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方法文章

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

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DOI：

10.3791/68127

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2025年7月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。

摘要

基于肌动蛋白细胞骨架的材料被广泛用作模型细胞材料，以阐明细胞力学中的物理机制，例如形态调控和力的产生，同时也作为一类有趣的软性聚合物材料而受到关注。本方法详细描述了基于肌动蛋白的组装体的构建过程 体外 使用纯化蛋白进行荧光显微镜研究。我们在样品腔室中聚合长链肌动蛋白丝，并利用聚合物排阻剂将肌动蛋白丝密集排列成二维（2D）缠结网络，该网络附着于经表面活性剂层钝化的表面。在存在腺苷三磷酸（ATP）的条件下加入骨骼肌肌球蛋白II丝，可诱导肌动蛋白网络收缩。通过使用交联剂将肌动蛋白丝束化，可调控组装体系的收缩性，使其从发生屈曲的材料转变为在微尺度上滑动的材料。通过在肌动蛋白共聚合过程中引入加帽蛋白以缩短肌动蛋白丝长度，可将材料性质从二维网络调控为液晶态。分散的短肌动蛋白丝经交联后可形成三维（3D）液晶液滴。

引言

活性生物材料在多种生理过程中起着关键作用，包括细胞内运输、细胞迁移、细胞形态调控以及生物力的产生1,2,3。体外构建的细胞骨架系统由纯化并经过工程改造的蛋白质组分在缓冲液中自组装而成，是表征基本生物物理和生化过程的成熟工具4,5,6,7。这些简化的模型系统使研究人员能够在排除细胞环境复杂性的条件下研究蛋白质，从而明确各个组分的功能。除了支持基础生物学研究外，体外细胞骨架组装系统也被广泛开发为实验平台，用于研究液晶态材料以及活性或非平衡态材料8,9,10,11,12,13,14,15。

肌动蛋白是一种关键的生物聚合物，通过分子马达和聚合驱动的力来调控细胞力学和动态过程3,16。荧光显微镜实验能够可视化肌动蛋白网络在分子马达驱动收缩以及交联蛋白介导的肌动蛋白束化等过程中的结构变化。对三维肌动蛋白网络在嵌入式分子马达重塑过程中的成像，揭示了肌动蛋白交联蛋白在网络收缩和模式形成中的作用12,17,18,19。然而，准二维肌动蛋白网络克服了在足够时空分辨率下成像以捕捉网络结构变化的技术挑战。此外，高密度的准二维肌动蛋白结构更接近于细胞内的组装结构，例如细胞中致密的肌动蛋白皮层20。构建准二维肌动蛋白结构的策略包括将肌动蛋白成核蛋白固定在盖玻片上21,22、通过连接分子将肌动蛋白偶联至表面10,23,24、在盖玻片表面形成附着于微珠的致密肌动蛋白束25,26，以及利用分子拥挤剂在盖玻片表面富集肌动蛋白丝10,27。

本文详细介绍了一种构建可重复的基于肌动蛋白的组装模型的方法，并阐述了如何对该方法进行修改，以制备从活性网络到准二维液晶及向列相液滴等多种变体结构。我们此前已采用类似方法研究了在加入交联蛋白后短肌动蛋白丝形成相分离液晶液滴的现象11，肌球蛋白II诱导的肌动蛋白网络形变模式（例如丝状体屈曲或相对滑动）随肌动蛋白丝交联程度和网络连通性的变化规律28，不同间距和顺应性条件下肌球蛋白II在肌动蛋白束上产生作用力的差异29，以及肌球蛋白II的运输行为30。利用交联蛋白和肌动蛋白封端蛋白，可系统性地调控肌动蛋白丝的长度及其组装结构。

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方案

注意：蛋白质与标记：本实验方案假设研究人员起始使用的为纯化的蛋白质储备液，必要时已进行荧光标记，以适用于荧光显微镜检测。这些蛋白质可直接购买，或在实验室中自行纯化并进行荧光标记31,32,33,34,35,36,37。本方案中使用的蛋白质储备液经液氮速冻后于 -80 °C 保存。通常情况下，这些蛋白质可通过类似方法进行标记。标记步骤可在纯化过程中进行，也可对冻存的蛋白质储备液进行。进行标记前，需先将冻存的蛋白质储备液置于冰上解冻。以下为使用马来酰亚胺功能化荧光染料对骨骼肌肌球蛋白 II（myosin）进行荧光标记的方法（改编自38）。

1. 准备荧光标记的肌球蛋白

  1. 取约 2 mL 浓度为 5–10 mg/mL 的肌球蛋白。
    注意：本实验方案中使用的是通过已发表方法35从鸡肌肉中纯化的骨骼肌肌球蛋白 II。肌球蛋白保存于肌球蛋白储存缓冲液（25 mM KPO4、0.6 M KCl、10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、1 mM 二硫苏糖醇（DTT），pH 6.6）中，可为纯化后直接使用，也可来自冷冻储备液。为防止运动活性丧失，务必始终将肌球蛋白保持在低温条件下。
  2. 向解冻的肌球蛋白溶液中加入 DTT，使其终浓度为 10 mM。使用 1 M DTT 储备液以尽量减少添加体积。
    注意：DTT 可还原肌球蛋白蛋白中半胱氨酸上的巯基，使其能够与马来酰亚胺反应以进行标记。
  3. 为避免干扰标记反应，将样品在 4 °C 条件下于 50 mM HEPES、500 mM KCl、1 mM EDTA（pH 7.6）缓冲液中透析过夜，以去除 DTT。
  4. 透析完成后，在 4 °C 下以 100,000 × g 离心 15 分钟，沉淀可能存在的聚集体，收集上清液。
  5. 使用分光光度计测定上清液中肌球蛋白的浓度。根据骨骼肌肌球蛋白在 280 nm 处的消光系数约为 148,000 M-1cm-1 来估算肌球蛋白浓度38。该消光系数假设一个“"单体"由一条重链、一条必需轻链和一条调节轻链组成。
  6. 通过将粉末状荧光染料重悬于干燥的二甲基亚砜（DMSO）中，配制成浓度为 5 mM 的荧光染料溶液，用于标记反应。
    注意：任何带有马来酰亚胺反应基团的荧光染料均可使用，本实验采用 Alexa 647 马来酰亚胺。DMSO 具有吸湿性，会吸收水分。“"干燥" DMSO 是指储存在防潮环境中的 DMSO。为确保溶剂干燥，本步骤使用新开封的 DMSO 安瓿瓶。切勿将 DMSO 溶液置于冰上，因其熔点为 19 °C，必须保持室温（或略高）才能进行移液操作39。
    警告：DMSO 可穿透手套，建议佩戴双层腈纶手套，并注意防止洒漏。
  7. 在向肌球蛋白中添加荧光染料前，短暂将其从冰上取出，使其升至室温（RT）。
    注意：肌球蛋白在室温下停留时间应尽可能短。此步骤应在荧光染料溶于 DMSO 后立即进行。
  8. 一旦肌球蛋白溶液接近室温，立即将荧光染料溶液加入肌球蛋白中并迅速混匀，使荧光染料与肌球蛋白的摩尔比为 5:1。混合完成后立即将肌球蛋白溶液放回冰上。
  9. 避光冰浴孵育 1 小时，然后通过加入 DTT 至终浓度 1 mM 终止反应。使用 1 M DTT 储备液以最小化添加体积。
  10. 去除未反应的荧光染料。可采用以下两种方法之一：
    1. 方法一：
      1. 通过缓慢将肌球蛋白稀释至 F 缓冲液（10 mM 咪唑、50 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM EGTA、4 mM ATP，pH 7.5）中使其聚合。 稀释倍数约为 10 倍，具体取决于步骤 1.8 中加入的染料体积。
      2. 冰上孵育 20 分钟，在 4 °C 条件下于冷藏离心机中以 8,000 × g 离心 10 分钟，收集沉淀。
      3. 弃去含有游离染料的上清液，用肌球蛋白储存缓冲液（步骤 1）重悬并解聚肌球蛋白。为彻底去除残留染料，使用截留分子量为 10 kD 的透析杯，在 5 mM 2-[4-(2-磺乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（PIPES）、0.45 M KCl、pH 7.0 缓冲液中透析三次，每次 15 分钟，缓冲液体积至少为样品体积的 100 倍以上>。
    2. 方法二：
      1. 按照柱制造商提供的标准操作流程，使用脱盐柱将缓冲液置换为 5 mM PIPES、0.45 M KCl、pH 7.0。
  11. 使用分光光度计分别测定肌球蛋白和荧光染料的浓度，根据制造商提供的肌球蛋白在 280 nm 处的消光系数及荧光染料的消光系数，估算荧光染料与蛋白的标记比。通常该比值为 2–4。
    注意：标记后的肌球蛋白现已可用于在液氮中进行快速冷冻分装。分装样品可于 -80 °C 长期保存。

2. 可选：去除无活性肌球蛋白的步骤

注意：肌球蛋白可直接使用解冻后的分装样品进行实验，但部分肌球蛋白将处于非活性状态。以下步骤描述了如何去除非活性肌球蛋白。此步骤为可选，但对实验的可重复性可能至关重要。肌球蛋白分装样品在解冻后约可使用3天，期间应保存在4 °C或冰上。

  1. 聚合未标记的鬼笔环肽稳定肌动蛋白：
    1. 在微量离心管中，混合 10 µL 的 10x F 缓冲液、1 µL 的 100 mM ATP 以及 ddH2O，使最终体积（包括步骤 2.1.2 中的肌动蛋白）达到 100 µL。
    2. 加入肌动蛋白单体，使其终浓度为 20 µM，并用移液器混匀。
    3. 为稳定肌动蛋白丝，使用甲醇中 100 µM 的鬼笔环肽储备液，加入鬼笔环肽至终浓度为 6.7 µM，并用移液器混匀。
      注意：鬼笔环肽为毒素40，避免洒出和污染。
    4. 冰上孵育 20 分钟，使肌动蛋白充分聚合。聚合完成后，将肌动蛋白溶液于 4 °C 保存，用于后续离心步骤。
  2. 在冰上微量离心管中，加入 10 µL 鬼笔环肽稳定的肌动蛋白、3 µL 10x F 缓冲液、0.3 µL 100 mM ATP、6 µL 2 M KCl 以及 ddH2O，总体积为 30 µL（包括下一步加入肌球蛋白所占体积），并用移液器混匀。
  3. 从已配制的储备液中加入二聚体标记的肌球蛋白至所需浓度，保持肌球蛋白与肌动蛋白的摩尔比 ≤ 1:6。
  4. 将所得溶液在低温（4 °C）下以 100,000 x g 离心 30 分钟。失活的肌球蛋白会结合到肌动蛋白丝上并保持结合状态，失活的肌球蛋白与肌动蛋白丝在离心过程中形成沉淀。
  5. 移除上清液（含有活性肌球蛋白），并在 4 °C 下保存，用于后续实验。
  6. 使用与标记后测定肌球蛋白浓度相同的分光光度法估算肌球蛋白浓度。
    注意：由于上清液中残留的蛋白质和 ATP 浓度会导致 280 nm 处的吸收峰被 260 nm 处 ATP 的吸收峰掩盖，因此通过荧光团相关的吸光度或相对荧光强度测定浓度更为准确。

3. 准备表面活性剂溶液

注意：表面活性剂溶液也可购买预混并可直接使用的成品。

  1. 使用洁净的玻璃小瓶。用去离子水和乙醇冲洗小瓶，以去除可能存在于油中的污染物，该油是表面活性剂的溶剂。使用带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫瓶盖的硼硅酸盐玻璃小瓶。
  2. 用移液器吸头取5–20 mg氟化表面活性剂，并将其置于玻璃小瓶底部附近。使用精度达亚毫克级的天平称量表面活性剂的质量。
  3. 加入适量氟化油，配制成2 wt%的溶液，然后盖紧小瓶。
    注意：油具有挥发性，因此在量取后应立即盖紧小瓶。
  4. 低速涡旋振荡以混匀。
    注意：该溶液现可在4 °C下保存数周。表面活性剂的存放时间和质量可能会影响肌动蛋白的聚集情况及其外观。若肌动蛋白呈现斑点状、黏附于表面或未能聚集到表面，可能表明需要配制新鲜的表面活性剂溶液。在氮气氛围下储存可延长其保存期限。

4. 准备样品室（三种选择）

注意：本节介绍用于制备显微镜样品的三种标准样品腔的构建方法。接下来的两节将介绍实际样品的制备以及样品腔的钝化处理，以用于样品加载。

  1. 选项1：流动池
    注意：简单的流动池是许多实验室中制备显微镜样品的标准方法。本方案特别适用于包裹在乳液滴中的样品。由于本方案中描述的表面活性剂表面涂层可能难以获得大而平坦的视野，因此对于二维样品，选项2和选项3通常具有更高的可重复性。此外，通道几何结构可能导致后续添加的组分（如肌球蛋白）混合不均。
    1. 将两段双面胶带平行地贴在载玻片的宽度方向上，以形成流动池通道的边界。两条胶带之间形成的通道宽度应约为 2 mm。
      注意：较小的通道有助于防止乳液在通道起始部分堵塞。为形成良好的密封，应使用略长于玻璃载玻片宽度的胶带，并在构建流动池后进行修剪。
    2. 将盖玻片覆盖在胶带形成的通道上。确保盖玻片与载玻片垂直。建议使用 30 mm × 40 mm 的盖玻片，因其放置在载玻片上时会留有少量边缘突出。
    3. 为形成良好密封并消除胶带与盖玻片之间的气泡，请按压盖玻片与双面胶带接触的区域。
      注意：按压边缘时需小心，避免压碎盖玻片。使用圆头物体（如带盖记号笔的末端）轻轻碾压该区域，可有效压实胶带。
    4. 使用剃刀片修剪载玻片和盖玻片上多余的胶带，使唯一可见的胶带部分仅限于样品通道内。
      注意：执行此步骤时需格外小心，因为在去除胶带时容易意外弄碎盖玻片。
  2. 选项2：置于未处理盖玻片上的圆柱形腔室
    注意：此选项适用于二维平面样品，便于在显微镜实验过程中不同时段添加组分。该样品腔室不适用于乳液样品，因为乳液在缓冲液中会上浮而非沉降，导致成像困难。
    1. 依次用水、乙醇和水冲洗盖玻片和玻璃克隆圆筒，然后自然晾干。
    2. 使用一层薄薄的5分钟环氧树脂，将玻璃克隆圆筒粘附到盖玻片上。
      注意：环氧树脂固化期间，在圆筒上方放置一个洁净物体施加压力有助于提高粘接效果。小型培养皿盖或盖玻片盒均可作为压重物使用。
  3. 选项3：置于硅烷涂层盖玻片上的圆柱形腔室
    注意：此方法可在腔室中心稳定形成大面积的平面区域，并减少样品的体相流动。为实现该效果，需在盖玻片上构建一个被亲水区域包围的疏水区域，最终形成一个肌动蛋白网络锚定于腔室边缘亲水区、而中心为钝化且受限区域的样品结构。该样品腔室不适用于乳液样品，因为乳液在缓冲液中会上浮而非沉降，导致成像困难。
    1. 制备经硅烷涂层处理的盖玻片，使其具有疏水性。
      1. 将洁净的玻璃盖玻片装入不锈钢架中。如需预清洁，可通过超声波在洗涤剂或乙醇中处理。
      2. 在玻璃染色皿中，将三甲氧基（辛基）硅烷用异丙醇稀释成2%的溶液。
      3. 将盖玻片浸入该溶液中10分钟。
      4. 冲洗时，用清水替换溶液。将盖玻片架提起并重新浸入水中六次，期间更换清水，重复此过程共五次。
      5. 用铝箔覆盖支架以防止灰尘污染，并在25–30 °C条件下干燥。
    2. 将经辛基硅烷处理的盖玻片放入玻璃培养皿底部或其他可放入紫外（UV）-臭氧清洗仪的敞口玻璃容器中。
    3. 使用镊子将一块2 mm × 2 mm的聚四氟乙烯（PTFE）方片（由板材裁剪而成）放置在盖玻片上，作为后续UV-臭氧处理的掩模。
    4. 对盖玻片进行10分钟的UV-臭氧处理。该过程会使未被PTFE掩模覆盖的区域变为亲水性。
    5. 小心取出培养皿，避免扰动盖玻片或PTFE方片。使用5分钟环氧树脂将玻璃克隆圆筒粘附到盖玻片上，确保圆筒包围PTFE方片；环氧树脂固化后可用镊子取出PTFE方片。
      注意：PTFE方片可在后续实验中重复使用。

5. 组装肌动蛋白网络

注意：以下步骤适用于制备 50 μL 样品。对于圆柱形样品，使用较大体积可减小弯月面效应并提高样品稳定性。

  1. 向一个微量离心管中加入 5 µL 的 10x F 缓冲液，加入适量的 ddH2O 使终体积达到 50 µL，再加入 1 µL 的 25 vol% 巯基乙醇、1 µL 的 225 mg/mL 葡萄糖、1 µL 的葡萄糖氧化酶（135 mg/mL）和过氧化氢酶（85,000 单位/mL）混合液、1 μL 的 25 mM ATP，以及 10 µL 的 2 wt% 15 厘泊甲基纤维素。用移液器充分混匀。
    注意：巯基乙醇为有毒物质，应避免泄漏和污染。试剂葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖和巯基乙醇用于在样品中构建除氧系统。甲基纤维素储备液需在 4 °C 下搅拌配制，可在 4 °C 下保存数周。甲基纤维素可能从溶液中析出，若出现可见沉淀或肌动蛋白拥挤效果不佳，应重新配制。
  2. 可选：加入交联蛋白（每 1 个肌动蛋白单体加入 0.1–1 个交联蛋白）。用移液器混匀。
    注意：交联蛋白也可在肌动蛋白聚合后加入，并在添加肌球蛋白前孵育 10–20 分钟。对于足以使肌动蛋白丝形成束状的较高浓度交联剂，此方法更优——此时束状结构在表面活性剂-水界面的分布更均匀且可重复性更好。圆柱形样品室适用于在肌动蛋白聚合后加入交联剂。
  3. 如需使用，可加入鬼笔环肽（每 1–3 个肌动蛋白单体加入 1 个鬼笔环肽）。用移液器混匀。
  4. 在另一管中，将未标记和标记的肌动蛋白混合，使得当全部肌动蛋白混合液加入 50 μL 样品中后，总浓度为 2.64 µM。使用每 9 个未标记肌动蛋白单体对应 1 个标记肌动蛋白单体的比例。用移液器混匀。
    注意：肌动蛋白单体在加入样品溶液后即开始聚合。若分别加入标记和未标记的肌动蛋白，可能导致单根肌动蛋白丝沿其轮廓出现明暗相间或荧光不均的斑点状结构。预先混合肌动蛋白储备液可确保肌动蛋白丝标记均匀。肌动蛋白的纯化与标记方法见文献31。
  5. 可选：若需制备液晶或其他使用短肌动蛋白丝的实验，可在第 5.4 步的肌动蛋白混合液中加入封端蛋白。封端蛋白的具体用量取决于蛋白的活性比例及目标肌动蛋白丝长度，但通常加入约 1–10 mol% 的封端蛋白（相对于肌动蛋白）即可满足液晶实验对短丝的需求。封端蛋白的纯化方法见文献36。
  6. 开始肌动蛋白聚合：将肌动蛋白混合液加入 F 缓冲液溶液中，并用移液器充分混匀。
  7. 将样品在微量离心管中室温静置 10–30 分钟，使肌动蛋白完成聚合，随后将其加入样品池中。
  8. 可选：若准备圆柱形样品，可将全部溶液吸入移液器吸头中，以便在后续加载圆柱形样品室的第 7.4 步中直接使用。

6. 可选：制备乳液

注意：有时在乳液中制备这些样品较为方便，因为乳液可提供受限的样品腔室。乳液的制备采用与Chowdhury等人相似的试剂，从而形成以油为连续相、由表面活性剂介导的含水乳滴的乳液体系41。当存在本方案中所使用的耗尽剂（如甲基纤维素）时，肌动蛋白样品将聚集于乳液的水相界面。对于本方案所依据的样品而言，在加入乳液前或后进行肌动蛋白聚合并无差异；然而，已有文献报道，在某些包封实验中，聚合步骤的顺序是需要考虑的重要因素42。

  1. 向微量离心管中加入3.5 μL油-表面活性剂混合物。此步骤应使用透明、浅色或无色的微量离心管。
  2. 不进行混合，将5 μL肌动蛋白溶液加至油-表面活性剂层的顶部。盖紧微量离心管。
  3. 轻轻握住微量离心管顶部， flick 管底边缘，最初形成带有可见乳状物的泡沫。继续 flick 管子，直至泡沫在背光下无明显特征，表明已形成微乳液。
    注意：在制备乳液样品时，应在制备肌动蛋白样品前预先准备好流动池或其他样品室。玻璃圆柱形样品室不适用于乳液，因为乳液会向气相上浮形成乳脂层 界面而非沉淀物附着于盖玻片表面。

7. 加载样品室（圆筒形样品室）

  1. 用移液器将 5 µL 油-表面活性剂溶液加入玻璃圆筒腔体底部
    注意：也可通过在表面构建支撑性脂双层来实现样品的钝化处理11,29,30。
  2. 倾斜盖玻片并缓慢旋转，使盖玻片表面和下部圆筒均被表面活性剂溶液覆盖。
  3. 用移液器除去多余的油-表面活性剂溶液，尽可能形成一层薄油膜，同时避免挥发性油完全蒸发。
  4. 立即向腔体中加入步骤 5.7 中的样品溶液。
  5. 用一小片聚四氟乙烯（PTFE）胶带覆盖腔体，以防止蒸发和液体流动。

8. 替代步骤：加载样品室（流动池）

  1. 为准备加载流动池，混合少量5分钟环氧树脂。取一滴面积小于0.5 cm²的环氧树脂2 通常已足够。
  2. 将样品置入流动池时，首先用移液器吸取1-3 μL油-表面活性剂溶液，加入流动池的样品通道中，形成一段润湿通道的小液塞。
  3. 立即用移液器将样品溶液或乳液悬浮液缓慢吸取至流动池入口，以填充通道。通常情况下，对于约2 mm的通道，所需体积约为8 μL。入口端为先前加入油-表面活性剂溶液的一侧。
    1. 如果样本体积超过流动池容量，可在通道另一端放置无绒擦拭纸或滤纸，通过毛细作用将样本液体引过流动池。
    2. 如果油-表面活性剂溶液的弯月面已后退，导致出现气隙，则在加入样品前，应先倾斜流式池以消除入口处的气隙。
  4. 如有必要，继续添加油-表面活性剂溶液，直至通道中不再可见气泡或达到所需体积 将样品（特别是乳状液）进一步推入通道中。
  5. 用5分钟快干环氧树脂（在加载流动池前立即混合）密封通道的每一侧。

9. 成像并添加肌球蛋白

  1. 将样品安装到显微镜上，并使用20x、40x、60x或100x油镜或水镜物镜进行延时成像，以获得足够大的数值孔径，实现高分辨率的肌动蛋白成像。若在样品腔内进行聚合，需让聚合持续约30分钟，或直至不再观察到丝状结构的延长或运动。
  2. 可选：加入交联剂。
  3. 通过以下选项1或选项2加入肌球蛋白。
    1. 以二聚体形式加入肌球蛋白，将其用移液器加至样品顶部（无需混匀，因肌球蛋白二聚体会自行扩散）。
    2. 以预先聚合的丝状形式加入肌球蛋白。用移液器缓慢加入总体积约一半的混合液，以避免扰动密集的肌动蛋白网络。
      注意：为在盖玻片表面获得理想的肌球蛋白丝密度或尺寸，最佳的肌球蛋白添加方法可能因不同的肌动蛋白结构而异，需通过实验确定。
  4. 开始延时成像。

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结果

通过采用本方法中所述的一般策略，在含有修饰组装结构的辅助蛋白存在下使肌动蛋白聚合形成丝状结构，可在模型系统中利用纯化蛋白形成多种多样的肌动蛋白组装体（图1）。当肌动蛋白在无交联蛋白或封端蛋白存在的情况下聚合为丝状结构时，会形成纠缠的丝状网络（图1A）。向纠缠的网络中添加交联蛋白后，可形成准二维网络或束状网络（图1B、C）。形成的是网络结构还是束状网络，取决于添加至肌动蛋白网络中的交联蛋白的类型和浓度（例如，α-肌动蛋白抑制蛋白在低浓度时形成网络，而在较高浓度时形成束状网络，如本图所示）。交联蛋白也可在肌动蛋白聚合过程中加入，但这样可能导致形成三维结构而非准二维网络。

为了形成液晶组装结构，肌动蛋白在加帽蛋白存在下进行聚合，该蛋白可限制肌动蛋白丝的生长（图1D,E）。聚合的丝状结构...

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讨论

要获得可重复的肌动蛋白组装结果，有许多因素需要考虑。其中，对获得可重复且可分析的数据最为关键的因素之一是样品腔的盖玻片表面。样品腔中的蛋白质在 体外 肌动蛋白样品，尤其是肌球蛋白，具有极强的黏附性，会黏附于未经处理或处理不当的玻璃表面，导致样品无法使用（图 5A）。我们讨论了一种标准的表面处理方法，即通过在硅烷化盖玻片上添加油-表面活性剂层进行钝化，以获得可重复的样品。然而，该样品制备方法可根据可用资源进行多种调整。样品可制备在未经紫外/臭氧处理的硅烷化盖玻片上，或使用普通玻璃盖玻片并添加油-表面活性剂层（样品池选项#2）。这些方法制备过程更简便，但可能导致样品的油表面不均匀图5B），这可能导致难以找到样品中较大且平坦的区域进行分析。所述的聚四氟乙烯（PTFE）掩膜/紫外/臭氧法可减轻这一问题，从而获得一个中心具有较大平面区域的半球形表面。必须去除过量的表面活性剂，以尽量减少意外形成乳液的可能性图5C). 支持性脂双层通常会比此处所述的表面活...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

在开发本方法的过程中，我们感谢 Todd Thorenson、Mike Murrell、Jennifer Ross、Patrick McCall 以及芝加哥大学 Gardel 实验室和 Kovar 实验室的其他成员提供的有益讨论。M.A.C. 和 S.R. 的研究部分得到了克莱姆森大学工程与计算应用科学学院本科生研究机会资助项目的支持；V. J. A. 的研究得到了美国国家科学基金会（NSF）资助项目 #2349368（由 DBI 和 EPSCoR 项目资助）支持的克莱姆森大学生物物理学本科生研究体验项目（REU）的支持。本研究还部分得到了美国国家科学基金会 EPSCoR 项目资助 #OIA-1655740 以及克莱姆森大学创新探究与本科生研究项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.6 mL 微型离心管Fisher Scientific05-408-123
008-氟化表面活性剂RAN Biotechnologies00115081361-6525替代预混溶液
008-FluoroSurfactant 在 HFE7500 中RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactant-2wtH-50G预混溶液
2-巯基乙醇（β-巯基乙醇)Sigma Aldrich63689CAS编号：60-24-2
储存液：25 mM，溶于MilliQ水，4℃保存 °C
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）Sigma AldrichH3375CAS编号：7365-45-9
5 分钟环氧树脂Devcon14250
肌动蛋白Cytoskeleton, Inc.AKL99-A>99% 纯度的兔骨骼肌
（纯化的替代方法）
肌动蛋白（罗丹明标记）细胞骨架公司AR05-A兔骨骼肌
（纯化的替代方法）
三磷酸腺苷5′三磷酸腺苷（ATP）Sigma AldrichA6419CAS编号：34369-07-8
储存液：25 mM，溶于MilliQ水，-20℃保存 °C
保持冷冻以避免水解
氯化钙（CaCl₂）Sigma AldrichC5670CAS编号：10043-52-4
加帽蛋白（小鼠）过表达纯化而来 E.coli 带有 HisTag
储备液：20 mM，溶于加帽蛋白缓冲液，-80 ℃保存 °C
牛肝过氧化氢酶Sigma AldrichC9322CAS编号：9001-05-2
储存液：85 ku/mL，与葡萄糖氧化酶分装后于 -20 保存°C
盖玻片Fisherbrand12544C硼硅酸盐，#1.5，24 mm × 40 mm
Fisherbrand，非 Fisher Finest
D-(+)-葡萄糖Sigma AldrichG8270CAS编号：50-99-7
储存液：225 mg/mL，溶于MilliQ水，-20℃保存 °C
二硫苏糖醇（DTT）Sigma Aldrich3860-OPCAS编号：3483-12-3
储备液：1 M，溶于MilliQ水，-20℃保存 °C
双面胶带3M3136
乙醇 200 ProofPHARMCO111000200CAS编号：64-17-5
200 proof
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA）Sigma AldrichE3889CAS 号：67-42-5
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma AldrichE9884CAS编号：60-00-4
葡萄糖氧化酶Sigma Aldrich345386CAS编号：9001-37-0
储存液：135 mg/mL，溶于MilliQ水，分装后与过氧化氢酶一同于-20℃保存 °C
甘油Sigma Aldrich356352MCAS 号：56-81-5
咪唑Fisher Bioreagents BP305-50CAS编号：288-32-4
氯化镁（MgCl₂）2)Fisher Bioreagents BP214CAS编号：7786-30-3，7791-18-6
甲基纤维素Sigma AldrichM0512CAS编号：9004-67-5
15 厘泊
显微镜载玻片 普通Electron Microscopy Sciences/Gold Seal63710-05 3"x1"，1 mm 厚
MilliQ 水MilliporeCUFBI001超纯水
Novec-7500 工程流体3M7100134816替代预混溶液
氯化钾（KCl）Sigma AldrichP3911CAS 号：7447-40-7
磷酸钾（KPO）4)Sigma AldrichP3786CAS 号：7758-11-4
兔骨骼肌丙酮粉Pel-Freez Biologicals41995-1用于肌动蛋白纯化时（替代购买）
在-80℃下，将约30 mM的样品储存于G缓冲液中 °C
叠氮化钠Sigma Aldrich71289CAS编号：26626-22-8
四甲基罗丹明-C6-马来酰亚胺AnaSpecAS-81445CAS编号：174568-68-4，用于肌动蛋白纯化（替代购买方式）
在-80℃下，将约30 mM的样品储存于G缓冲液中 °C. 标记肌动蛋白时使用（购买的替代方法）
Tris 盐酸（Tris HCl）Sigma Aldrich648317CAS编号：1185-53-1
超声波清洗机Emerson Branson CPX2800H

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

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调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴
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