗时，用水替换溶液。提起并重新浸入盖玻片架六次。再重复该过程四次，中间换水。
      5. 用铝箔覆盖架子以保护盖玻片免受灰尘影响，并在 25-30 °C 下干燥。
    2. 将辛基硅烷处理的盖玻片放入玻璃培养皿或任何其他可放入紫外线 （UV） 臭氧清洁剂的开放式玻璃容器的底部。
    3. 使用镊子将 2 mm x 2 mm PTFE 方块（从片材上切下）放在盖玻片上，该盖玻片将用作后续 UV-臭氧处理的面罩。
    4. 用 UV-ozone 处理盖玻片 10 分钟。这个过程使玻璃在 PTFE 面罩未覆盖的暴露区域具有亲水性。
    5. 小心地取出培养皿，不要打扰盖玻片或 PTFE 方块。使用 5 分钟环氧树脂将玻璃克隆圆筒粘附到盖玻片上。确保圆筒环绕 PTFE 方块，环氧树脂干燥后可以用镊子将其取下。
      注意：PTFE 方块可以在未来的实验中重复使用。

5. 组装肌动蛋白网络

注：以下是 50 μL 样品的制备方法。对于圆柱形样品，较大的体积可以减少弯液面的影响并提高样品稳定性。

  1. 向微量离心管中加入 5 μL 10x F 缓冲液，使最终体积达到 50 μL 所需的 ddH2O，1 μL 25 体积%β-巯基乙醇，1 μL 225 mg/mL 葡萄糖，1 μL 葡萄糖氧化酶 （135 mg/mL） 和过氧化氢酶 （85,000 单位/mL） 的混合物，1 μL 25 mM ATP， 和 10 μL 2 wt% 15 厘泊甲基纤维素。移液管充分混合。
    注意：β 巯基乙醇是一种毒素。避免溢出和污染。样品中含有葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖和 β-巯基乙醇试剂，以形成除氧系统。通过在 4 °C 下搅拌制备甲基纤维素储备液，并且可以在 4 °C 下储存数周。甲基纤维素可从溶液中沉淀出来，如果有明显的沉淀或肌动蛋白拥挤不良，则应重新制备。
  2. 可选：添加交联蛋白（每 1 个肌动蛋白单体 0.1-1 个交联蛋白）。移液管混合物。
    注：也可以在肌动蛋白聚合后添加交联蛋白，并在添加肌球蛋白之前结合 10-20 分钟。这对于足够高的交联剂浓度以束化肌动蛋白丝是优选的 - 这些束在表面活性剂-水界面处分布得更均匀且可重现。圆柱形样品室适合在肌动蛋白聚合后添加交联剂。
  3. 如果需要，添加鬼笔环肽（每 1-3 个肌动蛋白单体 1 个鬼笔环肽）。移液管混合物。
  4. 在单独的试管中，混合未标记和标记的肌动蛋白，这样当肌动蛋白混合物全部添加到 50 μL 样品中时，总浓度为 2.64 μM。每 9 个未标记的肌动蛋白单体使用 1 个标记的肌动蛋白单体的比例。移液管混合物。
    注：肌动蛋白单体将在添加到样品溶液中后开始聚合。分别添加肌动蛋白标记和未标记的肌动蛋白可导致肌动蛋白沿单丝的轮廓出现深色和荧光区域斑点。将肌动蛋白单体原液混合以确保肌动蛋白丝标记均匀。肌动蛋白的纯化和标记在31 中描述。
  5. 可选：要使用短肌动蛋白丝制作液晶或其他实验，请从步骤 5.4 开始向肌动蛋白混合物中添加加帽蛋白。加帽蛋白的确切量取决于蛋白质的活性部分和靶向肌动蛋白丝的长度，但通常，大约 1-10 mol% 的加帽蛋白（相对于肌动蛋白）足以产生用于液晶实验的短丝。加帽蛋白纯化在36 中描述。
  6. 要开始聚合肌动蛋白，请将肌动蛋白混合物添加到 F 缓冲液中并移液混合物中。
  7. 让肌动蛋白在 RT 下在微量离心管中聚合，然后在 10-30 分钟后将其添加到样品池中。
  8. 可选：如果制备圆筒样品，请将整个溶液吸入移液管吸头中，以便准备好在加载圆筒样品室的步骤 7.4 中移液。

6. 可选：准备乳液

注意：有时在乳液中制备这些样品很方便，因为乳液提供了一个狭窄的样品室。使用与 Chowdhury 等人类似的试剂制备乳液，这导致油连续相具有表面活性剂介导的水性乳液滴41。在存在本方案中使用的消耗剂（例如甲基纤维素）的情况下，肌动蛋白样品将挤到该乳液的水界面。对于该方案所基于的样品，在将肌动蛋白添加到乳液之前或之后聚合肌动蛋白之间看不到差异;然而，据报道，在某些封装实验中，聚合步骤是需要考虑的重要因素42。

  1. 将 3.5 μL 油表面活性剂添加到微量离心管中。此步骤使用透明、浅色或透明的微量离心管。
  2. 在不混合的情况下，将 5 μL 肌动蛋白溶液添加到油表面活性剂层的顶部。关闭微量离心管。
  3. 在握住微量离心管顶部的同时，轻弹管的底部边缘，最初产生带有可见乳液的泡沫。继续轻弹管子，直到泡沫在背光时没有明显的特征，表明存在微乳剂。
    注：在乳剂中制备样品时，应在制备肌动蛋白样品之前准备好流通池或其他样品室。玻璃圆柱形样品室不适用于乳液，因为它们会向空气界面呈乳霜状，而不是沉积物到盖玻片表面。

7. 加载样品室（圆筒室）

  1. 将 5 μL 油表面活性剂溶液移入玻璃圆筒腔室底部
    注：或者，可以通过使用支持的脂质双层 11,29,30 钝化表面来制备样品。
  2. 倾斜盖玻片并缓慢旋转，使盖玻片表面和下圆筒涂有表面活性剂溶液。
  3. 用移液管去除多余的油-表面活性剂溶液，以使油层尽可能薄，同时不要让挥发性的油完全蒸发。
  4. 立即将步骤 5.7 中的样品溶液添加到腔室中。
  5. 用一小块 PTFE 胶带覆盖腔室，以防止蒸发和流动。

8. 备用：加载样品室（流通池）

  1. 为了准备加载流通池，混合少量 5 分钟的环氧树脂。面积小于 0.5 cm2 的液滴通常就足够了。
  2. 要将样品放入流通池中，首先将 1-3 μL 油表面活性剂溶液移液到流通池的样品通道中，以形成一个小塞子来润湿通道。
  3. 立即将一定量的样品溶液或乳剂悬浮液缓慢移液到流通池的入口处，以填充通道。通常，对于约 2 mm 的通道，体积约为 8 μL。入口是添加油表面活性剂溶液的一侧。
    1. 如果样品体积超过流通池体积，请在通道的另一端放置无绒抹布或滤纸，使样品芯吸过流通池。
    2. 如果油表面活性剂溶液的弯液面已经消退，导致气隙，则首先倾斜流通池以去除入口处的气隙，然后再添加样品。
  4. 如有必要，添加额外的油-表面活性剂溶液，直到通道中不再可见空气，或将样品（特别是乳化液）进一步推入通道。
  5. 用 5 分钟环氧树脂密封通道的每一侧（在加载流通池之前混合）。

9. 成像并添加肌球蛋白

  1. 将样品安装在显微镜上，并使用 20 倍、40 倍、60 倍或 100 倍物镜开始肌动蛋白的延时成像，并浸油或浸水，以提供足够大的数值孔径进行高分辨率成像。如果在样品室中聚合，请聚合 ~30 分钟或直到不再可见的细丝延长或运动。
  2. 可选：添加交联剂。
  3. 通过下面的选项 1 或 2 添加肌球蛋白。
    1. 将肌球蛋白作为二聚体添加到样品顶部（无需混合，因为肌球蛋白二聚体会扩散）。
    2. 将肌球蛋白添加为预聚丝。移液管非常缓慢地混合大约总体积的一半，以避免干扰拥挤的肌动蛋白。
      注意：除了在盖玻片表面获得所需的细丝密度或尺寸外，肌球蛋白的理想方法可能因不同的肌动蛋白结构而异，需要通过实验确定。
  4. 开始延时成像。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过遵循这些方法中描述的一般策略，可以使用纯化蛋白在模型系统中形成广泛的肌动蛋白组装体，其中肌动蛋白在修饰组装结构的辅助蛋白存在下聚合成细丝（图 1）。当肌动蛋白在没有交联剂或加帽蛋白的情况下聚合成细丝时，它会形成缠结的细丝网络（图 1A）。向缠结网络中添加交联剂导致形成准 2D 网络或束网络（图 1B，C）。是否形成网络或束网络取决于添加到肌动蛋白网络中的交联剂的类型和数量（例如，α-肌动蛋白将在低浓度下形成网络，而在较高浓度下会形成束网络，如图所示）。也可以在肌动蛋白聚合时添加交联剂，尽管这可能导致形成 3D 而不是准 2D 网络。

为了创建液晶组装体，肌动蛋白在加帽蛋白存在下聚合，从而限制肌动蛋白丝的生长（图 1D，E）。使用图 1...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生产可重复的肌动蛋白组装体有许多考虑因素。生成可重现、可分析数据的最关键因素之一是样品室的盖玻片表面。体外肌动蛋白样品中的蛋白质，尤其是肌球蛋白，非常粘稠，会粘附在未经处理或处理不当的玻璃表面，导致样品无法使用（图 5A）。我们已经讨论了一种标准方法，即通过用油表面活性剂层钝化硅烷化盖玻片来制备表面以产生可重复的样品。但是，根据可用资源的不同，这种样品制备有几种变化。样品可以在未经 UV/臭氧处理的硅烷化盖玻片上制备，也可以在带有油表面活性剂层的普通玻璃盖玻片上制备（样品池选项 #2）。这些方法的制备更简单，但可能导致样品的油表面不均匀（图 5B），可能使找到样品的大而平坦的区域进行分析变得具有挑战性。所描述的 PTFE 面罩/紫外线/臭氧方法可以减少这种情况，从而产生一个半球形表面，中心有一个大的平面区域。去除多余的表面活性剂以尽量减少无意乳液的机会是很重要的（图 5C）。...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有要披露的冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Todd Thorenson、Mike Murrell、Jennifer Ross、Patrick McCall 以及 Gardel 和 Kovar 实验室（芝加哥大学）的其他成员在开发方法时进行的有益讨论。M.A.C. 和 SR 得到了克莱姆森大学工程计算和应用科学学院本科生研究机会补助金的部分支持，而 V. J. A. 得到了克莱姆森生物物理学 REU 在 NSF 奖 #2349368 下的支持，由 DBI 和 EPSCoR 计划资助。这项工作还部分得到了 NSF 奖 #OIA-1655740 下的美国国家科学基金会 EPSCoR 计划的支持，部分由克莱姆森创意探究 + 本科生研究计划支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.6 mL 微量离心管Fisher Scientific05-408-123
008-氟表面活性剂RAN Biotechnologies00115081361-6525
RAN Biotechnologies008-氟表面活性剂008-氟表面活性剂-2wtH-50G预混合溶液
2-巯基乙醇（&β;-巯基乙醇）Sigma Aldrich63689CAS 号：60-24-2
储备液：25 mM 在 MilliQ 水中，储存在 4 度;C
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙烷磺酸 （HEPES）Sigma AldrichH3375CAS 号：7365-45-9
5 分钟环氧树脂Devcon14250
肌动蛋白细胞骨架公司AKL99-A>99% 纯兔骨骼肌
（纯化替代
肌动蛋白（罗丹明标记）Cytoskeleton， Inc.AR05-A兔骨骼肌
（替代纯化）
腺苷 5&-prime;-三磷酸 （ATP）Sigma AldrichA6419CAS 号：34369-07-8
储备溶液：25 mM 在 MilliQ 水中，储存在 -20 度;C
保持冷冻以避免水解
氯化钙 （CaCl2）Sigma AldrichC5670CAS 号：10043-52-4
加帽蛋白（小鼠）用 HisTag
从 E.coli 中的过表达纯化 储备溶液：20 mM 在 -80 &g 的加帽蛋白缓冲液中;来自
牛肝的 C 过氧化氢酶Sigma AldrichC9322CAS 号：9001-05-2
储备溶液：85 ku/mL，与葡萄糖氧化酶等分储存在 -20&g;C
盖玻片Fisherbrand12544C硼硅酸盐，#1.5,24 mm x 40 mm
Fisherbrand not Fisher Finest
D-（+）-GlucoseSigma AldrichG8270CAS 编号：50-99-7
储备溶液：225 mg/mL 溶于 MilliQ 水，储存在 -20 度;C
二硫苏糖醇 （DTT）Sigma Aldrich3860-OPCAS 号：3483-12-3
储备液：1 M 在 MilliQ 水中，储存在 -20 度;C
双面胶带3M3136
乙基醇 200 证明PHARMCO111000200CAS 编号：64-17-5
200 证明
乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N，N，N′，N′-四乙酸 （EGTA）Sigma AldrichE3889CAS 编号：67-42-5
乙二胺四乙酸 （EDTA）Sigma AldrichE9884CAS号：60-00-4
葡萄糖氧化酶Sigma Aldrich345386CAS 号：9001-37-0
储备溶液：135 mg/mL 溶于 MilliQ 水中，与过氧化氢酶等分储存于 -20 &g;C
甘油Sigma Aldrich356352MCAS 号：56-81-5
咪唑Fisher 生物试剂 BP305-50CAS号：288-32-4
化镁（MgCl2）Fisher Bioreagents BP214CAS 号：7786-30-3、7791-18-6
甲基纤维素Sigma AldrichM0512CAS 号：9004-67-5
15 厘米泊
微镜载玻片电子显微镜科学/金印63710-05 3"x1"，1 毫米厚
MilliQ 水MilliporeCUFBI001超纯水
Novec-7500 工程流体3M7100134816替代预混合溶液
氯化钾 （KCl）Sigma AldrichP3911CAS 号：7447-40-7
磷酸钾 （KPO4）Sigma AldrichP3786CAS 号：7758-11-4
兔骨骼肌丙酮粉Pel-Freez Biologicals41995-1纯化肌动蛋白时使用（替代购买）
在肌动蛋白缓冲液 G 中储存约 30 mM，温度为 -80 &g;C
叠氮化钠Sigma Aldrich71289CAS 编号：26626-22-8
四甲基罗丹明-C6-马来酰亚胺AnaSpecAS-81445CAS 编号：174568-68-4 纯化肌动蛋白时使用（替代购买）
将约 30 mM 储存在肌动蛋白缓冲液 G 中，温度为 -80 &g;C。标记肌动蛋白时使用（替代购买）
Tris 盐酸 （Tris HCl）Sigma Aldrich648317CAS号：1185-53-1
声波浴默生布兰森 CPX2800H
HFE7500 中预混合溶液的替代品 ）氯显 普通超艾

References

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

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Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

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