本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。
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方法文章
调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
基于肌动蛋白细胞骨架的材料被广泛用作模型细胞材料，以阐明细胞力学中的物理机制，例如形态调控和力的产生，同时也作为一类有趣的软性聚合物材料而受到关注。本方法详细描述了基于肌动蛋白的组装体的构建过程 体外 使用纯化蛋白进行荧光显微镜研究。我们在样品腔室中聚合长链肌动蛋白丝，并利用聚合物排阻剂将肌动蛋白丝密集排列成二维（2D）缠结网络，该网络附着于经表面活性剂层钝化的表面。在存在腺苷三磷酸（ATP）的条件下加入骨骼肌肌球蛋白II丝，可诱导肌动蛋白网络收缩。通过使用交联剂将肌动蛋白丝束化，可调控组装体系的收缩性，使其从发生屈曲的材料转变为在微尺度上滑动的材料。通过在肌动蛋白共聚合过程中引入加帽蛋白以缩短肌动蛋白丝长度，可将材料性质从二维网络调控为液晶态。分散的短肌动蛋白丝经交联后可形成三维（3D）液晶液滴。
引言
活性生物材料在多种生理过程中起着关键作用，包括细胞内运输、细胞迁移、细胞形态调控以及生物力的产生1,2,3。体外构建的细胞骨架系统由纯化并经过工程改造的蛋白质组分在缓冲液中自组装而成，是表征基本生物物理和生化过程的成熟工具4,5,6,7。这些简化的模型系统使研究人员能够在排除细胞环境复杂性的条件下研究蛋白质，从而明确各个组分的功能。除了支持基础生物学研究外，体外细胞骨架组装系统也被广泛开发为实验平台，用于研究液晶态材料以及活性或非平衡态材料8,9,10,11,12,13
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方案
注意：蛋白质与标记：本实验方案假设研究人员起始使用的为纯化的蛋白质储备液，必要时已进行荧光标记，以适用于荧光显微镜检测。这些蛋白质可直接购买，或在实验室中自行纯化并进行荧光标记31,32,33,34,35,36,37。本方案中使用的蛋白质储备液经液氮速冻后于 -80 °C 保存。通常情况下，这些蛋白质可通过类似方法进行标记。标记步骤可在纯化过程中进行，也可对冻存的蛋白质储备液进行。进行标记前，需先将冻存的蛋白质储备液置于冰上解冻。以下为使用马来酰亚胺功能化荧光染料对骨骼肌肌球蛋白 II（myosin）进行荧光标记的方法（改编自38）。
1. 准备荧光标记的肌球蛋白
- 取约 2 mL 浓度为 5–10 mg/mL 的肌球蛋白。
注意：本实验方案中使用的是通过已发表方法....
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结果
通过采用本方法中所述的一般策略，在含有修饰组装结构的辅助蛋白存在下使肌动蛋白聚合形成丝状结构，可在模型系统中利用纯化蛋白形成多种多样的肌动蛋白组装体（图1）。当肌动蛋白在无交联蛋白或封端蛋白存在的情况下聚合为丝状结构时，会形成纠缠的丝状网络（图1A）。向纠缠的网络中添加交联蛋白后，可形成准二维网络或束状网络（图1B、C）。形成的是网络结构还是束状网络，取决于添加至肌动蛋白网络中的交联蛋白的类型和浓度（例如，α-肌动蛋白抑制蛋白在低浓度时形成网络，而在较高浓度时形成束状网络，如本图所示）。交联蛋白也可在肌动蛋白聚合过程中加入，但这样可能导致形成三维结构而非准二维网络。
为了形成液晶组装结构，肌动蛋白在加帽蛋白存在下进行聚合，该蛋白可限制肌动蛋白丝的生长（图1D,E）。聚合的丝状结构.......
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讨论
要获得可重复的肌动蛋白组装结果，有许多因素需要考虑。其中，对获得可重复且可分析的数据最为关键的因素之一是样品腔的盖玻片表面。样品腔中的蛋白质在 体外 肌动蛋白样品，尤其是肌球蛋白，具有极强的黏附性，会黏附于未经处理或处理不当的玻璃表面，导致样品无法使用（图 5A）。我们讨论了一种标准的表面处理方法，即通过在硅烷化盖玻片上添加油-表面活性剂层进行钝化，以获得可重复的样品。然而，该样品制备方法可根据可用资源进行多种调整。样品可制备在未经紫外/臭氧处理的硅烷化盖玻片上，或使用普通玻璃盖玻片并添加油-表面活性剂层（样品池选项#2）。这些方法制备过程更简便，但可能导致样品的油表面不均匀图5B），这可能导致难以找到样品中较大且平坦的区域进行分析。所述的聚四氟乙烯（PTFE）掩膜/紫外/臭氧法可减轻这一问题，从而获得一个中心具有较大平面区域的半球形表面。必须去除过量的表面活性剂，以尽量减少意外形成乳液的可能性图5C). 支持性脂双层通常会比此处所述的表面活.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
在开发本方法的过程中，我们感谢 Todd Thorenson、Mike Murrell、Jennifer Ross、Patrick McCall 以及芝加哥大学 Gardel 实验室和 Kovar 实验室的其他成员提供的有益讨论。M.A.C. 和 S.R. 的研究部分得到了克莱姆森大学工程与计算应用科学学院本科生研究机会资助项目的支持；V. J. A. 的研究得到了美国国家科学基金会（NSF）资助项目 #2349368（由 DBI 和 EPSCoR 项目资助）支持的克莱姆森大学生物物理学本科生研究体验项目（REU）的支持。本研究还部分得到了美国国家科学基金会 EPSCoR 项目资助 #OIA-1655740 以及克莱姆森大学创新探究与本科生研究项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.6 mL 微型离心管 | Fisher Scientific | 05-408-123 | |
| 008-氟化表面活性剂 | RAN Biotechnologies | 00115081361-6525 | 替代预混溶液 |
| 008-FluoroSurfactant 在 HFE7500 中 | RAN Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | 预混溶液 |
| 2-巯基乙醇（β-巯基乙醇) | Sigma Aldrich | 63689 | CAS编号：60-24-2 储存液：25 mM，溶于MilliQ水，4℃保存 °C |
| 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES） | Sigma Aldrich | H3375 | CAS编号：7365-45-9 |
| 5 分钟环氧树脂 | Devcon | 14250 | |
| 肌动蛋白 | Cytoskeleton, Inc. | AKL99-A | >99% 纯度的兔骨骼肌 （纯化的替代方法） |
| 肌动蛋白（罗丹明标记） | 细胞骨架公司 | AR05-A | 兔骨骼肌 （纯化的替代方法） |
| 三磷酸腺苷5′三磷酸腺苷（ATP） | Sigma Aldrich | A6419 | CAS编号：34369-07-8 储存液：25 mM，溶于MilliQ水，-20℃保存 °C 保持冷冻以避免水解 |
| 氯化钙（CaCl₂） | Sigma Aldrich | C5670 | CAS编号：10043-52-4 |
| 加帽蛋白（小鼠） | 过表达纯化而来 E.coli 带有 HisTag 储备液：20 mM，溶于加帽蛋白缓冲液，-80 ℃保存 °C | ||
| 牛肝过氧化氢酶 | Sigma Aldrich | C9322 | CAS编号：9001-05-2 储存液：85 ku/mL，与葡萄糖氧化酶分装后于 -20 保存°C |
| 盖玻片 | Fisherbrand | 12544C | 硼硅酸盐，#1.5，24 mm × 40 mm Fisherbrand，非 Fisher Finest |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma Aldrich | G8270 | CAS编号：50-99-7 储存液：225 mg/mL，溶于MilliQ水，-20℃保存 °C |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma Aldrich | 3860-OP | CAS编号：3483-12-3 储备液：1 M，溶于MilliQ水，-20℃保存 °C |
| 双面胶带 | 3M | 3136 | |
| 乙醇 200 Proof | PHARMCO | 111000200 | CAS编号：64-17-5 200 proof |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA） | Sigma Aldrich | E3889 | CAS 号：67-42-5 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma Aldrich | E9884 | CAS编号：60-00-4 |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma Aldrich | 345386 | CAS编号：9001-37-0 储存液：135 mg/mL，溶于MilliQ水，分装后与过氧化氢酶一同于-20℃保存 °C |
| 甘油 | Sigma Aldrich | 356352M | CAS 号：56-81-5 |
| 咪唑 | Fisher Bioreagents | BP305-50 | CAS编号：288-32-4 |
| 氯化镁（MgCl₂）2) | Fisher Bioreagents | BP214 | CAS编号：7786-30-3，7791-18-6 |
| 甲基纤维素 | Sigma Aldrich | M0512 | CAS编号：9004-67-5 15 厘泊 |
| 显微镜载玻片 普通 | Electron Microscopy Sciences/Gold Seal | 63710-05 | 3"x1"，1 mm 厚 |
| MilliQ 水 | Millipore | CUFBI001 | 超纯水 |
| Novec-7500 工程流体 | 3M | 7100134816 | 替代预混溶液 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma Aldrich | P3911 | CAS 号：7447-40-7 |
| 磷酸钾（KPO）4) | Sigma Aldrich | P3786 | CAS 号：7758-11-4 |
| 兔骨骼肌丙酮粉 | Pel-Freez Biologicals | 41995-1 | 用于肌动蛋白纯化时（替代购买） 在-80℃下，将约30 mM的样品储存于G缓冲液中 °C |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | 71289 | CAS编号：26626-22-8 |
| 四甲基罗丹明-C6-马来酰亚胺 | AnaSpec | AS-81445 | CAS编号：174568-68-4，用于肌动蛋白纯化（替代购买方式） 在-80℃下，将约30 mM的样品储存于G缓冲液中 °C. 标记肌动蛋白时使用（购买的替代方法） |
| Tris 盐酸（Tris HCl） | Sigma Aldrich | 648317 | CAS编号：1185-53-1 |
| 超声波清洗机 | Emerson Branson | CPX2800H |
参考文献
- Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
- Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
- Murrell, M., Oakes, P. ....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/68127
